天津地区番茄褪绿病毒的分子检测和鉴定

为明确2014年夏天在天津番茄种植区采集到疑似感染番茄褪绿病毒的番茄样品的侵染病原,利用To CV外壳蛋白和热激蛋白的特异引物进行反转录PCR(RT-PCR)检测,分别扩增得到特异核苷酸片段。序列分析表明,HSP70核苷酸序列与已登录的番茄褪绿病毒日本分离物Tochigi(AB513442)相似性为99.5%,CP氨基酸和核苷酸序列与已登录的番茄褪绿病毒日本分离物Tochigi(AB513443)相似性分别为99.2%和99.3%,表明天津地区的番茄受到To CV侵染,且天津与日本To CV分离物序列相似性最高。由于调查地区番茄黄化曲叶病毒发生普遍,针对To CV阳性样品利用TYLCV特异性引物进行了分子检测,扩增产物序列与TYLCV以色列株系分离物的相似性均在99.0%以上,表明2种病毒在田间发生复合侵染,该研究首次明确天津地区的番茄受到To CV侵染和To CV与TYLCV的复合侵染。     

山西运城番茄黄化曲叶病毒的初步鉴定

近年来,番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)对山西运城的番茄生产造成严重危害。利用烟粉虱传双生病毒简并引物PA/PB、PA/P2对病株进行检测,分别扩增出约500 bp和约1 200 bp的特异性片段,表明病株感染了双生病毒。进一步利用番茄黄化曲叶病毒特异性引物AF1/AR1进行扩增,对获得的特异性片段测序、序列比对及系统进化分析,结果表明,从样品中获得2个分离物,长度均为654 bp,与TYLCV分离物的相似性高达99%~100%,两分离物间的相似性为99.8%;系统进化分析表明,2个分离物与除TYLCVSeychelles之外的TYLCV聚在一个大的分支,与所有国内的及墨西哥的(TYLCV-Mexico)分离物聚在一个小的分支,与其他病毒分离物的系统进化关系较远。初步判断这2个分离物应属于番茄黄化曲叶病毒,且可能是由中国东南沿海地区和日本传入的。     

邯郸、保定番茄黄化曲叶病毒检测及其DNA-A全序列分析

2009年河北保定和邯郸地区番茄受到一种毁灭性的新病毒危害,对两地5个病样检测,结果均为番茄黄化曲叶病毒,但未检测到卫星DNAβ分子.对保定和邯郸分离物DNA-A全长进行克隆测序,两分离物DNA-A全长均为2 781 bp,这两个分离物DNA-A全长与其他地区番茄黄化曲叶病毒分离物同源性为98.6%～99.8%,发现其...     

寿光地区感病辣椒TYLCV的分子鉴定和病毒DNA-A序列分析

由于TYLCV的宿主广泛,本试验对山东寿光地区的感病毒病辣椒进行了TYLCV感染的分子鉴定,发现寿光地区的辣椒感染了TYLCV病毒,且感染率较高。通过对病毒基因组DNA-A序列的克隆和序列分析发现,寿光感病辣椒的TYLCV序列与临沂和德州的TYLCV亲缘关系最近,并对具体突变点进行了分析。进化树分析显示,克隆得到的辣椒病毒与墨西哥的TYLCV病毒同源性较高,而与危害辣椒较严重的TYLCSV的遗传距离较远。     

江苏大豆上分离的豇豆轻斑驳病毒基因组序列克隆及特征分析

为明确豇豆轻斑驳病毒江苏分离物的基因组结构特征,阐明其分类地位及进化特点,选择采自江苏的CpMMV大豆分离物作为研究对象,针对病毒基因组序列设计了4对特异性引物,以病样总RNA反转录后获得的cDNA为模板,通过分段法对其基因组序列片段进行了PCR扩增,扩增产物克隆至T载体经验证后进行序列测定,获得的序列片段经拼接组装得到病毒全基因组序列。序列分析结果显示,CpMMV江苏分离物基因组核苷酸序列全长8 194 bp,编码6个蛋白,5′端和3′端各含有一个非编码区(UTR),长度分别为72,117 nt;在编码的6个蛋白中,CP与其他分离物之间的同源性较高(96.5%～100.0%),相对保守;而RdRp(81.1%～98.2%)、TGB1(81.0%～97.0%)、TGB3(80.9%～95.6%)同源性相对较低,在不同分离物中表现较好的多样性;基于全基因组序列的系统进化分析结果显示,江苏分离物与已公开的其他CpMMV分离物同源性较高,共同聚类到一个大分支上,其中与中国安徽分离物同源性最高(98.2%),与海南分离物次之(96.0%),而与美国、巴西、印度、墨西哥、肯尼亚等国外分离物同源性...     

菜薹雄性不育相关基因的ISSR分子标记筛选

菜薹(Brassica campestris L.ssp.Chinensis var.utilis Tsenet Lee)属于十字花科芸薹属,原产中国,是华南地区重要的特产蔬菜之一.利用分子标记技术进行菜薹雄性不育相关基因的定位对菜蕞品质创新和选育新品种具有重要意义.目前尚未见有利用ISSR分子标记技术进行菜薹雄性不育分析的研究报道.利用ISSR技术对菜薹雄性不育系及其保持系的基因组DNA进行比较分析:结果显示100个ISSR引物中,只有引物UBC843的扩增结果在两系之间表现出了差异性,找到了不育系和保持系间的特异扩增片段.回收该特异扩增片段并进行克隆测序,测序结果表明该片段全长为462 bp.与白菜其它育性相关序列比较,同源性均低于50%.根据测序结果设计了一对特异引物,将其转化为更稳定的SCAR标记.经F2群体验证,ISSR引物扩增得到的特异片段很有可能来自核DNA.     

类猪圆环病毒 P1的感染及其分子特征

类猪圆环病毒P1是新发现的一种病原,能引起仔猪出现类似猪断奶后多系统衰竭综合征症状,是目前所知的具有最小基因组的病毒。为了解P1感染范围和基因组分子特征,采用PCR方法扩增P1全基因组,克隆测序后,应用生物信息学进行序列同源性比较及遗传进化分析。结果显示,P1已在我国猪场流行,分离株之间的核苷酸序列同源性为99．1％～100％,可分为2个亚分支;同时免疫组化结果也证实了P1在样品中的分布。     

番茄黄化卷叶病毒病抗病基因Ty-1的CAPS标记建立

本研究旨在筛选获得与番茄黄化卷叶病毒抗病基因Ty-1紧密连锁的分子标记,为番茄抗病育种提供技术支撑。根据与抗病基因Ty-1紧密连锁的RFLP标记序列设计特异引物,以抗病杂合体（Ty-1/ty-1）、抗病纯合体（Ty-1/Ty-1）和感病纯合体（ty-1/ty-1）材料提取的DNA为模板,进行PCR扩增,而后经不同的核酸内切酶酶切处理,筛选获得与Ty-1基因紧密连锁的CAPS标记。结果显示从4个标记中筛选获得了2个稳定可靠的CAPS标记,即TG97和Mi23。TG97标记在抗病杂合体产生398 bp、303 bp和95 bp 3个特异片段,抗病纯合体产生303 bp和95 bp 2个特异片段,感病纯合体产生398 bp一个特异片段。Mi23标记在抗病杂合体产生402 bp和354 bp 2个特异片段,抗病纯合体产生402 bp一个特异片段,感病纯合体产生354 bp一个特异片段。研究结果表明TG97和Mi23这2个CAPS标记均为共显性标记,可用于番茄抗病育种的辅助选择中。     

江苏水稻黑条矮缩病病毒的RT-PCR分析和快速检测

为了明确江苏新发生的矮缩病害为水稻黑条矮缩病,采用RT-PCR和序列测定方法对其病原进行了精确鉴定。根据水稻黑条矮缩病病毒基因组序列的信息,设计扩增RNA聚合酶基因、外壳蛋白基因和RNA沉默抑制子基因以及核心蛋白基因部分编码区的4对引物,提取感染水稻黑条矮缩病病毒的水稻植株总RNA并进行RT-PCR扩增,可以在感病植株中分别扩增出水稻黑条矮缩病病毒基因组特有的4个条带,测序结果表明,来源于江苏南京的分离物的4个基因部分编码片段与已登录的对应基因片段核苷酸序列同源性达99％以上,共发现7个碱基的突变。经生物信息学分析发现7个单碱基突变都是同义突变,氨基酸序列没有改变。根据以上结果确认该病病原为水稻黑条矮缩病病毒。利用该方法可以对水稻和其他寄主进行早期病毒检测。     

辣椒细胞质雄性不育基因的AFLP分析

本文采用AFLP(amplified fragment length polymorphism)技术对辣椒(Capsicum annuum L.)细胞质雄性不育系21A及其相应的保持系21B基因组DNA进行多态性比较,筛选了64对AFLP选择性引物PstⅠ-NNN+Mse Ⅰ-NNN组合,有60对引物组合均在两系间扩增出5 447条带,多态性位点为4个,其中在不育系材料中仅有2个多态性片段AGC/CGC378和ATC/GAG446,对特异片段进行克隆、测序,其序列全长分别为340 bp和408 bp,它们编码的氨基酸序列与烟草基因组线粒体DNA序列同源性达94%和96%.     

亚麻显性核不育相关基因的克隆及序列分析

亚麻显性雄性核不育基因对亚麻育种以及杂种优势的利用具有相当重要的作用,为更好地利用这一优良生物性状,很有必要对其相关基因进行标记、克隆和序列分析.通过使用252条10-mer的随机引物对遗传背景相似的兄妹杂交分离出的17对可育株和不育株亚麻进行RAPD分子标记,得到三条差异片段,通过回收、克隆及测序,然后用BLAST进...     

番茄黄化曲叶病(TYLCV)的研究进展

简述了番茄黄化曲叶病毒(tomato yellow leaf curl virus, TYLCV)的发病症状、病毒的鉴定和分类、发生与防治;总结了番茄黄化曲叶病主要发生在亚热带地区和热带地区,在中国的发展趋势是由南向北不断蔓延,其主要在番茄生产上造成严重的危害;依据番茄黄化曲叶病的发病条件、传播特点及国内外该病的研究现状;提出了以农业防治为基础,兼顾化学防治与生物防治的综合防治措施,并利用基因工程等分子生物学手段加快抗病育种的进程;分析表明加大抗病育种的力度,培育出稳定的抗病品种,能很好的控制和降低该病的危害。     

梅花鹿鹿茸软骨细胞的培养及X型胶原的克隆和序列分析

X型胶原是肥大软骨细胞的标志物，据GenBank 中收录的人、鼠、牛、猪X型胶原基因的序列，进行同源性分析，在同源性高的相对保守区域设计了1对特异性引物。建立梅花鹿鹿茸软骨细胞的分离培养方法，培养鹿茸软骨细胞。提取细胞的总RNA，以总RNA为模板，用RT-PCR方法克隆了梅花鹿的X型胶原基因序列为877的片段，此片段全部位于编码区，与已报道的牛的X型胶原基因的序列比较，同源性达到96%。共有35个碱基发生变异。DNAStar 软件分析表明，二者推导的氨基酸序列同源性为95.5%。     

非洲猪瘟病毒LNA引物PCR检测方法的建立及优化

为了建立一种便捷、快速且精准的非洲猪瘟病毒的检测方法,本研究根据GenBank中公布的ASFV p72基因序列,设计了一对特异性引物,并对引物中的适当碱基进行锁核酸修饰,通过优化退火温度、引物浓度,建立了非洲猪瘟病毒的锁核酸修饰引物PCR检测方法。结果表明,该方法具有良好的敏感性和特异性,检测灵敏度可以达到3×10¹ copies/uL,比常规引物PCR方法的灵敏度提高了100倍,比real-time PCR方法的灵敏度提高了10倍,对猪瘟病毒、猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病毒等病原基因组均无扩增,特异性良好。72份临床样品的检测结果与OIE推荐的qPCR方法检测结果一致,符合率为100%。本研究成功建立了非洲猪瘟病毒的LNA引物PCR检测方法,方法的特异性强、敏感性高,操作简单,为非洲猪瘟病毒的检测提供了一种新的、更加敏感的检测技术。     

Isolation of a new repetitive DNA sequence from Secale africanum enables targeting of Secale chromatin in wheat background

A genome specific DNA sequence that detects Secale africanum chromatin incorporated into wheat was developed in this study. Random amplified polymorphic DNA (RAPD) analysis was used to search for genome specific DNA sequences of S. africanum in lines, R111, “mianyang11” (MY11) and wheat-rye 1RS/1BL translocations R25 and R57. A high copy rye-specific DNA segment pSaD15₉₄₀ of the S. africanum genome was obtained. The sequence of pSaD15 did not show any significant homology to other reported sequences in databases and it is therefore a new repetitive sequence of Secale. PCR primers were designed for pSaD15₉₄₀, which amplify a clear 887 bp fragment in S. africanum but not in any wheat. The primers also amplified an 887 bp fragment in other accessions of rye, Chinese Spring-Imperial rye chromosome additions and a diverse range of material carrying different rye chromosomes or chromosomal segments. In situ hybridization showed that probe pSaD15₉₄₀ was specifically hybridized throughout all rye chromosomes arms except for the terminal regions. The advantage of the rye-specific probe developed herein compared to those of previous reports is that it has been shown to be widely applicable to other Secale species. The probe will be useful as a molecular marker for the introgression of S. africanum and other rye chromosome segments into the wheat genome.     

番茄黄化曲叶病毒研究进展

番茄黄化曲叶病毒（Tomato Yellow Leaf Curl Virus, TYLCV）是世界范围内流行的一种毁灭性的病毒病,已成为世界番茄生产的限制性因素。近年来TYLCV在中国呈现逐年加重,自南向北迅速蔓延的趋势,已对中国番茄种植业造成极其严重的损失。本文对TYLCV的特点、诊断方法及其防治措施进行了综述。     

美洲黑杨CCoA OMT基因cDNA克隆及反义植物表达载体构建

据已报道的CCoAOMT(caffeoyl-CoA 3-O-methyltransferase)基因的eDNA序列设计一对兼并引物,从美洲黑杨当年生嫩枝的次生木质部中提取总RNA,通过RT-PCR的方法获得约750 bp的特异性扩增产物.测序结果显示,克隆的序列与GenBank中注册的CCoAOMT基因cDNA同源性最高达99%.该基因的cDNA序列已在GenBank上登录(登录号:EF153198).将克隆的美洲黑杨CCoAOMT基因的cDNA序列反向连接到植物表达载体pBI121中CaMV35S启动子的下游,成功构建了美洲黑杨CCoAOMT基因的反义表达载体pBI-CCoAOMT,为进一步通过反义技术降低杨树木质素含量奠定了基础.     

利用分子标记鉴定白菜细胞质雄性不育类型的研究

通过对9份白菜细胞质雄性不育材料的不育胞质类型进行分子标记鉴定,以期为今后更好的利用分子标记来进行辅助育种奠定基础。通过CTAB法提取白菜的基因组DNA,根据GenBank中orf138基因保守序列设计2对特异引物,对9份白菜基因组DNA进行PCR扩增,将扩增出条带的PCR产物进行测序,在NCBI中进行同源性比对,最终确定其不育胞质类型。结果表明：2对特异引物PI/PII和PIII/PIV只在4份白菜雄性不育基因中均扩增出条带,在另外5份材料中未扩增出条带,与田间育性鉴定相符,获得4份白菜Ogura胞质雄性不育的分子标记;在GenBank中用BLAST进行同源性比对分析,发现L1-CI、L3-CI、L3-F1 3个不育材料的特异片段与已报道的青花菜Ogu CMS所具有的Ogu orf138基因（Genbank登录号：HQ149728）同源度高达100%,L1-F1的同源度达99%,出现了一个变异位点,另外5份材料的胞质不育类型有待进一步研究。通过该方法鉴定出9份材料中有4份材料是萝卜胞质雄性不育的材料,得到了4条分子标记,该结果可为白菜细胞质雄性不育的分子鉴定提供了新的标记,也为今后利用分子标记辅助育种奠定了基础。     

RT-PCR技术检测猪流感病毒

根据猪流感病毒（SIV）的M基因的序列,设计合成了1对引物,建立了检测猪流感的RT-PCR方法。应用该方法对H1、H3、H9亚型的猪流感病毒进行基因扩增,均获得了分子量为460bp的特异性目的片段,而对PRRSV、 PCV2、PRV、CSFV进行同条件检测,结果均为阴性;SIV扩增产物测序结果与SIV其他毒株序列同源性达99%～100% 。敏感性试验表明,该方法可检测到103 EID50的SIV;可直接从猪流感病毒感染小鼠的组织样品中检测到病毒。