陆地棉雄性不育恢复系18R的BAC文库构建

 18R雄性不育恢复系农艺性状优良,恢复性状稳定,对不育系能够100%恢复,是研究棉花三系互作的重要材料。本研究以pCC1BAC(BamHI)为载体,构建了18R的细菌人工染色体（BAC）文库。建立的文库包含139,200个BAC克隆。分析结果表明, BAC文库DNA插入片段为50～200 kb,91%的克隆插入片段为80～150 kb,平均102 kb,空载率<2%,覆盖6.3倍基因组。     

樟树细菌人工染色体(BAC)文库的构建及质量检测

樟树(Cinnamomum camphora(L.)Presl)是一种具有材用、药用、油用、香料和生态环境建设等多种用途的樟科植物代表种。本研究以樟树幼嫩叶片为材料,通过提取高分子量核DNA(HMW-DNA)构建了第一个樟树细菌人工染色体(BAC)文库。该文库一共有36 960个克隆,平均插入片段为120 kb,覆盖樟树全基因组5.7倍左右,空载率小于1%。随机挑选10个BAC克隆进行末端测序说明BAC克隆为正常可用的单克隆。以此为基础,对樟树的BAC文库进行了测序,最终得到287.28 G的数据。樟树基因组BAC文库的构建,为樟树重要功能基因的克隆、功能验证、物理图谱的构建和全基因组测序等研究工作奠定了基础。     

云南疣粒野生稻细菌人工染色体（BAC）文库的构建与分析

我国有3种野生稻,即普通野生稻(oryza rufipogon)、药用野生稻(O.officinalis)、疣粒野生稻(O.granulata).野生稻由于长期处于野生状态,经受了各种灾害和不良环境的自然选择,抗逆性较强,是天然的基因库,保持有栽培稻不具有或已经消失了的遗传基因,它在水稻育种中具有独特的作用,是水稻育种的宏厚物质基础.     

山羊基因组文库的构建研究

构建了山羊基因组文库,为筛选山羊乳蛋白基因,构建山羊乳蛋白基因定点整合的转基因敲入载体奠定基础。全血提取基因组DNA,Sau3AΙ部分酶切,分级分离回收15~23 kb片段,将片段插入Lambda BlueSTAR BamHΙ vector,连接并包装后,NotI酶切鉴定。结果表明,文库滴度为3.4×106;共得到1.7×106个有效克隆,插入片断长度在15~23kb范围,成功构建了西农萨能奶山羊基因组文库。     

利用磁珠富集马铃薯BAC文库中NBS-LRR类晚疫病抗性基因

栽培马铃薯是高度杂合的四倍体作物,利用传统的基因克隆方式进行晚疫病抗性基因分离难度很大。然而,晚疫病抗性基因具有序列保守性,属于NBS-LRR类基因。本研究中,根据晚疫病抗性基因R3a家族的序列比对结果设计R3a基因家族的保守探针,并将含有R3a基因的BAC SH23G23部分酶切成7~11 kb DNA片段。通过结合保守探针的磁珠系统对上述7~11 kb DNA片段进行R3a基因分离,将磁珠富集的片段克隆到双元载体pBINPLUS上。通过阳性克隆和菌落PCR鉴定表明,含有R3a基因的克隆比率达到82.76%,相对于磁珠系统富集前,提高R3a基因比率近19倍。本研究建立了抗病基因及其同源序列的磁珠分离系统,为分离马铃薯等多倍体作物中具有保守结构的基因提供了实验基础。     

污泥有机肥应用于中国水仙栽培的研究

摘要 本研究通过污泥田间试验,探讨不同污泥有机肥在中国水仙栽培上的施用效果。试验表明：适量的污泥有机肥能促进中国水仙的营养生长、提高其叶绿素含量,提高中国水仙主鳞茎的围径,提升中国水仙鳞茎球销售的等级和销售价值。其中以处理3（2250 kg /hm2污泥有机肥+ 750 kg /hm2过磷酸钙+ 750kg /hm2复合肥）和处理4（3000 kg /hm2污泥有机肥+750 kg /hm2过磷酸钙+ 750kg /hm2复合肥）的效果最佳,污泥有机肥可作为优良的土壤改良剂及农田肥料。     

中国水仙八氢番茄红素脱氢酶基因(PDS)的克隆及表达分析

八氢番茄红素脱氢酶（PDS）是影响类胡萝卜素合成的一个重要限速酶,在植物花色发育过程中起着重要作用。采用RT-PCR技术从中国水仙（Narcissustazetta var.chinensis）幼嫩花蕾中分离到一个新的水仙花色发育相关的PDS基因,命名为NTPDS1（GenBank登记号：EU138883）。该基因长1719bp,具有一个1713bp的完整开放读码框（ORF）,编码570个氨基酸。序列分析表明,NTPDS1编码的氨基酸序列与其它植物的PDS蛋白有很高的相似性。系统进化树分析显示,NTPDS1与喇叭水仙亲缘关系最近。利用半定量PCR技术进行组织表达模式分析发现,该基因在中国水仙的花、叶片和根中均有表达,但以花器官中表达量最高;在花瓣和副冠中的表达量高于雄蕊和雌蕊。     

紫外辐射对普陀水仙生理生化指标的影响

研究紫外线辐射下普陀水仙茎、叶生理生化指标的变化,为进一步研究开发利用海岛植物提供理论依据。本实验紫外辐射时间共设3个梯度,2h、12h、24h,以0h为对照组,测定了普陀水仙茎、叶中SOD、POD、MDA、脯氨酸、电导率、可溶性蛋白质、可溶性糖及叶绿素等生理生化指标。结果表明：随着紫外辐射时间延长,茎、叶中SOD和POD活性变化呈先上升后下降趋势,辐射时间为2h时达到最高,茎中的POD活性明显低于叶。茎和叶中脯氨酸、可溶性糖、MDA含量和电导率均随着紫外辐射时间延长而增大。茎、叶中可溶性蛋白质的含量呈先上升后下降趋势,辐射时间为12h时达到最大。叶绿素a、叶绿素b和类胡萝卜素的含量均呈先增高后减少的趋势,叶绿素的含量在辐射时间2h时达到最大。综合研究认为,紫外辐射下2-12h之间,普陀水仙茎、叶具较强的抗紫外辐射特性,自身能够有效地解除紫外辐射对其造成的伤害。     

中国水仙NtFT2正义基因表达载体的构建与愈伤组织遗传转化体系的建立

构建中国水仙Nt FT2正义基因表达载体,为进一步研究Nt FT2基因对中国水仙芽休眠调控作用提供参考;建立中国水仙愈伤组织遗传转化体系,为中国水仙愈伤组织遗传转化提供技术平台。笔者以中国水仙主芽为材料,通过PCR扩增获得Nt FT2基因;通过PCR、双酶切、连接等方法将Nt FT2基因正向插入到p CAMBIA1301双GUS植物表达载体构建Nt FT2正义基因表达载体P1301-FT2,再通过冻融法将重组质粒P1301-FT2导入根癌农杆菌。采用根癌农杆菌介导法将Nt FT2正义基因转化中国水仙愈伤组织,采用GUS组织化学染色法检测中国水仙愈伤组织遗传转化效率。结果表明,试验成功构建了中国水仙Nt FT2正义基因表达载体P1301-Nt FT2;中国水仙愈伤组织与0.5 mol/L甘露醇共培养6 h后,置于1.0 OD600的农杆菌重悬液中侵染20 min,在25℃、黑暗条件下,共培养6天,其GUS瞬时表达率达到64.28%。构建了中国水仙Nt FT2正义基因表达载体,建立了高效的中国水仙愈伤组织遗传转化体系。     

中国水仙凝集素基因在大花烟草中的定量表达及抗蚜性分析

为了确定中国水仙凝集素基因NTL1的抗蚜功能及培育具有抗蚜功能的大花烟草,利用qPCR方法,研究了中国水仙凝集素基因(NTL1)在转基因大花烟草4个株系中的相对表达情况;利用自然感蚜、活体接种和离体接种方法研究了不同转基因株系的抗蚜能力。结果表明,NTL1在不同株系中的相对表达量差异显著,从高到低依次为3,4,1,2;抗蚜虫试验结果显示:转基因烟草具有一定抗蚜性,但不同烟草株系的抗蚜能力有所不同;活体转基因烟草单株与离体烟草叶片的平均蚜虫密度抑制率分别为8.22%~76.61%,4.62%~65.65%;转基因大花烟草可加速蚜虫的死亡。对比NTL1在不同转基因大花烟草株系中的相对表达量及抗蚜效果,发现NTL1在不同株系中的相对表达量与植株抗蚜性具有高度一致性。     

中国水仙花药培养及植株再生体系建立

本研究以中国水仙花药为外植体,通过器官发生途径建立其植株再生体系,并通过染色体计数鉴定筛选变异个体。结果显示:在4℃下预处理3d有利于花药愈伤组织的形成;愈伤组织诱导培养基最适配比为:MS+2,4-D1.0mg/L+BA0.5mg/L+CH500mg/L+AC500mg/L;愈伤组织分化小鳞茎的最适培养基为:MS+BA0.5mg/L+NAA0.1mg/L+CH500mg/L+AC1000mg/L。通过染色体计数对38个再生植株进行倍性鉴定,结果显示其中30个为三倍体(2n=30),8个为非整倍体(2n=10,11,12,14,17,26)。以这些再生苗为外植体,经器官发生途径,建立了不同倍性的再生体系。     

基于棉花BAC文库的大片段核DNA的提取方法

本实验在基因组大片段DNA的提取方法上,结合棉花的特殊性,作了一些改进。即首先将幼苗进行暗培养,减少了叶绿体和酚类等物质的影响;随后在Wash buffer中加入酚结合剂PVP40(polyvinylpyrrolidone),较好地去除了棉酚等次生物质的干扰;另外在细胞核分离过程中,增加了低速稍离心去沉淀的步骤但之前不需要过滤,较好地去除了不溶性杂质。此方法所提取得到的棉花基因组DNA,分子量约在1Mb左右,碎片较少,基本上无蛋白质和细胞器DNA等污染。其质量完全满足构建BAC文库的要求。     

中国水仙凝集素基因的克隆及性质预测

为了探索植物凝集素在分子水平的作用机理,利用RT-PCR技术从中国水仙(Narcissus tazetta var.chinensis)金盏银台中克隆到一个新的编码凝集素的基因.序列分析与预测结果表明,该基因cDNA片段总长为609 bp,含有一个由25个氨基酸残基组成的信号肽和一个519 bp的完整开放阅读框;编码172个氨基酸,分子量为18 712.31 Da;前体蛋白在氨基酸水平上与杂种多花水仙凝集素、雪花莲凝集素、石蒜凝集素的一致性分别为83%,81%和77%;其二级结构以α-螺旋、不规则盘绕和延伸链为主;三级结构与雪花莲凝集素极其相似,是一种能与D-甘露糖特异性结合的B型凝集素.     

Construction and characterization of a BAC library of soybean

We have constructed a soybean (Glycine max (L.) Merrill) bacterial artificial chromosome (BAC) library from green leaf protoplasts of the cultivar, Misuzudaizu. The library contains 53,760 clones with an average insert size of 116 kb. About 2.9% chloroplast DNA origin was revealed by PCR and colony hybridization. Apart from 2.8% clones having no insert, this library represents 5.2 genome equivalents. With this genome coverage, the probability of having any DNA sequence represented in the library is higher than 99.5%. Three-dimensional pools of the BAC library in combination with the use of a high efficiency genome scanning (HEGS) electrophoresis facilitate rapid and efficient PCR-based screening. An average of five positive clones were identified after screening the BAC library with SSR and STS markers. BAC-end walking was performed for three SSR associated BACs. This library will provide a good resource for positional cloning of agronomically and biologically important QTL genes that Misuzudaizu possesses.     

棉花抗黄萎病相关基因筛选与亚克隆文库构建

以黄萎病菌诱导下差异表达的棉花抗病相关基因片段PR8为探针,利用杂交方法,对优质、抗病海岛棉品种Pima90-53 BAC文库进行筛选。从30 336个BAC克隆中筛选到含有PR8基因片段的4个阳性克隆,分别为127K13,128D14,169J3和178C5。用Sau3AI对其中的169J3克隆进行酶切,回收2~4 kb的DNA片段并连接到载体pUC118BamHI-BAP上,构建了含有该基因片段的亚克隆文库,共含有4 224个克隆。经电泳检测,插入片段在1~3 kb,平均为2 kb。该亚克隆文库的构建为克隆PR8基因奠定了基础。