AP2基因家族的起源和棉花AP2转录因子在抗病中的作用

植物中庞大的AP2基因家族成员因其广泛参与植物响应外界环境胁迫、生长发育相关的转录调控而备受重视。AP2基因曾被认为植物所特有,但最近在蓝藻、线虫和病毒中发现了具有AP2结构域和位点特异核酸内切酶的蛋白。所以有人认为当今植物中的AP2基因起源于细菌或者病毒的基因的横向转移,AP2结构域可能来自后来进化为叶绿体的原始蓝细菌的内共生。ERF是AP2大家族中的一个亚族,它编码的蛋白能特异结合含有GCC盒的病程相关基因的表达,参与植物抗病反应。ERF基因的表达受到疾病相关刺激以及环境胁迫的诱导,并且在乙烯、茉莉酸和水杨酸信号传导途径中发挥一定的作用。同时,某些ERF基因在转基因植物中的超表达表现了一定的广谱抗性,因而在分子育种中具有一定的应用前景。棉花上AP2基因家族的基因克隆与分析最近才得以进行,介绍了我们在棉花上相关的研究工作并讨论了它们在植物抗病反应中的作用。     

棉花MAPKs家族成员的聚类分析

MAP激酶(促分裂原活化蛋白激酶)级联信号通路(MAPKs)由3种级联磷酸化的蛋白激酶MAPKKK、MAPKK和MAPK组成,在调控植物的生长发育、胁迫响应及抗病反应等过程中都起重要作用。为了全面了解棉花MAPK、MAPKK、MAPKKK家族各成员间的关系,进而研究和揭示MAPKs在棉花抗病、抗逆中的作用,利用已公布的雷蒙德氏棉和亚洲棉基因组数据,并从NCBI数据库中收集陆地棉的MAPKs氨基酸序列,运用生物信息学的方法对棉花(陆地棉、雷蒙德氏棉、亚洲棉)MAPK、MAPKK和MAPKKK家族的氨基酸序列进行了同源比对和聚类分析。结果表明:棉花MAPK家族具有特征性结构TEY磷酸化位点或TDY磷酸化位点,依据其氨基酸序列可划分为A、B、C和D族,其中TEY类包含A、B和C族,TDY类只包含D族;棉花MAPKK家族具有特征性保守区域S/T-X5-S/T和活性部位基序D(I/L/V)K,并依据其氨基酸序列也可将其划分为A、B、C和D族;棉花MAPKKK家族具有MEKK特征性保守区域G(T/S)PX(W/Y)MAPEV和Raf特征性保守区域GTXX(W/Y)MAPE(L/V),进而分为MEKK类和Raf类2组亚群。本研究梳理了棉花MAPKs中的MAPK、MAPKK、MAPKKK家族各成员间的关系,为进一步研究棉花MAPKs信号传导途径和揭示其在棉花抗病、抗逆中的作用提供了基础信息。     

ERF转录因子对生物胁迫的反应及对棉花抗性改良的意义

大量研究表明植物中ERF(ethylene responsive factor)类转录因子广泛参与外界环境胁迫应答基因表达的调控.它编码的蛋白能够特异结合GCC-box元件,从而调控启动子含有GCC-box的病程相关蛋白基因的表达,在植物抗病反应中发挥重要的调控作用.棉花中ERF基因表达受生物和非生物胁迫诱导,并在乙烯、茉莉酸和水杨酸信号传导途径中发挥一定的作用.一些ERF基因在转基因植物中的超表达表现出了一定的广谱抗性,因而在棉花分子育种中具有较为广阔的应用前景.本文主要论述了棉花等植物中ERF的结构与功能特征,当前相关研究进展,及其对棉花抗病性分子遗传改良的意义.     

蓖麻AP2/ERF转录因子家族的生物信息学分析

AP2/ERF家族是一种广泛存在于植物体内的重要转录因子,该转录因子大多数参与植物的生长发育、生理代谢以及抵抗非生物胁迫的过程。本研究利用蓖麻基因组数据库寻找到了113个蓖麻AP2/ERF家族基因,利用生物信息学方法对这113个蛋白序列构建无根进化树,且对氨基酸组成成分进行分析,发现组成蛋白质的氨基酸数目在不同亚族之间差异较大,其中AP2亚族的平均氨基酸数目为个439,亚族中最小的平均氨基酸数目为ERF亚族,平均为255个。在蓖麻的113个蛋白序列中大部分为稳定的亲水性蛋白、且含有多个磷酸化位点、在该蛋白中α—螺旋和无规则卷曲是主要的二级结构方式,除AP2亚族外,其余亚族均含有β—转角,亚族无规则卷曲均占50%以上,说明延伸链和(β—转角则分散在整个氨基酸链中。三级结构与二级结构预测一致。还对保守结构域、蛋白无序化特性等进行了预测和较为全面的分析。这些分析结果为进一步研究蓖麻中AP2/ERF转录因子对生长发育过程中的作用提供了理论依据。     

海岛棉转录因子EREB5基因的克隆及特征研究

 近年来,ERF (Ethylene-responsive element binding factor) 家族转录因子已成为植物抗逆、抗病的分子机制和作物分子育种研究的热点。本研究以电子克隆、同源扩增和RACE（Rapid-amplification of cDNA ends）技术相结合的方法从海岛棉中分离出了一条新的ERF族转录因子基因,命名为EREB5。该基因包含一个573 bp长的开放阅读框,预期编码190 aa长的蛋白质分子。序列分析表明该蛋白除含有一个ERF保守域外,还含有一段核定位信号序列、一段富丝氨酸的激活域、多种磷酸化位点和一个土豆抑制子Ⅰ型家族基序等。构建系统发育树分析表明该因子属于ERF亚家族B3亚组。瞬时表达实验证明该因子定位于细胞核内,同时,凝胶阻滞实验结果说明EREB5蛋白和GCC盒具有较强的结合能力。再者,荧光定量PCR结果表明乙烯和黄萎病菌处理可以诱导该基因的表达。这些结果暗示EREB5蛋白很可能在黄萎病抗性机制中扮演者重要角色。     

菊花AP2/ERF家族全基因组分析

作为植物的转录因子家族之一,AP2/ERF基因家族在植物的发育调控、激素响应以及调控植物应对各种胁迫的生命过程中发挥关键作用。本研究基于菊花脑(Chrysanthemum nankingense)基因组,筛选到菊花AP2/ERF基因家族,并对该家族的成员进行基因与蛋白结构、蛋白理化性质、保守基序、启动子顺式元件、组织和胁迫条件下的表达特征等进行了相关分析。此外,结合现有的公共数据库的60个菊花转录组测序数据,通过WGCNA分析对该基因家族成员进行了初步的功能分类。研究结果表明：菊花AP2/ERF基因家族共筛选229个成员,分别将其命名为CnAP2001～CnAP2229。系统进化分析发现菊花AP2/ERF家族成员属于4个亚家族(AP2, ERF, DREB, RAV)以及3个Soloist (未分类)序列。通过WGCNA的方法,将筛选的39 508个表达的基因划分为36个模块。分析发现有31个AP2/ERF家族成员在花发育相关的7个模块,20个成员在胁迫相关的3个模块。综上所述,AP2/ERF家族成员在菊花花发育过程以及非生物胁迫过程中发挥着重要功能,本研究为菊花分子育种提供了新的思路...     

植物抗逆相关ERF转录因子研究综述

植物在它的生命周期中要经历各种逆境胁迫。植物许多胁迫相关基因的表达主要受特定转录因子在转录水平的调控。ERF转录因子家族参与植物的生物胁迫和非生物胁迫的应答,是同植物抗逆应答密切相关的一类转录因子大家族。它们通过识别不同的顺式元件,调节多种功能基因的表达,调节植物抗性应答。综述简要介绍ERF转录因子及其相关顺式作用元件。阐述植物ERF转录因子家族在植物抗逆应答中的功能。     

银杏AP2/ERF转录因子鉴定及其ERF家族在逆境胁迫下的表达分析

AP2/ERF转录因子广泛参与银杏的生物学过程,其ERF基因家族存在着通过调控次生代谢来应对环境压力的可能。为探究ERF基因家族在这一过程中的应答机制,本研究分别构建了紫外和干旱处理下银杏叶转录组数据库,利用在线生物信息学工具对银杏AP2/ERF转录因子的保守结构域、理化性质及基因家族同源性进行分析,同时利用转录组测序技术检测了ERF基因家族在这两种逆境胁迫下的表达情况,筛选其中5个与类黄酮等代谢相关的ERF基因进行荧光定量PCR验证分析。结果表明,在银杏中共鉴定到61个AP2/ERF转录因子,根据其保守结构域特点分为4类,即ERF亚家族28个、DREB亚家族23个、AP2和RAV亚家族分别为5个。不同成员之间的氨基酸数目、等电点(pI)等理化性质有较大差别。从与拟南芥、大豆的序列同源性分析结果来看,同一个亚家族的成员之间亲缘关系较近。GbERF亚家族和GbDREB亚家族同属于银杏ERF基因家族,成员数最多。转录组预测分析结果显示,大部分ERF基因家族成员在紫外和干旱胁迫诱导下的基因表达量会增加。经验证,5个基因表达量的变化情况总体与预测结果一致。本实验结果为后期开展银杏ERF基因家族的功能研究提供科学依据。     

陆地棉耐盐相关基因GhERF79的克隆与分析

利用RACE-PCR技术克隆陆地棉ERF基因的全长cDNA,命名为GhERF79,该cDNA长度为980 bp,含有一个完整的ORF(Open reading frame)为756 bp,编码251个氨基酸的多肽;亚细胞定位显示该基因表达产物定位于细胞核中,生物信息学分析表明GhERF79属于ERF转录因子家族内的A-1亚族。Real-time PCR分析结果表明,GhERF79的表达受盐胁迫和植物激素诱导,该基因在耐盐材料中9806中的诱导表达水平显著高于盐敏感材料中棉所12;外源激素ABA(Abscisic acid)、ET(Ethylene)、MeJA(Methyl jasmonate)可以显著诱导GhERF79的表达,推测其可能在棉花响应盐胁迫途径中发挥重要功能。     

木薯转录因子MeERF117的克隆及表达分析

AP2/ERF (APETALA2/ethylene responsive factor)类转录因子是植物应答多种逆境胁迫机制中的关键组分,研究木薯AP2/ERF家族成员将有助于解析该家族在木薯抗逆胁迫中的功能。基于已有木薯基因组序列信息,以木薯块根cDNA为模板,克隆得到一段长度为927 bp的cDNA,命名为MeERF117,该基因编码308个氨基酸。MeERF117蛋白分子量为35.08 kD,且该蛋白仅含一个AP2/ERF结构域,属于ERF转录因子家族。在进化关系上,Me ERF117蛋白与巴西橡胶树的ERF蛋白最相近。亚细胞定位观察到MeERF117蛋白分布于细胞质和核中。实时荧光定量PCR (Real-time quantitative PCR)方法检测MeERF117基因在木薯块根采后生理性变质(Post-harvest physiological deterioration, PPD)过程中的相对表达量,发现PPD的发生可提高MeERF117因子的表达水平,在PPD后期(48 h)时MeERF117的相对表达量是未发生PPD (0 h)时的2倍,表明木薯块根PPD的发生...     

W6基因的过表达提高转基因烟草的耐盐性

W6基因是由普通小麦地方品种小白麦cDNA文库中克隆获得的ERF类转录因子, 属于ERF IV家族。将W6基因构建在由组成型CaMV35S强启动子控制的双子叶转化载体pBI121上, 通过农杆菌介导法将其转入烟草新华1号。利用RT-PCR技术分析W6基因的过量表达对下游抗性基因表达水平的影响, 并测定高盐胁迫下转基因烟草的SOD酶活性和叶绿素含量。结果显示, 所检测的转基因烟草阳性株中W6基因均有不同程度的表达, 其耐盐性明显提高。W6基因的表达诱导并增强了含有GCC box的PR(pathogenesis-related)基因和含有DRE/CRT元件的COR/RD基因的表达。在高盐胁迫下, 转基因烟草的SOD酶活性和叶绿素含量明显高于对照。W6基因既能诱导抗病相关的PR基因表达又能诱导与提高非生物胁迫能力的COR/RD基因表达, 可能与生物胁迫和非生物胁迫相关, 证实转录因子W6参与了耐盐胁迫相关基因的调节, W6基因的过表达提高了转基因烟草的耐盐性。     

大豆(Glycine max) GmDREB5互作蛋白GmGβ1的筛选及鉴定

从大豆(Glycine max)中克隆了一个与抗逆相关的DREB (Dehydration Responsive Element Binding Protein) 基因GmDREB5。功能分析证明, GmDREB5基因能够显著提高烟草的抗旱性和耐盐性。为了筛选GmDREB5的互作蛋白, 采用酵母双杂交系统以GmDREB5蛋白73~226位氨基酸区段为诱饵筛选干旱处理的大豆cDNA文库, 发现一个互作蛋白含有保守的WD40结构域, 与棉花(Gossypium hirsutum)和水稻(Oryza sativa)的G蛋白β亚基分别具有61%和52%的同源性, 说明蛋白可能是一类新的大豆G蛋白β亚基, 将其定名为GmGβ1。将GmDREB5与GmGβ1共转化酵母菌株AH109, 转化的酵母能够在四营养缺陷型培养基上(SD/ trp- leu- his- ade-)正常生长, 而对照不能生长; 同时, 共转化的酵母能够激活LacZ报告基因的表达, 证明GmGβ1与GmDREB5之间存在相互作用。表达特性分析表明, GmGβ1基因受干旱、低温、高盐等胁迫和激素ABA处理的诱导而表达, 证明GmGβ1不仅参与植物对非生物胁迫的响应, 同时参与对GmDREB5蛋白水平的调控。     

海岛棉5个CBF/DREB基因的克隆与表达分析

低温、干旱和盐渍是影响作物生长、产量和全球地理分布的重要非生物胁迫。CBF/DREB转录因子是参与植物非生物胁迫应答反应的重要调控蛋白。为了更好地了解棉花CBF家族基因,通过生物信息学的方法,从海岛棉中克隆了5个具有完整开放阅读框的CBF基因,命名为Gb CBF1―Gb CBF5。这5个基因编码的蛋白与其他植物冷胁迫相关的CBF蛋白具有高度的保守性,含有1个AP2功能结构域和2个特征基序。系统进化树分析表明,这5个基因与拟南芥的3个参与冷胁迫的CBF基因一起聚类在DREB亚家族中的A-1亚组。通过RT-PCR的方法分析了海岛棉基因Gb CBF1―5在高盐(200 mmol·L-1 Na Cl)、干旱、4℃低温等非生物胁迫处理下的表达模式。结果表明其中2个基因在冷胁迫下上调表达,5个基因在干旱和盐处理下均下调表达。这些为进一步探索CBF基因在棉花逆境胁迫应激反应中的作用提供了有价值的信息。     

玉米光敏色素A1基因(ZmPHYA1)在棉花中的转化及分子鉴定

为评价玉米ZmPHYA1基因在棉花种质资源改良中的价值,本研究利用农杆菌介导法在陆地棉(Gossypium hirsutum)R15材料中进行了玉米ZmPHYA1基因的遗传转化。经过愈伤组织诱导、抗性愈伤筛选、体细胞分化诱导后获得棉花转基因再生植株。通过田间草铵膦除草剂筛选鉴定抗性植株,并利用PCR扩增其草铵膦抗性基因和目的基因ZmPHYA1进行分子鉴定,发现阳性植株对草铵膦除草剂具较好抗性,并可扩增到256 bp的草铵膦抗性基因和217 bp ZmPHYA1基因的特异条带。进一步通过免疫印迹检测表明,3个不同转基因株系中外源ZmPHYA1基因可正常表达约170 kD大小的蛋白,且在不同组织中该外源蛋白均可正常表达。此外,对转基因植株的不同农艺性状分析表明,转基因株系株高明显低于受体对照,而铃重和纤维长度等性状无明显差异。本研究成功获得具有草铵膦抗性和外源ZmPHYA1基因的棉花新种质材料,为进一步利用光敏色素基因创新种质资源提供了材料来源。     

马铃薯AP2/ERF转录因子的克隆及植物表达载体构建

AP2/ERF基因家族转录因子普遍存在于植物中,参与植物体内的各种生物学过程,包括植物的生长发育、生物和非生物胁迫响应等。前期转录组测序的结果发现马铃薯‘加湘1号’一个AP2/ERF家族基因(PGSC0003DMG400012154)在接种晚疫病菌(Phytophthora infestans)24 h后被显著激活。从接种P.infestans 24 h的‘加湘1号’的总RNA中通过RT-PCR获得了该基因CDS序列为885 bp,BLAST分析显示该基因编码一个295个氨基酸残基的蛋白,并且含有1个AP2/ERF结构域,是AP2/ERF转录因子家族中的ERF亚家族的一员。本研究将该基因与XcmⅠ酶切的表达载体pCXSN连接,转化大肠杆菌,通过测序挑选插入正确克隆酶切验证,并成功转化农杆菌。本研究结果为进一步研究该基因的功能提供了帮助。     

陆地棉蔗糖磷酸合成酶基因家族的鉴定及表达分析

【目的】蔗糖磷酸合成酶(Sucrose phosphate synthase,SPS)是调控植物蔗糖代谢合成途径的关键酶,在植物光合产物的积累与分配方面发挥着重要作用,然而棉花中SPS基因的系统研究尚很少开展。本研究旨在对陆地棉SPS基因进行全基因组鉴定,并对它们的表达特性进行系统分析。【方法】基于已公布的陆地棉基因组序列,利用生物信息学和荧光定量聚合酶链式反应(Quantitative real-time polymerase chain reaction,qRT-PCR)等方法对陆地棉SPS家族基因的蛋白结构、进化关系、基因结构特征、染色体定位、基因复制和表达特性进行分析。【结果】(1)在陆地棉基因组中,共鉴定到10个Gh SPS基因(Gh SPS1-Gh SPS10);(2)Gh SPS蛋白具有植物SPS家族特有的两个保守的蛋白结构域和3个相对保守的蛋白磷酸化位点;(3)进化分析表明,Gh SPS蛋白可聚为A、B和C共3个亚族,其中A亚族成员最多,包含6个GhSPS蛋白;(4)位于同一亚族的GhSPS基因具有相似的外显子-内含子分布模式,但是外显子/内含子数目在不同亚族间差异很大;(5)GhSPS基因均匀地分布在陆地棉A亚组和D亚组的5条染色体上,片段复制可能导致了GhSPS基因在陆地棉基因组中的扩增;(6)转录组分析表明,不同亚族GhSPS基因具有不同的组织表达模式,A亚族Gh SPS基因在被检测的各个组织均有较高的表达,B亚族GhSPS基因主要在叶片中高表达,C亚族Gh SPS基因主要在纤维、叶片和花瓣中高表达;(7)进一步荧光定量PCR分析表明,GhSPS4在叶片中表达量很高,GhSPS1在叶片和花瓣中表达量较高,Gh SPS7和Gh SPS10在被检测的各个组织均有较高的表达,该结果与转录组分析结果相对一致。【结论】陆地棉SPS基因家族包含10个成员,分布在5条染色体上,可分为3个亚族,不同亚族成员呈现出不同的表达模式,为后续深入解析陆地棉SPS家族基因的功能奠定理论基础。     

拟南芥AT2G14260基因功能及其表达特异性分析

拟南芥AT2G14260基因编码脯氨酸亚氨基肽酶，基因芯片表达谱数据显示该基因响应高盐、低温等非生物胁迫。为研究其功能和表达特性，本研究采用野生型和突变体植株pip-1进行低温、干旱和盐胁迫处理，结果显示在正常培养基中野生型与pip-1植株表型没有区别。而在逆境处理下pip-1植株的根比野生型明显短，且在干旱胁迫下，突变体的叶子比野生型植株明显变黄萎蔫。在正常环境、冷、干旱、盐胁迫下，野生型植株脯氨酸含量的平均值分别是突变体的1.11、1.23、1.10和1.34倍，这说明AT2G14260基因对提高非生物胁迫的耐性具有一定的作用。同时分离了该基因的启动子，构建了表达GUS基因的载体并转化拟南芥，结果表明该启动子在正常环境中不表达。胁迫处理时从两叶期开始在根、叶、茎中表达，到达花期后，干旱处理下的花瓣、花枝和冷处理下的花柱头中也有表达。GUS相对活性试验也证明对胁迫的响应能力。可见AT2G14260基因启动子是逆境胁迫诱导表达启动子，同时具有组织表达特异性，因此，AT2G14260基因及其启动子在转基因工程育种中具有潜在的应用价值。