牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测方法的建立

根据牛传染性鼻气管炎病毒gB基因序列,合成GH-1、GH-2两条引物,分别以IBRV的Barta Nu/67株、IBRVBK125株基因组DNA为模板进行扩增,结果两株IBR病毒DNA均可扩增出362bp的特异性片段;对其同属的伪狂犬病毒（PRV）、火鸡疱疹病毒（HVT）及牛病毒性腹泻-粘膜病病毒（BVDV）进行扩增均未见特异性条带;敏感性检测表明,该法对IBR病毒的检出限量为104.25TCID50/0.1mL.     

牛传染性鼻气管炎病毒双重PCR检测方法的建立

为建立牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的双重PCR检测方法,根据GenBank中登录的IBRV gE和gB基因序列,设计2对特异性引物。结果表明,建立的方法特异性强,对牛支原体、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、巴氏杆菌、牛和羊布鲁菌进行检测,结果均为阴性。研究表明,所建立的双重PCR检测方法具有快速、敏感、准确等优点,可以用于IBRV的检测。     

牛传染性鼻气管炎PCR检测方法的建立

根据牛传染性鼻气管炎病毒gB基因序列设计一对引物,进行PCR检测,并对反应条件及反应体系进行优化。结果得到与预期大小(362bP)一致的特异性片段。最佳退火温度为58～64℃,Mg2 最佳浓度为1.6mM,dNTPS为0.36mM,引物为0.2pmol/uL,聚合酶0.8U/100uL。用这对引物扩增IBRV、HCV、PRRSV、PRV,只有IBRV扩增出特异性条带。该PCR方法的检测灵敏度为2.4ng/100uL,较其他方法敏感。     

牛传染性鼻气管炎病毒套式PCR检测方法的建立

利用套式PCR技术建立一种快速检测牛传染病鼻气管炎病毒(bovine infectious rhinotracheitis virus,IBRV)并能区分野毒株和gB基因缺失疫苗的方法。根据基因库中牛传染性鼻气管炎病毒的gB和gE基因序列,应用pri mer5.0软件设计了gB/BN和gE/EN的2套套式PCR引物,分别对IBRV标准株进行PCR扩增,结果表明,这2套引物均能扩增出与设计目的片段大小一致的特异性条带;用此引物对同属的伪狂犬病毒、马立克氏病毒、鸭瘟病毒进行扩增,具有良好的特异性。引物gB/BN和gE/EN的检测灵敏度分别为0.01TCID50和0.1TCID50。     

牛传染性鼻气管炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)保守基因gB和gE序列,分别设计两对引物及其相应的TaqMan探针,建立、优化反应体系后,利用10倍稀释的病毒进行扩增以检测其灵敏度,同时对伪狂犬病病毒(PRV)、马立克病病毒(MDV)、鸭瘟病毒(DPV)进行特异性检测.结果显示,建立的扩增gB和gE基因的荧光PCR可用于检测IBRV,其灵敏度为0.02 TCID50,而与PRV等非IBRV无交叉反应.本研究所建立的荧光PCR具有快速、灵敏、准确、低污染等优点,可用于IBRV的检测.     

牛传染性鼻气管炎病毒LUXTM新型荧光PCR检测方法的建立

本研究针对牛传染性鼻气管炎病毒（Infectious bovine rhinotracheitis virus，IBRV）高度保守的gC基因设计单标记并具有自身荧光淬灭功能的LUX^TM引物，建立L刚新型实时荧光PCR方法用于快速检测IBRV。该方法对四株IBRV细胞培养物的检测均呈典型阳性反应，而对其它动物疱疹病毒以及健康牛组织DNA和细胞对照的检测结果为阴性，检测时间包括核酸提取仅需1h～2h。试验表明，LUX^TM荧光PCR法对IBRV细胞增殖病毒液的检测敏感性可达0．04TCID50，比病毒分离敏感性至少提高10倍；对10倍系列稀释的纯化IBRV核酸样品，L刚荧光PCR的检测敏感性比常规PCR可提高10^3倍。将病毒液添加到健康牛精液和血液样品中，该荧光PCR可检测到牛冻存精液中40TCID50牛抗凝全血、血清和临床精液中0．04TCID50的病毒，说明对临床样品的检测有效。本研究所建立的LUXTM荧光PCR方法快速敏感，适合应用于活牛及其遗传物质的进出口检疫、养牛业疾病防控等领域对IBRV的快速检测。     

牛传染性鼻气管炎病毒gB基因荧光定量PCR检测方法建立

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(Bovine infectious rhinotracheitis virus,IBRV)gB基因的荧光定量PCR检测方法,本研究根据gB基因序列,设计1对引物和相应的TaqMan探针。建立和优化反应体系后,以10倍稀释的病毒来检测该方法的灵敏度。同时,对伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)、马立克病病毒(Marek’s disease virus,MDV)和鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)进行特异性检测。结果表明,基于gB基因的荧光PCR检测方法可用于鉴定IBRV,该方法具有较好的灵敏度和特异性,其灵敏度为10 copies/μL,即0.02 TCID_(50),且与其他病毒无交叉反应。     

牛传染性鼻气管炎病毒LAMP检测方法的建立

为建立一种利用颜色判定的快速、简单、灵敏度高的检测方法,即可视化环介导等温扩增(LAMP)方法,采用针对牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)基因保守序列设计的特异引物,优化反应条件,建立了IBRV LAMP检测方法,并进行了特异性和灵敏性试验。结果显示,所建立的LAMP方法具有良好的特异性,其检出灵敏度为10~3 copies/μL,仅需1 h即可肉眼观察检测结果。结果表明,本试验建立的LAMP方法可用于IBRV的进出口检疫。     

牛传染性鼻气管炎病毒恒温隔绝式荧光PCR检测方法的建立

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的恒温隔绝式荧光PCR(iiPCR)方法,本研究采用文献报道的引物和探针,通过优化反应体系,首次建立了检测IBRV核酸的iiPCR方法。结果显示该方法仅特异性检测出IBRV,而对牛病毒性腹泻-黏膜病病毒、牛副流感3型病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛腺病毒3型、牛冠状病毒、牛支原体、多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌等病原则不能检出。该方法的检测下限为2.4拷贝/μL质粒标准品,并具有良好的重复性。对临床样品的检测结果与OIE推荐的荧光定量PCR方法的检测结果一致;该方法配合PetNAD核酸萃取试剂盒,从核酸提取到报告检测结果仅需1h,具有操作简便、快速、可现地化的特点。对9个省29份商品化冻精检测结果显示,IBRV阳性率为24%(7/29),表明我国流通的商品化冻精携带IBRV情况普遍。本研究为IBRV的现地检测提供了一个可靠的方法。     

牛传染性鼻气管炎病毒TaqMan-MGB荧光定量PCR方法的建立

为建立牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的TaqMan荧光定量PCR检测方法,本研究根据IBRVgB基因保守区域设计特异性引物和MGB探针,并采用矩阵法优化了PCR反应条件。结果显示,标准曲线相关系数(R2)为0.998,103拷贝/μL~108拷贝/μL内具有较好的线性关系。对牛呼吸道合胞体、牛病毒性腹泻粘膜病1型、牛副流感病毒3型的cDNA进行检测,结果均为阴性,特异性良好。该方法对IBRV检测的灵敏度可达到1.49×101拷贝/μL,是常规PCR灵敏度的100倍,重复性试验表明该方法的组内和组间变异系数均小于1.5%。应用建立的方法与普通PCR方法分别对17份疑似临床呼吸道症状牛鼻黏液拭子样品进行检测,该方法检测的阳性率比传统PCR法检测的阳性率提高了约12%。研究表明建立的IBRV TaqMan-MGB荧光定量PCR方法灵敏、快速、特异性强、重复性好,适用于临床疑似样品的快速定量检测。     

牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒双重PCR检测方法的建立与应用

为建立一种针对牛传染性鼻气管炎病毒(infectious bovine rhinortracheitis virus,IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(bovine viral diarrhea virus,BVDV)的双重PCR检测方法,根据GenBank中IBRV gB(UL27)和BVDV 5’-UTR基因序列分别合成特异性引物,优化反应条件,建立了能够同时检测IBRV和BVDV的双重PCR方法,并对其特异性、敏感性、重复性进行了测试。结果显示：该方法对IBRV、BVDV和IBRV/BVDV可分别扩增出500、198、500/198 bp的特异性目标条带,对牛呼吸道合胞体病毒、牛冠状病毒、牛细小病毒、牛纽布病毒和牛支原体检测结果均为阴性;对混合液中IBRV、BVDV的最低检测限分别为10⁴和10³ copies/μL;3次重复性试验结果一致。采用建立的方法对79份临床可疑牛血清样品进行IBRV、BVDV和IBRV+BVDV检测,阳性率分别为12.66%、17.72%和8.86%,与IBRV和BVDV单重PCR检测结果符合率分别为90.00%...     

牛病毒性腹泻病毒和牛传染性鼻气管炎病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立牛病毒性腹泻病毒(BVDV)和牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV) TaqMan双重荧光定量PCR检测方法,本研究根据GenBank中已登录的BVDV 5'-UTR基因序列和IBRV gB基因序列,设计了2对特异性引物和2条TaqMan探针。结果显示以含有BVDV 5'-UTR基因和IBRV gB基因的重组质粒为模板绘制的标准曲线,其相关系数(R~2)均大于0.990,线性关系较好。特异性试验结果显示,该方法仅对BVDV和IBRV检测为阳性,而对口蹄疫病毒、牛流行热病毒、牛副流感病毒、牛轮状病毒、牛巴氏杆菌、猪瘟病毒、牛支原体、牛、羊布鲁氏菌检测结果均为阴性,表明其特异性强。该方法的检测下限约为10拷贝/μL,重复性试验结果显示该方法的组内和组间变异系数均小于2%,利用OIE采纳的BVDV、IBRV荧光定量PCR方法与本实验建立的方法分别对47份牛病料样品进行检测,二者对BVDV和IBRV检测的符合率分别可达97.87%和100%。研究表明所建立的荧光定量PCR方法具有快速、敏感、准确等优点,可以用于BVDV和IBRV的双重定量检测。     

牛病毒性黏膜/腹泻病毒与牛传染性鼻气管炎病毒双重PCR检测方法的建立

为了建立同时检测牛病毒性黏膜/腹泻病毒(BVDV)与牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的双重PCR方法,试验采用文献记载的检测BVDV和IBRV的单项PCR方法,设计并合成引物,通过优化反应条件和反应体系,以及特异性和灵敏度试验,建立同时检测BVDV和IBRV的双重PCR方法。结果表明:建立的方法具有高度特异性,可同时扩增出BVDV的244 bp和IBRV的362 bp片段,而对猪瘟病毒(CSFV)与牛轮状病毒(BRV)均无扩增;并且该双重PCR方法对BVDV和IBRV的检测下限均为10 pg;用25份临床样本对双重PCR方法与单项PCR方法进行对比验证,二者的符合率为100%。说明建立的双重PCR检测方法具有特异、灵敏、快速的特点,可用于BVDV和IBRV的同时检测。     

牛传染性鼻气管炎病毒和牛病毒性腹泻病毒双重荧光定量PCR检测方法的建立

为建立基于TaqMan探针的双重荧光PCR技术检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)和牛病毒性腹泻病毒(BVDV)的方法,根据IBRV gB基因序列和BVDV 5′端非编码区序列的保守区域,分别设计1对IBRV的特异性引物和1条FAM标记的TaqMan探针,1对BVDV的特异性引物和1条ROX标记的TaqMan探针,建立双重荧光定量PCR检测IBRV和BVDV的方法。对建立的检测方法进行特异性和敏感性测定,并用临床样品进行检测验证。特异性试验结果显示,该方法检测参试的IBRV毒株,在波长530μm(FAM)时收集到特异性荧光信号曲线,检测参试的BVDV毒株,在610μm(ROX)时收集到特异性荧光信号曲线,无交叉信号出现,对照的毒株无论是在530μm(FAM),还是610μm(ROX)处,均无荧光信号曲线出现,方法的特异性好;敏感性试验结果显示,该双重荧光定量PCR可检测到100个拷贝的IBRV和BVDV质粒DNA模板;临床样品检测结果表明,对保存在-70℃的127份牛病料样品核酸进行检测,IBRV阳性12份,BVDV阳性26份,IBRV和BVDV同为阳性2份,为混合感染,检测的拷贝数分别为6.24×105和6.32×104拷贝/μL。阳性样品经序列比对分析,分别与IBRV和BVDV的序列100%同源。建立的双重实时荧光定量PCR方法检测IBRV和BVDV具有特异、敏感等优点,可用于临床样品的鉴别检测。     

牛传染性鼻气管炎病毒SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法的建立

为检测牛传染性鼻气管炎病毒,通过设计针对gB基因的特异性引物扩增gB基因,构建阳性重组质粒。经过优化建立了牛传染性鼻气管炎病毒的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。结果显示,建立的实时荧光定量PCR检测方法在阳性标准质粒拷贝数在5.474×10⁴～5.474×10⁹拷贝/μL时线性关系良好,线性相关系数R²=0.999 3。该方法最低检测限为5.747×10²拷贝/μL;可以特异性检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV),与牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、牛副流感病毒(BPIV)、牛呼吸道合胞体病毒(BRSV)不发生交叉反应。病毒滴度与拷贝数的线性关系良好,线性相关系数R²=0.985 4。该方法为牛传染性鼻气管炎病毒的快速检测提供了技术支持。     

牛传染性鼻气管炎病毒内标荧光定量PCR检测方法的建立与应用

根据牛疱疹病毒1型(BHV1)gB基因序列,设计高度保守的引物和荧光探针,并扩增包含有荧光PCR扩增区域的核酸片段,通过凝胶纯化回收,将该片段克隆至pMD18-T载体,经鉴定后获得目标模板。通过碱基重排和引物设计,用搭桥法PCR扩增,获得BHV1荧光定量PCR内标模板。对内标模板的添加量和反应条件进行优化,建立了含有内标物的荧光定量PCR检测体系。该体系可以检测到10个拷贝/PCR反应的重组质粒,对BHV1可检测到0.01TCID50的病毒粒子,灵敏度比常规PCR和病毒分离高10～100倍,与不加内标的荧光PCR检测灵敏度相当。更重要的是,内标模板可以对反应体系进行监测,指示并校正假阴性结果,从而达到提高PCR检测准确率的目的。对临床收集的40份牛精液(其中8份已经鉴定为阳性)和10份牛鼻腔拭子(其中2份已经鉴定为阳性)用该体系进行检测,均得到预期结果。该方法的建立可用来对临床样品中BHV1的快速检测和实验室的质量控制。     

猫传染性鼻气管炎PCR检测方法的建立

本文通过设计特异性扩增猫疱疹病毒Ⅰ型gD基因的引物,使用猫三联弱毒苗为模板建立了检测猫疱疹病毒Ⅰ型的PCR诊断方法,并对其灵敏性、特异性进行了评价,并将建立的PCR检测方法对临床样品进行了检测。实验结果证实,本实验建立的猫疱疹病毒Ⅰ型的PCR检测方法,其灵敏度可达到最低可检测10^5拷贝的病毒含量;特异性试验结果仅能扩增出猫三联弱毒苗。     

虎源传染性鼻气管炎病毒巢式PCR检测方法的建立

为了建立虎源传染性鼻气管炎病毒巢式PCR(nested PCR)的快速鉴定方法,根据虎源传染性鼻气管炎病毒(FHV-1)的gD蛋白基因序列设计套式引物,进行特异性、敏感性和重复性实验,特异性试验表明,该方法可以特异扩增出FHV-1的gD基因片断,从猫泛白细胞减少症病毒、猫支原体和阴性对照的VERO细胞均未扩增出该条带,敏感性试验表明,nested PCR检测极限是1×10~2 copies/μl,而一步法PCR的有效扩增最低极限是1×10~5 copies/μl,前者的敏感性明显高于后者,重复性实验表明,不同情况下3次重复性试验,结果相同。用nested PCR对疑似感染FHV-1的样品进行检测,实验结果与病毒分离鉴定结果一致。本研究建立的nested PCR适用于野生猫科动物FHV-1感染的快速诊断与流行病学调查。     

奶牛传染性鼻气管炎病毒gG基因PCR检测方法的建立

本试验旨在建立一种PCR技术,既能快速检测牛传染性鼻气管炎病毒,又能区分同属病毒牛疱疹病毒5型和伪狂犬病病毒。根据基因库中牛传染性鼻气管炎病毒gG基因的特异性引物,建立PCR方法,对牛传染性鼻气管炎病毒参考毒株和阳性样本进行扩增,结果均能扩增出一条463 bp的特异性条带;对同属的牛疱疹病毒5型进行扩增,获得651 bp和431 bp两条带;对同属伪狂犬病病毒进行扩增,获得493 bp的条带;而非相关病毒(如猪呼吸与繁殖综合征病毒等),不能扩增出条带。对牛传染性鼻气管炎病毒的检测灵敏度为2×10^-3 PFU/mL。鉴于该方法具有良好的灵敏度和特异性,将在牛疱疹病毒感染诊断和标记疫苗免疫后的鉴别诊断方面具有良好的应用前景。     

牛传染性鼻气管炎病毒gE基因LAMP检测方法的建立

根据Gen Bank收录的BHV-I NM06株的gE基因序列,利用软件Primer Explorer V4设计2对LAMP引物,建立IBRV gE基因的LAMP检测方法;利用重组质粒进行了敏感性检测,利用IBRV、牛病毒性腹泻-黏膜病病毒、牛轮状病毒等进行特异性试验,并对临床采集的50份奶牛鼻腔拭子DNA进行了检测。结果显示,建立的LAMP方法能对重组质粒DNA产生阳性反应,在58℃~65℃8个温度进行反应,结果无肉眼可见差异,反应最短时间达90 min时可见到阳性结果;该方法的检测下限是1.68×10~4拷贝/μL,对6种其他微生物呈阴性反应;50份临床样品中检出2份阳性。表明本研究初步建立了IBRV gE基因的LAMP快速检测方法,可用于IBRV分离株的鉴定以及临床样品的快速检测。