Luteolin prevents fMLP-induced neutrophils adhesionvia suppression of LFA-1 and phosphodiesterase 4 activity

Luteolin is an active ingredient found early from Folium perillae and Flos lonicerae, and has a specific inhibition on phosphodiesterase 4(PDE4) activity in vitro. Researches show luteolin has pharmacological effects of anti-inflammation, anti-anaphylaxis, antitumor, antioxidant, protection of nervous system and so on, and has mainly been used for the treatment of respiratory inflammatory diseases, cancer and cardiovascular disease in clinic. PDE4, specific to hydrolyze cyclic AMP(c AMP), is considered to be a new anti-inflammatory target due to the decisive role on c AMP signal in inflammatory cells such as neutrophils. In order to explore the anti-inflammatory mechanism, we further studied the effects of luteolin on the activity and expression of PDE4, the expression of lymphocyte function-associated antigen-1(LFA-1) and macrophage-1(MAC-1) in neutrophils, and the adhesion of neutrophils and endothelial cells. The results showed that luteolin had a dose-dependent inhibition on both bare PDE4 activity and PDE4 in cultured neutrophils, and had an obviously promotive effect on gene expressions of PDE4 A, 4B and 4D in later period. Luteolin had a significant inhibitory effect on neutrophils adhesion and LFA-1 expression in early stage, and had no obvious effect on MAC-1 expression. Therefore, luteolin can inhibit LFA-1 expression of neutrophils, then inhibit the adhesion of neutrophils and endothelial cells, and the mechanism is at least related with the inhibition of PDE4 activity.     

Influence of gallic acid on porcine neutrophils phosphodiesterase 4, IL-6, TNF-α and rat arthritis model

Our previous studies showed that the anti-inflammatory effects of Paeonia lactiflora roots extract may be mediated, at least in part, through its gallic acid content, and this effect may be regulated in part by an inhibition on cAMP-phosphodiesterase (PDE). To explore the anti-inflammatory effect and mechanism, the influence of gallic acid on neutrophils PDE4 activity and expression, TNF-α and IL-6 content and rat arthritis model were further studied. PDE4 activity and gene express were calculated respectively by substrate cAMP change examined with HPLC and real-time RT-PCR. The concentration of IL-6 and TNF-α in supernatant were assayed by ELISA method. Model of rat arthritis was caused by complete Freund’s adjuvant. Results showed that gallic acid had a dose-dependent restraint on PDE4 activity of neutrophils in vitro, promoted significantly PDE4A expression (P<0.01), and had no influence on the expressions of PDE4B and 4D. However, PDE4C expression was not detected. Gallic acid could promote IL-6 release (P<0.05), and inhibit TNF-α release of neutrophils (P<0.05). The experiment in vivo showed that gallic acid had obvious restraint on local inflammation of animal model (P<0.05). Therefore, the anti-inflammatory effect of gallic acid may be mediated in part through an inhibition on PDE4 activity and further an increase of IL-6 and a decrease of TNF-α of neutrophils, and this effect seemed to have no relationship with PDE4 expression.     

猪LFA-1和CTLA-4实时荧光定量PCR检测方法的建立

摘要：【研究目的】建立猪LFA-1和CTLA-4实时荧光定量PCR检测方法。【方法】根据GenBank中核苷酸序列设计猪淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)和细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4(CTLA-4)的特异性引物,经RT-PCR扩增、目的片段与载体连接转化以及重组质粒的鉴定,并对重组质粒标准品和样品cDNA进行检测,构建LFA-1和CTLA-4荧光定量RT-PCR标准曲线。【结果】以1×109~1×102拷贝/μL不同稀释水平的标准品进行荧光定量PCR扩增后,统计学分析显示标准品浓度的对数与Ct值之间存在良好的线性关系（LFA-1：RSq =0.992;CTLA-4：RSq =0.994）;样品检测显示LFA-1与CTLA-4引物的扩增曲线图和熔解曲线图的特异性。【结论】所构建的质粒标准品具有线性关系好、重复性好、敏感性高等特点,以及其引物在样品检测中的可应用性,为分析猪免疫细胞在感染病毒前后LFA-1和CTLA-4表达的变化以及评估猪体免疫功能,提供必要的技术平台。     

鸡GDE4编码基因的克隆与分析

为了揭示鸡甘油磷酸二酯磷酸二酯酶4（GDE4）的结构和功能,采用逆转录PCR的方法克隆了其编码cDNA序列,并对其进行了详尽的生物信息学分析。结果表明,鸡GDE4 编码cDNA含有939个核苷酸袁编码312个氨基酸;鸡GDE4具有典型甘油磷酸二酯酶蛋白结构域,是一种跨膜蛋白;GDE4是一种进化保守蛋白,在物种间具有较高的一致性;鸡GDE4的三维结构与磷酸丙糖异构酶桶状结构域结构相似,并且其催化位点位于其中。     

新生儿败血症血清降钙素原和可溶性细胞间黏附分子-1的变化

目的 观察新生儿败血症患儿血清降钙素原(PCT)和可溶性细胞间黏附分子-1(sICAM-1)的变化.方法 新生儿败血症患儿56例,其中30例患儿血培养阳性(病原确诊组),26例血培养阴性(临床诊断组),取同期出生的新生儿25名作为对照组,分别应用化学发光法和酶联免疫吸附法测定患儿血清PCT和sICAM-1水平,同时进行...     

血清可溶性细胞间粘附分子在大肠癌患者组织中的检测及其意义

目的:探讨血清可溶性细胞间粘附分子1(sICAM-1)的检测在大肠癌患者中的临床意义。方法:采用双抗体夹心ELISA法检测50例大肠癌、30例大肠良性病变及30例健康体检者血清sICAM-1水平,并比较大肠癌患者术前、术后,转移、无转移sICAM-1水平变化。结果:大肠癌患者血清sICAM-1水平明显高于良性病变患者及正常人(P<0.01);大肠癌患者术后血清sICAM-1水平较术前明显下降(P<0.01);有转移的大肠癌患者血清sICAM-1水平高于无转移的患者(P<0.01)。结论:血清sICAM-1水平与大肠癌的发生、发展密切相关,可作为大肠癌新的检测指标之一。     

洛克沙胂对猪肝微粒体CYP3A4及CYP2E1蛋白的影响

洛克沙胂是一种常用的饲料添加药物,细胞色素P450酶系(CYP或P450)是动物体内药物代谢的主要酶类。本文研究了洛克沙胂对猪肝微粒体P450酶系中的2种酶CYP3A4和CYP2E1的蛋白表达的影响,为揭示该药的代谢机理、残留机制以及临床安全用药提供理论依据。实验将洛克沙胂以5、25和125mmol/L 3个剂量,分别添加到猪肝微粒体体外孵育体系中,以生理盐水作对照,于37℃孵育1h,测定微粒体蛋白含量及CYP3A4及2E1的蛋白表达。结果表明中剂量和高剂量的洛克沙胂对猪肝细胞微粒体的CYP3A4及2E1的蛋白表达均呈现抑制作用,而低剂量的洛克沙胂对CYP3A4和CYP2E1的蛋白表达影响很小。     

香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种的快速检测与鉴定

【目的】从香蕉枯萎病菌１号和４号生理小种特有的基因序列入手,建立一种快速可靠的分子检测技术,为防止香蕉枯萎病的传播蔓延、尽早采取防治对策、指导香蕉生产进行品种配置提供理论依据。【方法】根据研究室已经筛选到的4号生理小种候选致病相关基因序列设计引物,分别以来自海南、广东和广西的6个香蕉枯萎病菌1号生理小种菌株、7个4号生理小种菌株、7个尖镰孢其它专化型菌株以及2个外围菌株DNA为模板进行PCR扩增,筛选香蕉枯萎病菌1号、4号生理小种特异性引物及尖镰孢菌的通用引物。【结果】筛选到的特异性引物不仅可用于香蕉枯萎病菌DNA的检测,还可直接用于对罹病香蕉组织和土壤中的香蕉枯萎病菌的检测;筛选到的尖镰孢菌通用引物,可作为内参照以检测DNA的质量,以避免假阴性情况的出现。【结论】所建立的三重PCR检测方法实现了在一次PCR反应中快速、准确地同步检测香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种,对检测香蕉苗是否感染枯萎病及蕉园土壤是否受到香蕉枯萎病菌的污染具有重要意义。     

嗜水气单胞菌J-1株粘附素及其受体分析

以EPC细胞和HEp-2细胞为细胞模型，用嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila,Ah)J－1株进行粘附试验，同时以Ah4型菌毛的抗血清作粘附抑制试验，用以分析AhJ-1株的粘附素及其受体。EPC细胞粘附和粘附抑制试验证实，Ah J-1株粘附素受体具有甘露糖、胆固醇成分，有少量半乳糖成分，无葡萄糖成分。HEp-2细胞粘附和粘附抑制试验证实，与其它非菌毛粘附素如S层及外膜蛋白相比，Ah4型菌毛的粘附作用较为显。抗4型菌毛抗体和抑制细菌的粘附力达80％以上。抗S层、外膜蛋白抗体也能使细菌的粘附力下降，表明Ah的粘附作用由菌毛粘附素与非菌毛粘附素共同参与。     

pGEX-4T-1-cMC4R原核表达载体的构建与表达

[目的]构建犬MC4R基因编码区的融合表达载体并在大肠杆菌中诱导表达融合蛋白。[方法]以Beagle犬基因组DNA为模板,经PCR技术扩增目的片段,利用LP Recco PCR克隆技术将目的片段直接重组到原核表达载体pGEX-4T-1上,转化到E.coliDH5α,筛选阳性克隆,BamHI、XhoI酶切鉴定,DNA测序检测插入序列的正确性。将测序正确的重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC4R转化到E.co-liBL21内,经IPTG诱导后,利用SDS-PAGE检测犬MC4R蛋白的表达。[结果]成功构建重组表达质粒pGEX-4T-1-cMC4R,经DNA测序证实插入序列与设计基本一致,只有777位碱基T变成了C,这是由于犬MC4R编码区存在的多态性引起,对表达的犬MC4R蛋白序列无影响。大肠杆菌诱导后表达出犬MC4R融合性蛋白。[结论]成功构建犬MC4R原核表达载体,此重组体能在E.coliBL21内表达犬MC4R融合蛋白,为进一步获取犬MC4R的单克隆抗体奠定物质基础,也为研究犬MC4R蛋白的结构和生理功能提供帮助。     

山慈菇提取液对小鼠4T1乳腺癌细胞抑制作用机制的研究

探索山慈菇提取液对小鼠4T1细胞抑制作用机制。采用水煎法制备山慈菇提取液,MTT比色法检测小鼠4T1细胞的增殖活性,Annexin V/PI双染流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡。结果表明,山慈菇提取液对4T1细胞有明显的增殖抑制作用(P0.05),并呈剂量依赖关系。山慈菇提取液诱导小鼠4T1细胞凋亡效果明显,并有剂量依赖性。山慈菇提取液对小鼠乳腺癌细胞有明显的增殖抑制和诱导其细胞凋亡的作用。     

水稻铵转运蛋白基因OsAMT1;4 和OsAMT5的特征分析、功能和表达

 【目的】阐明水稻铵转运蛋白基因OsAMT1;4 和OsAMT5的编码蛋白特征、功能和表达。【方法】采用生物信息学技术，揭示目的基因的编码蛋白特征；通过铵离子吸收缺陷的酵母突变体功能互补技术，鉴定上述基因编码蛋白的功能；采用RT-PCR技术，研究基因的表达特征。【结果】OsAMT1;4和OsAMT5的编码阅读框为1 497 bp和1 377 bp，分别编码498和458个氨基酸残基。OsAMT1;4和OsAMT5均具有11个跨膜域，分别归属与AMT1和AMT2亚家族。OsAMT1;4和OsAMT5均具有使NH4+吸收缺陷的酵母突变体重新恢复吸收NH4+的能力。OsAMT5在叶中特异表达，随NH4+浓度增加表达增强；在不同NH4+浓度和时间处理中，根、叶均未检测到OsAMT1;4的转录本。【结论】OsAMT1;4和OsAMT5在水稻中具有吸收或转运NH4+的功能。OsAMT5为叶特异表达，OsAMT1;4的表达受到NH4+因子外其他因素的调节。     

NCOA1、OPN和RBP4基因对仔猪初生重和30日龄体重的影响

采用PCR-RFLP方法检测了NCOA1基因,OPN基因和RBP4基因的多态性,并且分析了不同基因型对仔猪出生重和30日龄体重效应的大小。结果表明:NCOA1基因可显著影响仔猪的30日龄体重,AA型个体比BB型个体增重显著(P0.05)。而OPN和RBP4基因的不同基因型对这2个性状的效应差异均不显著。在试验群体内,NCOA1基因可作为一个有效的候选基因进行研究应用,而OPN和RBP4基因还需进一步扩大样本量进行相关性分析。     

溴化法与氯化法合成杀菌剂甲环唑

以1，2-丙二醇、间二氯苯、1H-1，2，4-三氮唑等为原料，分别用溴化法与氯化法对1-[2-（2，4-二氮苯基）-4-甲基-1，3-二氧戊环-2-基]甲基1-1H-1，2，4-三氮唑（以下称甲环唑）的合成进行了研究。合成产物得到核磁共振与气相色谱/质谱确认。溴化法总收率63.2%，产物纯度可达84%以上。氯化法总收率36.9%，产物纯度60%左右。对关键步骤中的反应时间与温度对产物质量及收率的影响进行了比较与分析，并就甲环唑预防白粉病菌侵染黄瓜进行了初步试验。     

绵羊肌内前体脂肪细胞CNR1和FABP4基因表达研究

为研究绵羊脂肪细胞增殖分化过程中参与动物能量代谢调控的大麻素受体1（cannabinoid receptor 1）基因CNR1和调控脂肪沉积的脂肪酸结合蛋白4（fatty acid binding protein 4）基因FABP4的表达规律和差异,采集一只3日龄湖羊羔羊背最长肌组织,背肌组织经Ⅱ型胶原酶消化后分离观察原代前体脂肪细胞;开展前体脂肪细胞培养并绘制生长曲线;应用胰岛素、地塞米松和3-异丁基-1-甲基黄嘌呤诱导前体脂肪细胞后,采用油红O染色观察成熟脂肪细胞形态;收集不同分化时间点细胞,应用实时荧光定量PCR方法测定CNR1和FABP4基因表达量。结果表明,羔羊背最长肌组织成功分离出了前体脂肪细胞,贴壁细胞呈梭形;诱导前体脂肪细胞经油红O染色后观察到脂滴形成,具有脂肪细胞特征;CNR1和FABP4基因表达量在诱导分化早期均较低,但在诱导分化中后期表达量逐步升高;CNR1和FABP4基因表达量在诱导分化后的第2、第4和第8天均差异不显著,但FABP4基因在第12天的表达量显著高于CNR1基因。上述结果为进一步探究绵羊CNR1和FABP4基因调控关系及利用两基因改良绵羊肉品性状提供了参考数据。     

小麦水通道蛋白基因 TaTIP1-1c-4BL的克隆与表达分析

为探究 TaTIP1-1c-4BL基因在小麦响应缺水胁迫中的作用,采用PCR扩增的方法从小麦‘科农199’cDNA中获得 TaTIP1-1c-4BL基因。生物信息学分析显示该基因编码区全长753 bp,共编码250个氨基酸。TaTIP1-1c-4BL蛋白具有6个跨膜域,为非分泌型、弱酸性、稳定型、疏水性蛋白。系统发育分析显示‘科农199’与来自粗山羊草和大麦的水通道蛋白亲缘关系较近。表达分析显示 TaTIP1-1c-4BL基因在小麦根、茎、叶、籽粒及颖壳中均有表达,在茎中表达量最高。在PEG胁迫下,该基因的表达量下调,表明该基因在小麦应对干旱胁迫过程中具有负调控作用。在NaCl、ABA及H₂O₂胁迫下,表达量先下调后上调,推测该基因参与了某些抗逆信号的传导。     

毛白杨4-香豆酸:辅酶A连接酶可溶性原核表达及活性检测

为了进一步研究毛白杨4CL1的酶学特性,构建了毛白杨4CL1原核表达载体pQE31-4CL1．经IPTG诱导在大肠杆菌中表达了毛白杨4CL1蛋白,SDS-PAGE电泳分析表明该新蛋白的分子量为60 kD,与预测值一致．对毛白杨4-CL1蛋白在大肠杆菌中的表达体系进行了优化,确定IPTG的最佳浓度为0.4 mmol/L,诱导时的菌液密度OD600为0.3～0.5,最佳表达时间为2 h．37℃下表达的4CL1融合蛋白以包涵体的形式存在,没有生物学活性．当表达温度从37℃降低为28℃时,可溶性的有生物学活性的毛白杨4CL1蛋白诱导表达获得成功,表达量达11%．以耦联有Ni2+-NTA的琼脂糖为亲和层析填料,金属鳌合亲和柱层析一步纯化获得了电泳纯4CL1蛋白,4CL1蛋白对5种底物的比活性分别为:4-香豆酸3 949.0 pkat/mg,咖啡酸2 214.0 pkat/mg,阿魏酸715.0 pkat/mg,肉桂酸84.9 pkat/mg,而对芥子酸没有生物活性．      

反义4CL1基因转化烟草调控木质素生物合成

将控制木质素生物合成的关键限速酶 (香豆酸CoA连接酶 ,4CL)基因 4CL1反向插入植物表达载体pBI12 1构建表达载体 ,通过农杆菌叶盘法介导转化烟草 ,获得一批转基因抗性植株 .经PCR检测 ,证明 4CL1基因已成功反义转入到烟草植株中 .通过对转基因植株和对照植株的纤维素和木质素含量的对比分析 ,发现反义 4CL1基因转化植株的纤维素含量比对照提高了 11 4 % ,而木质素含量比对照降低了 19 1% .     

高/低Cd累积苋菜品种金属累积特性与关键转运基因表达的关系

采用受污染菜园土进行盆栽试验,研究对Cd累积特性不同的苋菜品种(Amaranth mangostanus L.)对金属的吸收差异。白骨小圆叶油苋菜及正泰小圆叶苋菜地上部分Cd含量分别为(0.116±0.007)mg·kg-1和(0.146±0.002)mg·kg-1,台湾白苋菜及红柳叶苋菜地上部分Cd含量分别为(0.210±0.005)mg·kg-1和(0.349±0.026)mg·kg-1,相比而言前两者属Cd低累积品种,后两者属Cd高累积品种。由于红柳叶苋菜与白骨小圆叶油苋菜Cd含量差异最大,可通过测定两者根系IRT1及HMA4基因表达量,以研究高/低Cd累积特性苋菜品种对金属吸收的差异及其与相关转运蛋白的关系。结果显示,苋菜根系共质体Cd与Fe、Pb的吸收呈极显著正相关(P0.01)。红柳叶苋菜根系原生质体Fe、Cd及Pb含量显著高于白骨小圆叶油苋菜,同时其根系IRT1表达量高于白骨小圆叶油苋菜,表明苋菜根系IRT1基因的较高表达有助于根系从土壤吸收Fe外,可能有助于Cd与Pb的累积。苋菜地上部分Cd与Zn、Fe的吸收呈显著正相关(P0.05),与Pb、Mn、Ca的吸收呈极显著正相关。红柳叶苋菜地上部分Ca、Fe、Mn、Cd、Pb的含量显著高于白骨小圆叶油苋菜,同时其根系HMA4基因表达量高于白骨小圆叶油苋菜,表明苋菜HMA4基因的较高表达可能有利于苋菜将根系吸收的Cd等金属转运至茎叶。     

SSEA-1、SSEA-3、Oct-4及hTERT在人胚胎生殖细胞中的表达

分离5~9周人胚胎生殖腺嵴和背侧肠系膜,采用组织块法进行体外培养,免疫细胞化学染色法检测SSEA-1、SSEA-3、Oct-4及hTERT在人胚胎生殖细胞中的表达,以证实利用组织块体外培养所获得的细胞为未分化的人胚胎生殖细胞。结果表明:组织块体外培养得到的细胞或细胞集落均阳性表达SSEA-1、SSEA-3、Oct-4及hTERT,说明组织块体外培养获得的细胞为未分化的人胚胎生殖细胞。