半番鸭与番鸭精巢组织差异表达转录组测序分析

【目的】研究半番鸭与番鸭精巢组织转录组差异表达基因,为进一步阐明半番鸭不育的遗传机制奠定理论基础。【方法】利用转录组测序方法对半番鸭和番鸭的精巢组织进行研究,筛选其差异表达基因,并对其功能进行注释和荧光定量PCR(quantitative real-time PCR,QRT-PCR)验证。【结果】测序共获得43.84Gb Clean Data,组装后共获得193 535条Unigene。DESeq分析发现3 597个基因在两个鸭品种间差异表达,其中上调基因1 194个和下调基因2 403个,包括与生殖功能相关的基因,如成纤维细胞生长因子(fibroblast growth factor,FGF)、蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)、丝裂原活化蛋白激酶7(mitogen-activated protein kinase 7-like,partial,BMK)、生长因子受体结合蛋白2(growth factor receptor-bound protein 2,GRB2)、c-Jun氨基末端激酶(c-Jun N-terminal kinase,JNK)和肿瘤坏死因子受体超家族成员6(tumor necrosis factor receptor superfamily member 6,FAS)等。GO(gene Ontology)分析发现382个差异基因获得功能注释,其中97个基因涉及发育繁殖生物学过程。KEGG(kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)通路分析表明差异表达基因共富集到50条信号通路中,其中17个通路显著富集,包括丝裂原活化蛋白激酶信号转导通路(mitogen-activated protein kinase signaling pathway,MAPK)、甘油酯代谢(glycerolipid metabolism)以及钙信号途径(calcium signaling pathway)信号通路等,与生殖功能密切相关的有促性腺激素释放激素信号通路(gonadotropin releasing hormone(Gn RH)signaling pathway)和MAPK信号转导通路。经QRT-PCR验证,差异基因表达变化模式与转录组测序结果一致,测序结果可靠。【结论】在转录组水平上筛选出半番鸭和番鸭精巢组织差异表达基因,揭示了Gn RH和MAPK信号通路在鸭的生殖活动中发挥了重要作用,为进一步探索半番鸭生殖系统的分化机理提供可靠的参考依据。     

基于高通量测序分析肺炎支原体感染姜曲海猪肺组织miRNA表达谱

为探明姜曲海猪感染肺炎支原体后肺组织miRNA(microRNA)表达谱和分子机制,选取50日龄姜曲海猪为实验猪,随机分成感染组和对照组,人工感染肺炎支原体28 d后,采集肺部组织,进行高通量miRNA测序,采用生物信息学软件进行miRNA鉴定和靶基因预测。结果显示:感染组和对照组的肺组织分别筛选到14 265 786条和14 000 588条小RNA纯净序列(clean reads)。与对照组相比,感染组中筛选到73个显著差异表达的miRNAs,其中39个表达上调,34个表达下调,从中随机选取4个miRNAs进行定量PCR(quantitative real time PCR,qRT-PCR)验证,感染组和对照组的表达水平与测序结果基本一致。73个差异表达miRNAs预测到1 685个靶基因和4 220个靶位点,靶基因预测筛选到8个与免疫调控相关的miRNAs。靶基因GO(gene ontology)分析显示,miRNA广泛参与生物过程、细胞组成和分子功能的调控。靶基因KEGG(Kyoto encyclopedia of genes and genomes)分析显示,miRNA参与调控细胞凋亡、ECM受体相互作用、粘附斑通路等信号通路。本研究通过高通量测序获得姜曲海猪感染肺炎支原体后肺组织miRNA表达谱,通过生物信息学分析筛选到与免疫调控相关的miRNAs和信号通路,为进一步阐明姜曲海猪的肺炎支原体感染机制奠定了基础。     

甘薯病毒病原相关的microRNA的挖掘及分析

【目的】甘薯的病毒种类比较多,不同的病毒感染会引起相应的症状变化,田间自然发病的甘薯表型不一,这可能与病毒感染类型有关。论文旨在鉴定和研究甘薯中与不同甘薯病毒感染相关的microRNA（miRNA）。【方法】采用Illumina公司高通量测序技术,对来自福建泉州地区同一品种（龙薯9号）、具有不同症状的叶片样本（畸形黄化、疱疹、褪绿矮化和曲叶,样本编号分别为Fj01、Fj02、Fj03和1H）进行高通量测序,利用生物信息学手段挖掘和分析差异表达miRNA,并对差异miRNA和病毒表达进行PCR验证,鉴定基因和病毒在样本中表达情况,分析测序数据的可靠性,利用生物信息学分析进行miRNA靶基因预测和功能分析,探究差异miRNA与病毒种类的相关性。【结果】通过与病毒数据库的比对,发现Fj01、Fj02、Fj03样本（除1H外）均感染了甘薯常见病毒,如甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus,SPCSV）、甘薯病毒2号（Sweet potato virus 2,SPV2）、甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus,SPFMV）、甘薯G病毒（Sweet potato virus G,SPVG）、甘薯C病毒（Sweet potato virus C,SPVC）等,但Fj01、Fj02和Fj03这3个样本的症状并不一致,样本之间只在甘薯不常见的病毒种类中有差异,通过PCR验证了SPFMV和SPVC病毒在样本中的表达情况与测序数据基本一致。在4个样本中共鉴定出679个已知的miRNA和1 004个新的miRNA,通过配对比较分析,其中288个已知的miRNA和433个新的miRNA在4个样本之间有差异性表达,并且这些miRNAs,如miR-156、miR-157、miR-166等家族的成员在4个样本中表达模式各异。同时,采用实时荧光定量PCR验证几个差异miRNAs（如miR-156、novel-miR-40和miR-319m）在各个样本间的表达情况与测序结果基本一致,另外,与脱毒苗样本进行比较,检测到3个miRNA（miR-160a、miR-2096和miR-5387b）在4个症状样本中具有不同程度的上调表达,证明miRNA的表达与植株的表型有关。通过对miRNA靶基因的预测与分析,发现这些差异miRNA的靶基因多数为转录调控因子,编码蛋白多含有ZFP、WD、Myb、SPL等功能区域,这些因子多参与调控植物的基因、代谢通路和抗原识别等来调控植物生长发育、形态建成和抗逆性,表明这些miRNA靶基因的功能多样性。【结论】不同病毒感染确实能够引起miRNA差异表达,并且这些miRNA通过其靶基因参与调控植物的生长发育、抗胁迫性和防御。     

山麻鸭开产期和产蛋高峰期卵巢组织转录组分析

【目的】探明山麻鸭开产期和产蛋高峰期卵巢组织的转录组差异,丰富蛋鸭转录组数据信息。【方法】选取6份山麻鸭卵巢组织样品（开产期和产蛋高峰期各3份）,利用Illumina HiSeq^TM 2000进行高通量测序,构建山麻鸭开产期和产蛋高峰期卵巢组织转录组文库,并用测序评估、基因功能注释等生物信息学方法进行分析。【结果】经过测序获得质量不低于20的碱基比例（Q20）均高于93%;开产期获得了43 489 798条reads,4 380 847 061 bp数据量;高峰期获得了42 782 676条reads,4 307 499 083 bp数据量;分别有70.92%和72.70%的reads能比对到鸭参考基因组序列上。对开产期与产蛋高峰期转录组进行比较,发现开产期有26 808个表达基因,产蛋高峰期有27 013个表达基因,与开产期为参考,在高峰期卵巢组织中共获得1 929个差异表达基因,其中上调基因989个,下调基因940个;进一步将这些差异基因在Nr数据库进行注释,发现获得注释的基因有1 423个,其中上调基因695个,下调基因728个;COG功能注释分析发现这些差异表达基因共获得663个功能注释,涉及25个功能分类;GO 功能注释分析表明,有1 122个基因获得GO 功能注释,可以分为61个功能分类,这些分类主要涉及到分子绑定、催化活性、细胞过程、生物调节等诸多生理生化过程,其中涉及到发育繁殖生物学过程的相关注释基因有406个;KEGG分析发现共有425个基因注释到160个代谢通路中,其中GnRH信号通路、GPI-anchor生物合成、TGF-β信号通路、核糖体生物合成等通路显著富集。GnRH信号通路和TGF-β信号通路在卵巢的生理生殖活动发挥了重要作用,而GPI-anchor生物合成和核糖体生物合成,这两类代谢通路在卵巢生理生殖活动的作用尚不明确。【结论】利用高通量测序技术对山麻鸭开产期和产蛋高峰期卵巢组织的转录组进行测序和分析,揭示了山麻鸭不同生理状态下卵巢组织差异表达基因的数量,获得了差异表达基因的功能、分类和代谢通路。为丰富蛋鸭卵巢组织转录组信息,为开展蛋鸭产蛋性状相关基因的研究及分子调控机制研究奠定基础。     

小鼠中年期和老年期睾丸组织转录组分析

为丰富小鼠睾丸组织转录组研究领域的基础数据,对中年期(180日龄)和老年期(360日龄)小鼠睾丸组织进行转录组测序分析,在中、老年期分别获得25 187 980个和28 840 576个可用Reads,比对到参考基因组上的Reads分别有18 861 721和22 355 657个,占总读数的74.88%和77.51%,并检测到中、老年期小鼠睾丸组织中分别有17 770和18 073个基因表达。以中年期为对照,老年期睾丸组织中下调基因122个,上调基因185个,其中可清楚注释的基因共285个。GO分析发现285个差异表达被归纳到生物过程、细胞组分与分子功能3个大类的25个小类,主要涉及膜、氧化还原过程、转运蛋白活性、生殖发育及衰老等。KEGG分析发现差异表达基因涉及139个信号通路,主要代谢通路为信号转导、脂代谢、碳水化合物代谢、内分泌系统和神经系统等生物学机制。差异表达基因中RPKM1的有57个,其所涉及信号通路主要为脂代谢、固醇类激素生成、TNF信号通路、补体系统、胰岛素和溶酶体等。     

北京油鸡和来航鸡脾脏差异表达microRNA的鉴定与分析

【目的】明确北京油鸡和来航鸡脾脏重量、组织结构及其miRNA表达谱的差异,筛选与两个鸡种免疫应答能力差异相关的候选基因,为家禽抗病育种研究奠定基础。【方法】选取1日龄同期孵化的北京油鸡和来航鸡母雏各45只作为试验材料,在相同营养水平和环境条件下饲养,42日龄测量体重和脾脏重。每个品种随机选取3只个体（体重接近群体均值）,取其一半脾脏组织制作石蜡切片,利用H.E.染色,显微镜下观察脾脏组织结构、脾小体的数量和动脉周围淋巴鞘厚度。提取另一半脾脏组织中的小RNA,等量混合组成2个RNA池,构建cDNA文库,利用Solexa平台进行高通量测序。测序结果与参考基因组数据库比对获得表达基因。利用Mireap软件预测新miRNAs基因。利用RPKM（reads per kb per million reads）方法计算基因的表达量,根据FDR（false discovery rate）＜0.001和|log₂ ratio(T/CK)|≥1的标准筛选差异表达的基因。利用TargetScan和Pictar软件预测差异表达miRNA的靶基因,并对其进行GO和KEGG数据库功能注释。利用DAVID软件对靶基因蛋白进行富集分析。将预测靶基因与已知脾脏重和脾脏指数相关QTL区域注解的基因取交集。【结果】在42日龄,北京油鸡的体重和脾脏重均显著高于来航鸡（P＜0.01）。组织学观察显示,两个鸡种的脾脏组织结构发育完整,可见清晰的白髓、红髓、脾小结和动脉周围淋巴细胞鞘。与来航鸡相比,北京油鸡脾小体的数量更多、动脉周围淋巴鞘更厚,鞘内淋巴细胞也更为密集。高通量测序在两组样本共鉴定出486种已知miRNA 、130个候选miRNA 和216个共表达miRNA 。两组间显著差异表达的miRNA共计35种,其中在北京油鸡中有8个表达上调,27个表达下调,它们的变化倍数在1.002-10.41之间。差异基因表达丰度在前5位的miRNA是miR-2954、miR-6606-5p、miR-146b-5p、miR-21-3p和miR-21-5p,对其2 767个靶基因的生物信息学分析结果显示,它们参与了T和B淋巴细胞的分化、免疫器官的发育、蛋白质磷酸化和细胞形态发生等生物学过程,并在泛素介导的蛋白水解、凋亡和磷脂酰肌醇信号系统等14个通路中显著富集。miR-6606-5p、miR-146b-5p的共同靶基因BLM和miR-2954的靶基因IRF8均定位于脾重或脾指数相关的QTL区域。【结论】（1）42日龄北京油鸡和来航鸡脾重、组织结构及其miRNA表达谱的确存在一些差异。（2）某些重要的差异高丰度表达miRNA(如miR-2954、miR-6606-5p、miR-146b-5p 、miR-21-3p和miR-21-5p ) 可能通过对靶基因调控,来参与调节T、B淋巴细胞分化、增殖、激活等过程,进而影响脾脏的重量、组织结构及其免疫应答能力。     

应用Solexa测序技术挖掘山羊卵巢组织microRNA

【目的】旨在构建、分析山羊卵巢组织miRNA表达谱,为进一步研究特定miRNA与山羊卵泡发育及性激素分泌等相关生殖活动的关系奠定理论基础。【方法】首先从山羊卵巢组织总RNA中分离小片段RNA,然后进行Solexa测序和生物信息学分析,最后利用q-PCR技术验证miRNA在山羊卵巢组织中的表达。【结果】共鉴定出508个山羊卵巢组织表达的miRNA和19个对应的miRNA*,这些miRNA在哺乳动物（绵羊、牛、猪、马、狗）进化过程中高度保守;q-PCR验证了8个miRNA在山羊卵巢组织中的表情况,定量结果与测序结果一致。【结论】成功构建了山羊卵巢组织miRNA表达文库,山羊卵巢组织miRNA表达丰富且其表达量各异。     

藏绵羊不同毛色皮肤组织miRNA表达谱及靶基因分析

【目的】藏绵羊又称藏系绵羊,是中国三大粗毛羊品种之一,主要分布在西藏及其毗邻的高寒牧区,如青海、甘肃、四川、云南等地。藏绵羊由于其被毛纤维粗长,毛质细腻且保暖性好,是制造藏式地毯的上好原料。而毛色作为一种重要的经济性状,同时制约羊毛的经济价值。然而,目前对于绵羊毛色的分子调控机制尚不明确,以藏绵羊为研究对象,对其不同颜色皮肤组织（黑色和白色）进行转录组测序,旨在探讨miRNA在藏绵羊不同毛色皮肤组织转录后水平中发挥的作用及其可能参与的调控通路。【方法】选取2只具有黑白花毛色的健康藏绵羊,减去体侧被毛使皮肤完全裸露并用75%酒精消毒处理,屠宰后快速切取皮肤组织并保存在组织样品保存液中防止RNA降解,提取RNA后通过miRNA测序和生物信息学分析,获得藏绵羊不同毛色（黑色和白色）皮肤组织miRNA表达谱,筛选组织差异表达miRNA并预测相关靶基因。通过靶基因分析,获得与调控藏绵羊毛色性状可能相关的信号通路。【结果】黑色和白色皮肤组织共获得85.76兆条原始读长,经过滤后得到85.08兆条clean reads;共鉴定出334个已知的miRNA和59个新的miRNA;从中获得23个差异表达miRNA,其中14个差异表达miRNA在白色皮肤组织中表达显著上调,9个表达下调。miR-2284b和miR-744仅在藏绵羊白色皮肤中表达,而miR-23b、miR-411a-5p、miR-30c、miR-423-3p和miR-324-5p则仅在藏绵羊黑色皮肤中表达,但表达量相对较低。表达量最高的miRNA为miR-10a,而倍数差异最大的为miR-23b。其中,miR-10a可参与调节多种信号通路,其作用涉及增殖、分化、凋亡、细胞粘附等各个方面,目前并无调控绵羊毛色方面的相关报道,但其功能及作用机制的研究仍在不断扩展。miR-23b则与Wnt、Notch等信号通路有关,这些信号通路中的部分基因也和黑色素的生成有密切关系。结合倍数差异和miRNA表达量分析,miR-411a-5p、miR103和miR-200b可能也和毛色调控密切相关。本研究共预测出981个靶基因可能参与毛色调控,多数基因和WNT信号通路、MAPK通路、EDNRB信号通路及黑素原生成通路（melanogenesis pathway）相关,其中黑素原生成通路显示和WNT信号通路、KIT信号通路及EDNRB信号通路相互关联。黑素原生成通路显示藏绵羊不同毛色可能最终通过MITF基因调控下游的TYR基因（酪氨酸酶基因）影响黑色素的合成。同时,筛选7个差异表达miRNA进行定量验证,结果表明,5个miRNA在黑色皮肤组织中上调表达,2个miRNA在白色组织中上调表达,定量结果与测序结果一致。【结论】获得了藏绵羊皮肤组织miRNA表达谱,并通过生物信息学分析得到可能和调控毛色性状相关的miRNA和信号通路。这些结果表明,藏绵羊毛色性状可能受到多种miRNA的调控并涉及多个信号通路,这有助于更进一步了解毛色转录后水平的调控过程,并对进一步的功能验证奠定基础。     

Cold stress responsive microRNAs and their targets in Musa balbisiana

Cold stress is an environmental factor affecting plant development and production. Recently, microRNAs (miRNAs) have been found to be involved in several plant processes such as growth regulation and stress responses. Although miRNAs and their targets have been identified in several banana species, their participation during cold accumulation in banana remains unknown. In this study, two small RNA libraries were generated from micropropagated plantlets of Musa balbisiana grown at normal and low temperature (5°C). A total of 69 known miRNAs and 32 putative novel miRNAs were detected in the libraries by Solexa sequencing. Sixty-four cold-inducible miRNAs were identified through differentially expressed miRNAs analysis. Among 43 miRNAs belonging to 26 conserved miRNA families with altered expression, 18 were upregulated and 25 downregulated under cold stress. Of 21 putative novel miRNAs with altered expression, four were downregulated and 17 upregulated. Furthermore, eight miRNAs were validated by stem-loop qRT-PCR and their dynamic differential expression was analyzed. In addition, 393 target genes of 58 identified cold-responsive miRNAs were predicted and categorized by function. These results provide important information for further characterization and functional analysis of cold-responsive miRNAs in banana.     

藏黄牛与宣汉黄牛心脏miRNA表达谱比较

【目的】miRNA作为一类非编码RNA,广泛参与机体多种生命活动,研究旨在挖掘miRNA在藏黄牛和宣汉黄牛心脏组织中的差异miRNA,为进一步研究藏黄牛低氧适应的分子机制提供基础数据。【方法】随机选取健康的藏黄牛和宣汉黄牛各3头,迅速采集其心脏组织,使用Trizol法提取RNA,琼脂糖凝胶电泳切胶选取18—30nt的片段,连接3'端和5'端,反转录后进行扩增,凝胶电泳切胶纯化后建立藏黄牛和黄牛各3个文库,利用Illumina HiSeq4000测序平台进行高通量测序;将测序得到的序列进行过滤,比对GenBank和Rfam数据库,筛选出藏黄牛和宣汉黄牛的差异miRNA,进行功能注释及信号通路富集分析;随机选择8个miRNAs,利用实时荧光定量PCR检测其在心脏组织的表达量,以验证测序数据的准确性。【结果】藏黄牛和宣汉黄牛心脏组织的高质量读值的序列分别为17 463 446条和13 662 812条,干净读值为16 552 296条和12 055 304条,且在藏黄牛和宣汉黄牛中高质量核酸序列长度富集最多的均是21nt,分别为37.5%和32.1%;且共筛选出219个差异miRNAs,其中48个显著上调,171个显著下调;GO功能注释得到差异miRNA靶基因分子功能中显著富集的条目有22条,如,GO:0005488（结合）、GO:0005515（蛋白质结合）和GO:0043167（离子结合）;细胞组分中显著富集的条目有20条,如,GO:0005623（细胞）、GO:0044464（细胞组分）和GO:0005622（细胞内）;生物过程中显著富集的条目有13条,如,GO:0035556（细胞内信号转导）、GO:0032774（RNA生物合成过程）和GO:0006351（转录,DNA模板化）,KEGG信号通路分析得到差异表达miRNAs靶基因显著富集到胰岛素信号通路（139个靶基因）、mTOR信号通路（38个靶基因）和HIF-1 信号通路（92个靶基因）等232个信号通路中,其中有12个靶基因共同作用于这3个信号通路,说明miRNAs可能通过这3个信号通路,共同参与藏黄牛低氧适应性的调控;随机选取8个miRNAs进行荧光定量验证,其表达趋势与测序结果表达趋势基本一致,表明高通量测序数据可信度较高。【结论】得到了miRNA在藏黄牛与宣汉黄牛心脏组织中的表达谱,为揭示藏黄牛低氧适应性的调控机制研究奠定了基础。     

松乳菇子实体两个发育时期的转录组分析

以松乳菇子实体为研究材料,采用de novo测序对松乳菇子实体进行测序与生物信息学分析,探究松乳菇子实体生长发育过程中幼菇期(LDG-1)和成熟期(LDG-2)基因表达的差异,并探寻影响松乳菇生长发育相关的主要基因和代谢通路。测序结果显示,共获得7.44G(LDG-1)和7.21G(LDG-2)的分析数据(clean reads)。KOG功能注释结果显示,松乳菇在幼菇期(LDG-1)和成熟期(LDG-2)具有全面而复杂的基因功能类别。GO富集结果提示,松乳菇在不同生长阶段(LDG-1和LDG-2)的生物代谢功能存在一定的差异。基因表达水平与聚类分析显示,ATP酶、多功能伴侣蛋白等家族基因为LDG-1和LDG-2主要高表达基因,在能量代谢与参与调控细胞周期中起重要作用。分析差异表达基因发现,相较于LDG-1期,LDG-2期有16 789个差异表达基因,其中7 635个基因上调,9 154个基因下调。差异表达基因KEGG富集通路分析结果显示,氧化磷酸化途径是松乳菇幼菇期生长发育过程中能量代谢的关键途径。进一步分析显示,MAPK信号通路是影响松乳菇子实体发育的关键信号通路,在促进松乳菇子实体进行有性生殖和调控菌丝体的极性生长中起重要作用。     

用高通量测序技术研究松辽黑猪与长白猪背最长肌 mRNA和lncRNA的差异表达

【背景】肌肉生长和脂肪沉积是猪生产中非常重要的经济性状,同时也是复杂的数量性状,受到众多因素的影响。长白猪原产于丹麦, 是目前世界上使用最为广泛的瘦肉型猪种之一, 具有生长速度快, 瘦肉率高等特点,但肉质欠佳。松辽黑猪是以民猪、长白猪和杜洛克猪为素材经过三元杂交育成的黑色母系地方培育品种,具有繁殖率高、肉质优良、适应性强、耐粗饲等特性。二者在肉质方面存在较大差异。【目的】采用高通量测序技术对松辽黑猪和长白猪的背最长肌转录组进行分析,筛选影响猪肌肉生长、肉质和脂肪沉积的关键mRNA和长链非编码RNA（long non-coding RNA, lncRNA）,为猪肉品质研究提供新的参考信息。【方法】采集6头松辽黑猪和6头长白猪的背最长肌作为样本,提取其RNA,将每个品种内的个体取等量RNA混池,采用Illumina HiSeq 2500高通量测序技术对混池后的样本RNA进行测序,然后对所获得的Reads进行比对、注释和差异表达等分析,筛选出差异表达mRNA和lncRNA并进行相关生物学功能富集分析。而后在筛选出的差异表达mRNA和lncRNA中各挑选10个基因,包括5个上调基因和5个下调基因,采用荧光定量PCR（Real-time PCR, RT-PCR）方法鉴定所选mRNA和lncRNA的表达水平,并验证测序结果的可靠性。【结果】将得到的原始数据进行质量控制后,每个样本分别得到103 M和150 M reads,其中98%以上reads质量较高,满足进行下一步分析的要求。将reads比对到参考基因组上,共得到26 774个转录本,其中包括8 428个新的转录本。采用edgeR软件包进行差异表达分析,参考标准是错误发现率（false discovery rate, FDR）小于0.05和差异倍数大于2（fold change, FC）。在2个猪种中共得到4 239个显著差异表达的mRNA,其中在松辽黑猪肌肉中2 023个上调,2 216个下调。其中HLCS、BTD、DGKα、LPIN1、FGF1、FGF10、FGFR1和ZNF7等基因参与脂类代谢和肌肉发育相关的调控。差异表达的mRNA的生物学功能富集分析发现,其主要富集在细胞发育、生物代谢调控、肌肉发育、脂类代谢等相关的信号通路和生物代谢途径上。同时,在2个猪种中还检测到的178个差异表达显著的lncRNAs,其中在松辽黑猪肌肉组织中有84个上调,94个下调。联合差异表达lncRNAs的靶基因预测和差异表达基因结果分析,显示有4个差异表达的lncRNA与差异表达mRNA存在潜在的调控关系,分别是TCONS-00041713、TCONS-00041712、ENSSSCT00000034982、ENSSSCT00000034269。同时10个差异表达mRNA和10个差异表达lncRNA的RT-PCR结果显示：其表达水平在两组中同样差异显著,且与转录组测序中表达的趋势相似,表明高通量测序结果具有可靠性。 【结论】 获得了影响猪肌肉生长、肉质和脂肪沉积的关键mRNA和lncRNA,同时发现了几对差异表达lncRNA和mRNA之间可能存在着潜在的调控关系。这些潜在调控关系的发现,可能对于研究调控肌肉组织代谢活动的分子机制的具有一定意义,并为其提供新的参考信息。     

基于高通量测序的低温胁迫下赤桉miRNAs的挖掘与分析

目的 预测、挖掘和分析涉及赤桉Eucalyptus camaldulensis低温胁迫应答的miRNA,为研究其调控赤桉低温胁迫应答的分子网络奠定基础。方法 采用高通量测序对低温处理组和对照(CK)组的赤桉组培苗茎尖进行小RNA测序。以miRBase21.0、Rfam14.1和巨桉E. grandis基因组为参考数据库,利用Bowtie、miREAP和miRDeep2等软件进行miRNA预测,使用RNAfold对预测到的miRNA前体进行二级结构的折叠;采用psRNATarget预测靶基因,通过DEGSeq包分析差异表达的miRNA,并对它们进行GO注释和KEGG富集分析。结果 在赤桉中,共预测到隶属于54个家族的392个已知miRNA和97个新miRNA;其中,CK组共预测到282个已知miRNA,65个新miRNA;低温处理组共预测到329个已知miRNA,51个新miRNA。挖掘到80个在低温处理下显著差异表达的miRNA,包括55个上调和25个下调。GO基因功能注释和KEGG富集分析的结果表明,这些差异表达miRNA可能通过参与代谢通路、次生代谢物的生物合成、细胞膜的改变、信号转导和生物调节等响应低温胁迫。此外,还挖掘到25个可能与ICE1-CBFs-COR通路有关的miRNA。结论 借助高通量测序和生物信息学软件初步得到了低温胁迫下差异表达的赤桉miRNA,为进一步分析这些miRNA在赤桉低温胁迫中的分子功能提供一些参考。     

蜜蜂球囊菌菌丝和孢子中微小RNA及其靶mRNA的比较分析

【目的】蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis,球囊菌)专性侵染蜜蜂幼虫而导致白垩病。本研究旨在通过small RNA-seq（sRNA-seq）技术和生物信息学方法对球囊菌纯化菌丝（AaM）和纯化孢子（AaS）进行深度测序和比较分析,明确球囊菌菌丝miRNA和孢子miRNA的数量、结构和表达谱差异,并揭示菌丝和孢子共有miRNA、特有miRNA和差异表达miRNA（differentially expressed miRNA,DEmiRNA）及其靶mRNA与球囊菌菌丝和孢子生长、发育和病原致病性的潜在关系。【方法】实验室条件下获得纯培养的球囊菌,利用sRNA-seq技术对AaM和AaS分别进行测序,通过对原始读段（raw reads）进行过滤和质控获得有效标签序列（clean tags）。通过Venn分析筛选菌丝和孢子共有miRNA和特有miRNA。根据P≤0.05且|log₂ fold change|≥1的标准筛选AaM vs AaS的DEmiRNA。对上述共有miRNA、特有miRNA和DEmiRNA的靶mRNA进行预测,并对靶mRNA进行GO及KEGG数据库注释。根据靶向结合关系构建DEmiRNA和靶mRNA的调控网络。利用RT-qPCR验证测序数据的可靠性。【结果】AaM和AaS中分别得到12 982 320和12 708 832条raw reads,经过滤和质控分别得到10 800 101和9 888 848条clean tags。AaM中miRNA的长度介于18—26 nt,AaS中miRNA的长度介于18—24 nt,分布miRNA数量最多的长度均为18 nt,AaM和AaS中首位碱基为U的miRNA数量最多。AaM和AaS中表达量最高的miRNA均为miR6478-x、miR10516-x和miR482-x。菌丝和孢子共有miRNA靶向结合5 946个mRNA,二者特有miRNA分别靶向结合6 141和6 346个mRNA。共有miRNA的靶mRNA主要参与代谢进程、细胞进程和催化活性等42个功能条目,以及翻译、碳水化合物代谢和能量代谢等120条通路。AaM vs AaS比较组包含93个DEmiRNA,可靶向结合6 090个mRNA,这些靶mRNA可注释到38个功能条目和120条通路。DEmiRNA与靶mRNA之间形成较为复杂的调控网络,miR-4968-y位于调控网络的中心且能够靶向结合多达118个mRNA。RT-qPCR结果显示5个DEmiRNA的表达趋势与测序数据一致,证实了本研究中测序数据的可靠性。【结论】球囊菌菌丝和孢子中的miRNA具有类似的结构特征,但表达谱表现出明显差异;菌丝和孢子可能通过特异性表达和差异表达部分miRNA对其生长、发育和生殖进行调控。     

A MicroRNA Catalog of Swine Umbilical Vein Endothelial Cells Identified by Deep Sequencing

MicroRNAs (miRNAs) are endogenous ∼22 nt RNAs that play important regulatory roles in targeting mRNAs for cleavage or translational repression. Despite the discovery of increasing numbers of human and mouse miRNAs, little is known about miRNAs from pig. In this study, we sought to extend the repertoire of porcine small regulatory RNAs using Solexa sequencing. We sequenced a library of small RNAs prepared from immortalized swine umbilical vein endothelial cells (SUVECs). We produced over 13.6 million short sequence reads, of which 8547658 perfectly mapped to the pig genome. A bioinformatics pipeline was used to identify authentic mature miRNA sequences. We identified 154 porcine miRNA genes, among which 146 were conserved across species, and 8 were pig-specific miRNA genes. The 146 miRNA genes encoded 116 conserved mature miRNAs and 66 miRNA*. The 8 pig-specific miRNA genes encoded 4 mature miRNAs. Four potential novel miRNAs were identified. The secondary structures of the 154 miRNA genes were predicted; 13 miRNAs have 2 structures, and miR-9 and miR-199 have 4 and 3 structures, respectively. 36 miRNAs were organized into 19 compact clusters. miR-206, miR-21 and miR-378 were the relatively highly expressed miRNAs. In conclusion, Solexa sequencing allowed the successful discovery of known and novel porcine miRNAs with high accuracy and efficiency. Furthermore, our results supply new data to the somewhat insufficient pig miRBase, and are useful for investigating features of the blood-brain barrier, vascular diseases and inflammation.     

NDV基因Ⅶ型与基因Ⅱ型感染CEF后microRNA表达谱分析

本研究旨在探究新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）流行株HB株（基因Ⅶ型）与疫苗株La Sota株（基因Ⅱ型）在感染鸡胚成纤维细胞（Chicken embryo fibroblasts,CEF）36 h后宿主细胞microRNA(miRNA)表达谱变化情况。通过高通量测序技术分别对La Sota株与HB株感染CEF后36 h后的样本与参考鸡源基因组进行系统比对，筛选差异表达miRNA并对其靶基因进行GO功能注释以及KEGG通路富集。最后随机筛选5条miRNA通过实时荧光定量PCR(Real-time quantification PCR,RT-qPCR)进行验证。结果表明，La Sota与HB感染组中已知miRNA分别为56.9%和47.8%;La Sota与HB感染组通过差异性比较后共筛选出10条差异表达miRNA；通过对差异表达基因的靶基因进行GO与KEGG富集发现，其主要在细胞代谢、生物合成以及应激信号传导等通路上出现显著富集；RT-qPCR结果与RNA-seq结果趋势一致，证明了测序结果的可靠性。为进一步揭示不同NDV毒株感染CEF以及在感染过程中miRNA发挥的调控作用提供了研究基础。     

2020-06ml 目录

目的异形叶性是植物为适应环境在同一植株上产生多种形态成熟叶片的现象。胡杨是典型的木本异形叶植物,前人研究发现,胡杨异形叶片间展现出不同的生理特性及环境适应性。本研究拟通过对胡杨异形叶差异表达miRNA及其靶基因功能的分析,揭示胡杨叶片形态及其生理变化的分子调控机制。方法以成年胡杨披针形叶和锯齿卵圆形叶为实验材料,通过高通量测序对其miRNA的表达模式及差异表达miRNA的靶基因功能进行比较研究。结果共获得6个高质量的sRNA文库,各文库有效序列占原始序列的56% ~ 81%。通过比对,共鉴定517个已知miRNA和127个新预测miRNA,主要长度分布区间为20 ~ 22 nt,其中的389个miRNA匹配至54个已知的miRNA家族。两种形态叶片共同检出的miRNA有369个,与披针形叶片相比,锯齿卵圆形叶中7个miRNA上调表达,15个下调表达。通过靶基因预测及功能分析,发现差异表达miRNA参与调控胡杨异形叶的抗逆相关途径,如对盐胁迫的响应,磷酸肌醇代谢,角质、软木脂和蜡的生物合成,碱基切除修复和RNA降解等代谢途径。利用实时荧光定量PCR验证了5个差异表达miRNA的表达趋势与高通量测序结果一致,通过PCR检测发现差异表达miRNA与其靶基因存在一定的负调控关系。结论胡杨异形叶中miRNA表达模式存在差异。其中,调控植物生长发育的保守的miR167、miR166及调控植物抗逆性的miR172在锯齿卵圆形叶中表达量上调,参与植物逆境响应的保守的miR169、miR396在锯齿卵圆形叶中下调表达,推测差异表达miRNA引起了异形叶间形态的差异,同时使锯齿卵圆形叶对不利环境具有较强的耐受性。这与我们前期有关胡杨异形叶形态与生理特性的研究结果相一致。      

高低精子活力的鸡睾丸和附睾转录组系统分析

为探究精子活力与睾丸和附睾组织对种公鸡基因表达的影响,本研究选取精子活力存在显著差异的海兰褐种公鸡8只(高活力4只,低活力4只),屠宰后采集其睾丸和附睾组织进行转录组测序。利用DESeq2的双因素模块筛选不同精子活力组间和不同组织间的差异表达基因,并进行功能富集分析。结果表明：1)2个组织高精子活力和低精子活力组间的差异表达基因有112个;在高精子活力组高表达的基因有32个,低精子活力组高表达的基因有80个。高低精子活力间差异表达基因显著富集于细胞因子-细胞因子受体相互作用、产生IgA的肠道免疫网络和甘油磷脂代谢3条通路,其中CTRP3、TDRD5、KATNAL2、SOCS3和CSF3等差异表达基因可能是调控鸡精子活力的重要基因。2)睾丸和附睾组织间鉴定出9 212个差异表达基因,在睾丸组织高表达的基因有5 206个,在附睾组织中高表达的基因有4 006个。睾丸特异性高表达基因显著富集在细胞周期、细胞核质转运、减数分裂和甘油磷脂代谢等8条通路,其中YTHDC2、MEIG1、GTSF1、JAM3和SFMBT1等差异表达基因在精子发生过程中发挥着重要作用。在附睾组织高表达的基因参与了MAP...     

单双羔绵羊卵巢组织差异表达microRNAs筛选

【目的】全面了解绵羊卵巢组织miRNAs表达情况,分析产单羔和产双羔绵羊卵巢miRNAs表达差异,从而为探讨miRNAs在繁殖力调控中的作用提供依据。【方法】应用多物种miRNA芯片对绵羊卵巢组织miRNA进行表达分析。首先选择经产单羔羊和双羔羊,发情后采集双侧卵巢提取总RNA,分离小片段 RNA与miRNA芯片杂交,然后进行数据分析获得绵羊卵巢组织miRNAs表达谱;利用生物信息学软件,以q-value ≤ 5%,且Fold Change ≥2 或≤0.5的标准筛选单羔羊和双羔羊卵巢差异表达miRNAs,并利用q-PCR技术验证芯片结果;分别采用microT和miRDB两种方法预测差异表达miRNAs的靶基因,然后合并两种方法结果数据取二者的交集,用在线软件对靶基因进行GO功能注释。【结果】在检测的来自所有物种的miRNAs中,有5 448个miRNAs在单羔和双羔羊卵巢组织中共同表达,22个在单羔羊卵巢中特异性表达,15个在双羔羊卵巢中特异性表达;对绵羊中已报道的103个miRNAs,比较其在两组母羊卵巢组织中的表达变化,共获得11个差异表达miRNAs,其中4个上调表达,7个下调表达;随机选择一个上调和一个下调表达的miRNAs进行q-PCR验证,定量结果与芯片结果一致,说明芯片结果准确、可信;预测获得7个miRNAs的靶基因,分别是：oar-miR-370-5p、oar-miR-376b-5p、oar-miR-381-5p、oar-miR-412-5p、oar-miR-541-3p、oar-miR-544-5p和oar-miR-1185-5p,每个miRNA获得的靶基因个数分别为：115、71、1、5、8、135和23个。GO注释结果显示,miR-376b-5p和miR-1185-5p的靶基因主要参与形成细胞内组分和细胞器,在分子功能分类中,绝大部分基因为连接分子类和催化活性分子类,在生物学过程分类中,主要参与细胞增殖、分化、凋亡过程和代谢过程;同时miR-376b-5p的靶基因IGF-1、DAZL、MTOR、MET、NEDD4和miR-376b-5p的靶基因AHR参与生殖过程的调控。【结论】成功构建了绵羊卵巢miRNAs表达谱,获得产单羔母羊和产双羔母羊卵巢组织差异表达miRNAs,这些miRNAs可能与绵羊卵泡发育和产羔数多少有关。