甜橙和柚中CTV强弱毒株系p20的遗传变异

【目的】对7个柑橘衰退病毒(CTV)株系进行遗传变异研究,明确寄主甜橙和柚中CTV强弱毒株系p20的变异水平。【方法】运用RT-PCR、克隆及测序等技术建立CTV p20种群,并借助MEGA6构建单倍型系统发育树,运用软件DNAStar对两种寄主中CTV强弱毒种群的遗传结构、变异水平进行分析,运用DnaSP软件对各种群进行单倍型多样性、核苷酸多样性分析和中性检验分析。【结果】构建了7个CTV p20种群,由162条序列构成,包含11个单倍型,单个种群有1个或更多单倍型出现。序列分析发现,来自不同种群的单倍型对应的原始核苷酸序列一致性为88.2%—100.0%,对应的氨基酸序列的一致性为92.3%—100.0%,最低的氨基酸序列一致性发生在CT23-1和CT9-2之间;其中单倍型PeraIAC-4、CT22和CT9-1共有50条序列,对应的原始核苷酸序列一致性为100.0%,属优势单倍型,与标准株系T36亲缘关系较近;单倍型多样性最丰富的是甜橙种群PeraIAC,单倍型多样性为0.800,而单倍型多样性最低的是柚种群CT22,单倍型多样性为0.170;相比柚种群的单倍型多样性(0.170—0.552)和核苷酸多样性(0.00032—0.05919),甜橙种群具有更为丰富的单倍型多样性(0.513—0.800)和核苷酸多样性(0.04208—0.05677)。系统发育树分析表明,来自甜橙的分离株种群结构复杂,甜橙种群中检测到的单倍型与标准株系T30、T36、VT和T3均有相关性;与标准株系T3相距很近的CT31-2与优势单倍型在系统发育树上距离最远,对应的原始核苷酸序列一致性仅为88.3%。中性检验结果表明,CTV甜橙种群趋于平衡或收缩状态,而CTV柚种群除CT23外则趋于扩张状态;其中TR-514Y、CT31和CT23种群的Tajima’s D值、Fu和Li’s D*值以及Fu和Li’s F*值均为正值且达到显著水平,而CT9种群的Tajima’s D值、Fu和Li’s D*值以及Fu和Li’s F*值均为负值且达到显著水平。运用DnaSP软件对各种群进行重组分析表明,在各种群中均未检测到重组事件发生。种群变异分析发现,各种群突变克隆百分比在0—30.8%,碱基突变频率在0—7.706×10~(-4),其中CTV甜橙强毒种群有最高的突变克隆百分比(30.8%),最高的碱基突变频率(7.706×10~(-4)),最多的碱基突变数量(11个)和最多的突变位点(7个);CTV甜橙弱毒种群的突变克隆百分比和碱基突变频率均明显低于甜橙强毒种群,CTV柚弱毒种群的突变克隆百分比和碱基突变频率略低于柚强毒种群。碱基突变类型分析发现碱基突变以碱基替代为主,其中A→G突变为优势类型,仅在柚强毒种群CT3的156和157位点间检测到一个碱基插入突变类型,为碱基A插入,未检测到碱基缺失突变类型。【结论】在寄主甜橙和柚中CTV强弱毒p20种群结构及变异存在差异,CTV甜橙种群有着更复杂的种群结构和更高的种群变异水平,且CTV强毒种群变异更大。     

柑橘衰退病毒基因p23 RNAi载体的构建及转化

【目的】构建柑橘衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)含p23的RNAi载体,以获得具有抗性的柑橘转基因植株。【方法】基于转化病毒基因介导抗性,根据NCBI公布的CTV基因组序列,查找p23保守序列,设计并克隆两条不同长度的片段。对两条片段和植物表达载体p BI 121进行双酶切和连接来构建RNAi载体。初步预测所构建的载体发生RNAi抗病毒的可行性。利用农杆菌介导的瞬时表达技术将含RNAi载体的农杆菌注射入CTV指示植物墨西哥莱蒙的叶片,利用GUS组织化学染色法观察叶片中载体发生瞬时表达的情况。发生瞬时表达的叶片接种CTV T36基因型,利用酶联免疫反应(ELISA)检测病毒含量。同时,提取叶片的RNA并反转录为c DNA,利用实时荧光定量PCR(q-PCR)检测CTV p20,通过该基因的表达量反映叶片中的病毒含量。通过农杆菌介导的遗传转化将RNAi载体转入大红甜橙实生苗上胚轴节间茎段,抗生素筛选得到的芽嫁接至枳橙实生试管苗。提取大红甜橙叶片的DNA,通过PCR扩增确定其是否为转基因阳性;目的基因检测为阳性的植株二次嫁接至温室保存的酸橙实生苗;根据插入的p23基因序列设计q-PCR引物,检测转基因植株中p23的表达情况。取CTV T36基因型寄主的带皮芽,用腹接法接种大红甜橙转基因植株。取接种后新萌发枝梢上的叶片,用检测瞬时表达叶片同样的方法分析植株的抗病性。对于第1次接种后未检测出病毒感染的植株,进行第2次接种并检测分析。【结果】克隆得到CTV p23 513 bp的长片段和291 bp的短片段,与载体p BI121连接后成功构建含发夹结构的来自病原且能靶向目的基因的RNAi载体,命名为p23-RNAi。注射p23-RNAi的墨西哥莱蒙叶片经GUS染色后能够产生蓝色斑点,表明农杆菌p23-RNAi可以在叶片中发生瞬时表达;接种CTV后第15和30天,瞬时表达p23-RNAi的墨西哥莱蒙叶片ELISA检测结果均为阴性,同时q-PCR检测结果显示其CTV p20的积累水平和增加速度明显低于对照植株,表明瞬时表达的p23-RNAi在一定时间内可以对CTV的侵染产生抑制。p23-RNAi经农杆菌介导遗传转化大红甜橙获得抗性芽,通过普通PCR的扩增结果证明得到7个转基因植株;q-PCR检测结果进一步表明7个转基因植株间p23的含量呈现一定差异,植株E的含量最高,其次是C、F、H、A、B和G。接种CTV后,p20的表达量在7个转基因植株间也表现出一定差异,表达量最高的是植株A,其次是G、F、E、B、H、C,且与对照植株相比,呈现不同程度的抗病性。转基因植株对病毒的抗性与外源基因的表达水平没有相关性,外源基因表达水平最高的植株E并没有表现强的CTV抗性。经过两次病毒接种,转基因植株C在接种后具有完全抗性。【结论】p23-RNAi载体能引起植物抗柑橘衰退病毒;瞬时表达技术可快速鉴定RNAi载体的抗病性,有利于筛选高效率的RNAi载体。     

Characterization of Citrus tristeza virus Isolates by Indicators and Molecular Biology Methods

Citrus tristeza virus （CTV） exists in citrus as a large number of distinct strains differing in biological characters. The control strategies such as mild strains cross protection （MSCP） require a clear understanding of the characterization of CTV. For better understanding of the structure of CTV population and the relationship between molecular and biological characterization, 72 CTV samples collected from five provinces in China were studied, using biological indexing, p25/Hinf I restriction fragment length polymorphism （RFLP）, multiple molecular markers, and bidirectional RT-PCR assay. The mixture of severe stem pitting isolates was found to be dominant in the field. CTV isolates with p25/Hinf Ⅰ RFLP group 3 and p23/BD-PCR group Ⅰ, Ⅲ were the main cause of epidemics, and most CTV isolates were found to be the mixture of T30 and VT genotypes. More accurate identification of strain mixtures in the field and better understanding of the biological traits of the isolates may be achieved by applying the three molecular detection methods simultaneously.     

橘蚜传播柑橘衰退病毒的研究进展

就橘蚜传播柑橘衰退病毒 (CTV)的传毒特性、传毒率、影响传毒率因素、与柑橘衰退病流行的关系、对混合株系的虫传分离作用以及带毒橘蚜的分子生物学检测等研究进展作一综述 .橘蚜传播 CTV的方式为非循回型半持久式 ,其从甜橙和墨西哥莱檬植株上传播 CTV的效率高于棉蚜、橘二叉蚜和绣线菊蚜等蚜虫 .橘蚜对 CTV不同株系的传毒率有所差异 ,对重型株系的传毒率较轻型株系高 .影响传毒率的因素有蚜虫发育虫态、毒源植物、接毒植物和环境条件等 .橘蚜与酸橙砧甜橙衰退病的发生与流行 ,特别是衰退型强株系衰退病的发生与流行有密切相关性 ,它是甜橙衰退病发生与流行的最主要传播介体 .橘蚜对 CTV具有分离株系的作用 ,通过单虫传播 ,可以将混合感染状态的 CTV不同株系分离而获得纯化株系 .检测橘蚜携带 CTV的分子生物学反转录 -聚合酶链式反应技术已建立 ,并已应用于检测橘蚜等蚜虫的单虫带毒情况 .讨论认为 ,不同发育虫态、毒源植物、接毒植物和环境条件等因素对橘蚜传播 CTV的影响 ,特别是毒源植物和温度条件对橘蚜传毒率的影响 ,及利用橘蚜单虫传播分离 CTV株系等方面的研究有待进一步加强     

Effects of Exogenous Putrescine Application on Hormone Content of Citrus aurantium L. Seedling under Salt Stress

A pot experiment was conducted in lath house to study the response of six month-old seedlings of sour orange （Citrus aurantium L.） irrigated with salinity water （1, 2 or 4 ds/m） for four month. The seedling was sprayed with putrescine at 0, 150 or 300 mg/L concentrations for three times with month interval, for investigation the effects of putrrescine spraying on hormonal changes in sour orange seedlings under salt stress. One month after the last putrescine application, the leaves of the vegetative shoots were picked for endogenous plant hormone determination. The results indicate that increasing level of irrigation water salinity to 4 ds/m significantly increased ABA, Put and SA; whereas, decreasing IAA and GA in leave. Spraying vegetative canopy with putreseine at 300 mg/L increased 1AA, SA, ABA and Put, while decreased GA. It can be concluded that the adverse effects of high salinity irrigated water on endogenous plant hormone can be ameliorated, to some extent, by exogenous application of Put at 150 mg/L or 300 mg/L concentration.     

胡柚上柑橘衰退病毒的分子检测

胡柚是我国东部地区重要的柑桔栽培品种.近年来,一种以叶片黄化为主要症状的新病害在胡柚种植区暴发流行.通过血清学和分子生物学检测,研究首次从黄化的胡柚叶片中检测到柑橘衰退病毒.系统进化分析表明,分离的CTV CS-7分离物与P09.18、NZRB-TH30等分离物具有较近的进化关系,而与T30等强毒株系有较大的遗传距离,...     

柑橘衰退病毒基因RNAi载体的构建

基于转化病毒基因介导抗性,通过在植物表达载体p CAMBIA 2301上插入启动子–内含子–终止子的方式,构建一种含有发夹结构的、通用型强的RNAi载体骨架结构;以柑橘衰退病毒(citrus tristeza virus,CTV)的p25、p20和p23基因保守序列为模板设计正向片段和反向片段,先后与骨架载体连接,成功构建了3个RNAi载体(分别命名为ds2301–p25、ds2301–p20和ds2301–p23),并将载体ds2301–p23注射入墨西哥莱蒙叶片。制作p23基因的地高辛标记探针,用Northern杂交检测是否有si RNA产生。结果表明:用Northern杂交可以检测到p23特异的si RNA,在墨西哥莱蒙叶片中瞬时表达的农杆菌ds2301–p23可以发生RNAi,表达有效的si RNA。本研究中构建的骨架载体可以广泛用于RNAi载体的构建,含有柑橘衰退病毒基因片段的3个载体可以用于基因功能分析及具有CTV抗性的柑橘种质资源获得。     

Preliminary Studies on CPG/Hinf Ⅰ RFLP Groups of Citrus tristeza virus Infected Sweet Oranges in China

Citrus tristeza virus (CTV) causes economically important losses to the citrus industry worldwide. Mild strain cross protection (MSCP) against tristeza has hardly been practised due to mixed infection of different CTV-strains and little background of its molecular biology in China. For better cognition on CTV, 192 sweet orange samples collected from eight provinces (Chongqing, Sichuan, Fujian, Hunan, Guangxi, Yunnan, Guangdong and Jiangxi) were tested by direct tissue blot immuno-assay (DTBIA), and 158 of them were tested positively, which therefore were subjected to coat protein gene (CPG)/Hinf Ⅰ restriction fragment length polymorphism (RFLP) analysis. Sample bulks were compared between Chongqing and Fujian by some statistical data, including ratios of single infection and mixed infection to local samples, proportions of CTV isolates with single RFLP groups, and rates of each RFLP group. The simplified analysis of samples from the other six provinces were then conducted. This study suggests that CTV isolates with CPG/Hinf Ⅰ RFLP groups Ⅲ and Ⅰ are the main epidemic ones in China, and mixed infection of CTV in fields are popular. Based on observation of severity of stem-pitting symptom in field trees, CTV isolates with CPG/Hinf Ⅰ RFLP groups Ⅲ and Ⅰ caused severe stem-pittings in sweet oranges in China.     

CTV侵染对锦橙叶片营养元素含量的影响研究

锦橙是我国南方重要的柑桔栽培品种,栽培面积广,但易被柑橘衰退病病毒(Citrus tristeza virus,CTV)侵染。选用两年生实生锦橙为材料,一组嫁接感染CTV强毒株TRL514的枝条的皮和芽,另一组嫁接正常枝条作为对照,接种后用DTBIA法和RT-PCR法检测CTV侵染情况。接种了CTV的锦橙呈现顶梢枯死、叶片变黄、茎陷点等症状,通过测定春梢叶片氮、磷、钾、硫、钙、镁、铁、锰、铜、硼和锌等11种元素的含量发现:接种了CTV的锦橙氮、钾和铜的含量高于对照;而磷、钙、硫、硼、铁、锰和锌的含量较低;镁的含量差异不大。两组材料间营养元素含量的差异在一定程度上可以解释CTV侵染产生的木质部凹陷对植株的影响,并为今后柑橘衰退病的预防和诊断提供一定的依据。     

快速经济的真菌和病毒病害的病理解剖染色技术

柑橘速衰病毒侵染墨西哥酸橙〔Citrus aurantifolia(Christm.)Swing〕叶片后,叶脉维管束鞘厚壁组织细胞表现典型的退化。强株系CTV-3侵染墨西哥酸橙后,脉明明显的区域,有63％的维管束鞘厚壁组织细胞退化,脉明不明显的区域仅有34％～48％的退化;弱株系T-TX8侵染后,厚壁细胞衰退率最高的仅39％,不透明区域所有细胞均完整,与对照一致。CTV-2、T-TX8、T-TX9、T-TX24等另外4个柑橘速衰病毒株系分别侵染后,主支脉、中脉、叶柄雏管束鞘厚壁细胞的衰退与对照差异显著(P=0.0001,F=80.60,df=4,7),健康植株厚壁细胞没有退化。对Mycosphaerella citri Whiteside侵染的柚子(Citrus paradise Macf.)和甜橙(C.sinensis L.)的叶片横切比较表明,黄甜橙的侵染可扩展到软组织细胞,红柚子侵染后栅栏组织下的软组织明显增生,二者上下表皮均有大量侵染点。Orlando tangelo,Marrs orange和Star Ruby柚子叶片下表皮的侵染点比上表皮多。试验表明:用Fungi—Flour进行荧光染色,是研究病毒及真菌侵染植物组织病理解剖的快速经济的方法。     

本地早柑桔衰退病毒病的交叉保护研究

1995～1996年从黄岩不同桔区的"本地早"(Citrus succosa)桔树采样,经指示植物墨西哥莱檬(Citrus auranti folia)鉴定,得到18个柑桔衰退病毒(Citrus tristeza virus,CTV)分离毒株.根据茎陷点数/cm2划分,其中有弱毒分离株7株,中毒株5株和强毒株6株.网室试验的结果显示,在墨西哥莱檬上预先接种弱毒或中毒分离株后再以强毒株挑战接种的处理,其茎陷点数/cm2比仅接种强毒株的处理显著减少,其生长量也明显大于仅接种强毒株的植株,显示了明显的交叉保护作用.田间试验是以枳壳或以枸头橙为砧木的本地早,分别以不同毒性的CTV毒株接种后移植田间.在移植后第5～7年进行调查.结果证明,以弱毒或中毒分离株接种的植株,和以弱毒株预接种后再接种强毒株的植株,其3年的年均小果率均显著低于单接强毒株的植株,也显著低于未接种的田间植株.说明CTV弱毒株或中毒株的预接种对CTV的强毒株再侵染和田间毒株的自然侵染有明显的保护作用.同时,选择带弱毒株、中毒株和强毒株的田间定点病树各3株,连续3年调查产量及树体生长量.结果显示,感染弱毒株或中毒株的病树,产量高于重病树,小果率低于重病树,说明CTV的交叉保护现象在自然界存在.     

柑桔衰退病毒基因组学研究进展

柑桔衰退病毒(CTV)是柑桔普遍存在的一种重要病毒病害,因其自身基因变异和寄主的不同而产生不同的症状,给防治CTV带来一定困难.为防治柑桔衰退病,需要研究CTV本身的相关特征.从CTV的基因组学上的特征综述了国内外在CTV基因组学最新的科研进展.     

应用抑制性差减杂交技术筛选锦橙CTV应答基因

【目的】探讨易感柑橘衰退病病毒（Citrus tristeza virus,CTV）品种锦橙CTV应答分子机理,筛选和分析CTV应答基因。【方法】以嫁接CTV强毒株TRL514的锦橙阳性材料叶片为试验方（Tester）,用嫁接无毒枝条的CTV阴性锦橙叶片为驱动方（Driver）,构建CTV侵染的锦橙的正向差减文库。【结果】随机挑选850个阳性克隆测序,其中742条测序成功,去除载体片段和接头序列后得到有效EST 692条。将所有EST序列对应到柑橘的预测基因组转录物,共涉及137个柑橘基因。应用BLAST2GO对这些特异性表达的基因进行功能归类和KEGG分析。结果表明,受CTV侵染的影响,锦橙能量代谢相关基因上调明显,与光合器官碳固定、氮代谢、淀粉和蔗糖代谢等途径相关的EST出现频率较高。另外,与抗逆防御以及苯基丙氨酸合成、类苯基丙烷代谢、类胡萝卜素合成等与植物防御素类物质合成密切相关的代谢途径相关基因较多。【结论】由于CTV的侵染,CTV易感品种锦橙基础代谢改变明显,须通过增强能量代谢和提高自身防御能力来维持自身生长和发育。     

抗柑橘衰退病毒基因工程研究进展

本文从选育和利用抗（耐）柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus,CTV）的柑橘品种和砧木、弱毒株交叉保护、转基因诱导的CTV抗性等方面综述抗柑橘衰退病毒基因工程研究进展,并就人工miRNA（artifical microRNA,amiRNA）介导抗性加以展望,旨在为更好地控制CTV危害提供借鉴。     

冰糖橙胚性愈伤组织的诱导与植株再生

以冰糖橙成熟果实中的未发育胚珠为外植体，培养诱导胚性愈伤组织并进行植株再生。结果表明：在不同的培养基和不同的培养条件下胚性愈伤组织和胚状体的发生频率不同；麦芽提取物和GA3有利于胚性愈伤组织的发生，暗培养有利于胚性愈伤组织的诱导；在MKBN(MT KT0．5mg／L BA0．5mg／L NAA0．1mg／L)培养养基上，胚状体的再生率达88．24％，以酸橙作砧木进行试管嫁接，嫁接成活率达88．89％。     

水分胁迫对柑橘光合特性的影响

以枳橙砧山下红温州蜜柑、纽荷尔脐橙和沙田柚盆栽苗为试材,设盆栽土壤水分含量分别为最大田间持水量的60%、40%、20%共3个处理(以下简称60%PC、40%PC、20%PC处理),以正常浇水的盆栽苗为对照,研究水分胁迫处理对柑橘光合特性的影响.结果表明,(1)随水分胁迫的加重,蜜柑叶片叶绿素含量降低,叶绿素a与叶绿素b的含量比减小;(2)各水分胁迫处理柑橘的净光合速率、气孔导度、蒸腾速率均低于对照,且下降幅度从大到小依次为20%PC(重度胁迫)、40%PC(中度胁迫)、60%PC(轻度胁迫);(3)不同品种柑橘对照的净光合速率日变化曲线相似,均为双峰曲线,但峰值大小和出现时间有差异;不同品种柑橘40%PC处理净光合速率的日变化曲线不同,沙田柚的为单峰曲线,纽荷尔脐橙和山下红温州蜜柑的为双峰曲线;(4)不同处理山下红温州蜜柑叶片净光合速率的日变化曲线不同,20%PC处理的为单峰曲线,其余处理的为双峰曲线.     

HCO3-和pH对3种柑橘悬浮培养材料的生理效应

考察了HCO3 -和pH对酸橙、红桔和枳的悬浮培养细胞 (团 )的生理效应 ,测定了过氧化物酶、过氧化氢酶及质膜透性等生理指标。结果表明 ,3种试材的细胞 (团 )均受到了一定的生理伤害 ,其中以酸橙受到的伤害最轻 ,红桔次之 ,枳最重     

锌胁迫对三种柑橘砧木的生理特性和锌分配的影响

为了探究锌胁迫对柑橘砧木生长的影响,本文采用溶液培养的方法,测定了不同锌浓度如0 mg?L-1(锌缺乏)、0.005 mg?L-1(锌低量)、0.05 mg?L-1(锌适量)、0.5mg?L-1(锌过量)条件下枳壳、酸橙与红橘的相关生理指标及不同部位锌含量变化。结果表明：1）锌胁迫显著抑制了枳壳及酸橙的生长,而对红橘生长的影响较小。2）与锌适量处理相比,锌缺乏和锌低量处理时枳壳、酸橙根系POD活性均明显降低,各锌处理间红橘根系CAT活性无显著性差异;锌胁迫下三者叶片与根系脯氨酸含量均显著高于适量锌处理,不同锌处理下枳壳叶片MDA及其根系脯氨酸含量均相对低于酸橙与红橘。3）随着锌处理浓度的升高,三者根、茎、叶的锌含量均趋上升,且根系锌含量显著较高。锌过量处理下三者的叶/根、叶/茎、茎/根比均显著低于其他锌处理。可见,三种柑橘砧木对锌胁迫的反应存在明显的差异。