一株能通过接合导入外源质粒的水稻黄单胞菌水稻致病变种菌株的获得及鉴定

从2008年10月在广西防城港市不同稻区采集的表现水稻白叶枯病症状的叶片中分离、纯化,得到22株水稻黄单胞菌水稻致病变种（Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo）疑似菌株。在水稻品种日本晴、9311和特优63上剪叶接种,22个菌株都可在这3个水稻品种上引起典型的水稻白叶枯病症状,证实他们是Xoo菌株。以2007年从该地区采集的患病水稻叶片中分离得到的11个Xoo菌株和该22个菌株作为出发菌株,分离、纯化得到每个菌株的链霉素抗性突变体。通过三亲本接合检测向该33个链霉素抗性突变体导入广谱克隆载体pLAFR6的效率,结果得到2株可导入pLAFR6的突变体K74和K31,K74和K31的导入pLAFR6效率分别为2.9×10^-2、9.0×10^-6。经16SrRNA基因序列测定证明K74属于Xoo,即菌株K74可作为研究Xoo与水稻相互作用机理的一个菌株。     

水稻白叶枯病菌致病性分子遗传学基础

 水稻-白叶枯病原菌互作符合基因对基因关系，是研究禾本科植物-病原菌互作的理想模式系统。目前已鉴定和克隆出许多白叶枯病菌致病相关基因。其它革兰氏阴性植物病原细菌致病性分子遗传学和基因组学研究，为揭示水稻白叶枯病菌致病性分子机理提供了丰富的背景知识，其中以发掘TTSS效应分子的研究备受关注。本文将对白叶枯病菌致病性分子机理进行综述，以期为研究水稻-白叶枯病菌互作的功能基因组学提供科学线索。     

水稻与白叶枯病菌互作的基因表达谱分析与差异性表达基因的识别

【目的】从基因组水平上阐明水稻在与白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo)感病互作条件下基因表达反应的特征。【方法】用cDNA-AFLP方法对Xoo接种处理不同时间的水稻细胞进行基因表达谱分析。【结果】在测定的大约4 000个水稻cDNA片段中，363个(9.1%)是差异性表达的，其中295个受Xoo诱导上调表达，68个被抑制下调表达。根据在不同互作时间点的表达特征，它们可分为7种表达类型。对31个差异片段的序列同源性进行分析，发现它们在己公布的水稻全基因组中完全相同的序列，但只有10个基因具有已知或推断的生物学功能，其余21个基因功能未知。用荧光实时定量PCR分析法证实了cDNA-AFLP基因表达结果。【结论】构建了水稻－Xoo感病组合在细胞水平上互作的基因表达谱，从基因组水平上识别了一批受Xoo诱导或抑制表达、与水稻感病反应相关的基因，这些新基因的发现为开展水稻感病功能基因组学的研究提供了材料。     

应用GDPs转录物标记法进行水稻白叶枯病菌早期侵染表达谱分析

 【目的】揭示水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae,Xoo）在侵染水稻叶组织早期的基因表达谱差异。【方法】采用GDPs-Finder计算法,设计了能够覆盖KACC10331基因组全部ORFs的定向引物（GDPs）,对Xoo与水稻互作1、3和7 d的总RNA进行反转录,对病菌cDNA探针进行Cy3/Cy5选择性标记,与含有371个Xoo致病相关基因的芯片进行杂交。【结果】在水稻侵染的不同时期,Xoo致病相关基因表达谱存在差异。与在NBY中生长相比,Xoo在侵染1、3和7 d时分别有42个（18个上调和23个下调）、51个（29个上调和22个下调）和33个（16个上调和17个下调）基因发生了差异表达;其中5个基因是共有上调表达的,5个是共有下调表达的。推测这些基因的差异表达可能与病菌适应寄主体内环境、生长与定殖以及为害与显症过程有关。【结论】应用GDPs转录物标记技术可以成功地进行Xoo侵染过程的表达谱分析,鉴定出的差异表达的基因可以作为功能研究的靶标基因。     

水稻白叶枯病致病性基因研究进展

稻黄单胞菌水稻致病变种[Xanthomonas oryzae pv.oryzae(Xoo)]可引起水稻白叶枯病,是水稻病害中最严重的病害之一,其与水稻互作是基因对基因的关系。Xoo基因组测序的完成极大推动了对Xoo基因功能的研究。为此,该文对近几年来Xoo致病性基因的鉴定情况进行统计,并就致病性基因的突变菌株对水稻接种情况和菌株自身变化进行了归纳,较为详细阐述了当前对Xoo无毒基因的鉴定研究状况,为水稻抗白叶枯病育种以及研究致病基因和致病机制提供理论基础。     

两种黄单胞病菌诱导水稻一氧化氮产生和防卫基因表达的比较研究

 【目的】阐明在不同黄单胞病菌诱导的水稻过敏性细胞死亡(HCD)中的一氧化氮(NO)信号途径及其作用机制。【方法】比较分析了在水稻细胞－番茄斑点病菌(Xanthomonas campestris pv. vesicatoria, Xcv)不亲和互作、水稻－白叶枯病菌(X. oryzae pv. oryzae, Xoo)亲和互作中NO的发生以及NO对水稻防卫基因诱导表达的影响。【结果】Xcv不仅诱导了NO的迸发、NOS活性及其NO合成相关基因(nos和nr)的表达，而且诱导了防卫基因(苯丙氨酸解氨酶基因pal、过氧化物酶基因pox和谷胱苷肽转硫酶基因gst)的表达；Xoo不诱导NO的迸发，抑制了NOS的活性、NO合成相关基因和防卫基因的表达；NO清除剂PTIO和Xoo显著地抑制了Xcv 对防卫基因表达的诱导作用。【结论】Xcv通过NO信号途径诱导了水稻防卫基因的表达和HCD；Xoo 通过NO抑制或解毒机制抑制了由NO介导的防卫基因的表达及其HCD的发生。     

病程相关蛋白质在水稻与白叶枯病菌互作过程中的表达

【目的】了解病程相关(pathogenesis-related,PR)蛋白质在植物防卫体系中的表达模式进而探讨水稻抗病的分子机理。【方法】选取10个前期工作中鉴定的差异转录PR基因,利用免疫印迹(Western blotting,WB)技术检测它们在水稻正常生长和与白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae Xoo)互作过程中的表达丰度变化。【结果】发现随着水稻的生长,Os12g43380、Os12g36830、Os12g36860、Os12g36840、Os02g41670、Os05g35290和Os12g33610的表达逐步增加,一般在开花期达到最高,成熟期有所降低。在白叶枯病抗性基因Xa21介导的水稻-Xoo非亲和互作过程中,检测到Os01g51570、Os01g71680和Os12g36850的表达量上调,Os12g36830、Os12g36840、Os02g41670和Os05g35290的表达量下调,并且发现,在亲和互作和非亲和互作反应中PR蛋白质的变化模式相似。对PR基因上游启动子区进行分析,发现存在与抗病相关的顺式作用元件,其中,ARE、HSE、MBS、TC-rich repeats等元件在抗病相关的PR基因上游出现频率较高。【结论】鉴定了在水稻-Xoo互作过程中发生丰度变化的7个PR蛋白质。     

白叶枯病菌和细菌性条斑病菌多样性的TALE效应 蛋白调控水稻抗（感）病性机理与利用策略

培育和种植抗病品种是防治水稻白叶枯病和条斑病的有效措施。最近几年有关TALE效应蛋白调控水稻抗（感）病性研究取得了突破性进展,这将改变水稻抗性品种培育策略。为此,本文对稻黄单胞菌-水稻互作系统中已知TALE效应蛋白与水稻中的已知或未知抗（感）病基因（R或S）的对应关系进行了归纳,并就tale基因进化及对应水稻R或S基因发掘进行了分析。另外,文中还对以TALE为基础发展而来的TALEN技术遗传修饰水稻感病基因的前景进行了展望。利用TALEN技术可将高产优质但感病的水稻品种（材料）转变为高产优质兼广谱抗病的水稻品种（材料）。     

水稻黄单胞菌avrBs3/PthA家族基因研究进展

 水稻黄单胞菌白叶枯致病变种（Xanthomonas oryzae pv.oryzae，Xoo）和稻生致病变种（X.oryzae pv.oryzicola，Xooc）分别引起水稻白叶枯病（bacterial blight，BB）和水稻细菌性条斑病（bacterial leaf streak，BLS），对中国和世界水稻产量造成较大损失。基因组学揭示，Xoo和Xooc不同小种中存在15～30个数量不等的avrBs3/PthA（avr/pth）家族基因。新近研究结果表明，avr/pth基因既是毒性基因，又是寄主植物先天免疫的抑制因子，还是与抗病基因（R）匹配的无毒基因。Xooc中虽然存在avr/pth基因，但因存在能够抑制avr/pth无毒基因功能的抑制因子，故而未在水稻中发现抗BLS的R基因。除结构上的共有特征外，avr/pth基因间的差异主要表现在102 bp重复单元在每个avr/pth基因中的重复数多少上。avr/pth基因的进化可能由简单进化为复杂，这可能是Xoo和Xooc致病性变异的主要原因。     

水稻白叶枯病抗性研究进展

白叶枯病是世界水稻重要病害之一,且已成为研究植物和病原菌互作的模式,对该病的研究对其它病害有借鉴意义。目前已鉴定出29个抗白叶枯病基因,其中17个基因被定位到染色体上,4个基因已被克隆,在这些工作的基础上,已通过分子标记辅助选择和转基因方法育成了一些抗病新品系,展示了水稻抗白叶枯病分子育种的广阔前景。     

我国水稻白叶枯病菌致病型划分和水稻抗病育种中应注意的问题

水稻白叶枯病(bacterial blight,BB)是我国水稻上的重要病害之一。本文简要概述了我国水稻白叶枯病发生现状,总结了病菌与水稻互作中亲和与非亲和性的决定因子,归纳了水稻感病性和抗病性基因的类型,并对白叶枯病抗性丧失的原因进行了分析,指出防控我国水稻白叶枯病应针对性加强水稻抗性育种工作,并提出了抗性育种以及生产上抗性品种布局中应该注意的问题。     

水稻抗白叶枯病基因及其抗病机理的研究进展

水稻白叶枯病是由Xanthomonasoryzaepv．oryzae致病菌引起的全球性水稻病害。到目前为止,已有26个抗病基因被发现,有10个基因已在染色体上被定位,包括显性基因Xa1、Xa4、Xa21andXa26(t)等和隐性基因Xa5、Xa13等。对大部分抗病基因的抗病机制了解还不是很清楚。利用标记辅助选择(MAS)进行抗病育种是防治白叶枯病的有效途径。在此,综述了已发现的抗水稻白叶枯病基因的种类、分子标记、抗病机制和在抗病育种中的应用。     

云南高原粳稻区白叶枯病菌致病型鉴定及主栽品种抗性反应初析

 从云南高原粳稻区采集分离36份白叶枯病菌株，在包括初步选定的7个高原粳稻白叶枯病菌鉴别品种（毫糯扬、TN1、黄玉、珍珠矮、IR26、南粳33、金南风）在内的29个水稻品种上测定致病型，进一步明确了这7个鉴别品种的有效性。发现菌株与品种之间具有交叉互作反应，菌株与品种之间存在质的特异性互作关系;利用这套鉴别品种可将36个菌株划分为9个致病型，其中Ⅴ型菌为优势菌群，Ⅶ型菌为毒性菌群。云南高原粳稻区的主栽品种多数感病。稻种资源IRBB21（Xa-21）、扎昌龙（Xa-22t，Xa-24t）、IR1545-339(xa-5)对所有参试菌株均表现抗病，在云南高原粳稻育种中具有较好的利用价值。     

云南稻种对水稻白叶枯病抗性的评价

 2000～2001年鉴定了近300份水稻品种（包括云南省主栽品种、近等基因系材料、基因聚合品种等育种材料）对白叶枯病的抗性。其中对测试的白叶枯病菌系表现抗病的有51个,占供试品种的17%,云南省主栽品种如合系等粳稻品种及籼型杂交稻高度感病,说明云南省主栽品种多数对白叶枯病系表现感病,近等基因系材料抗感表现不一,基因聚合品种高抗白叶枯病。     

水稻白叶枯病菌hrp调节基因hrpXoo的克隆与序列分析

 用化学方法诱变水稻白叶枯病菌PXO99A 菌株 ,获得 6株hrp-突变体 ,此突变体除丧失在非寄主烟草上激发过敏反应和在感病寄主水稻上的致病能力外 ,有些缺乏激发烟草产生HR的信号物质 ,有些在胞内存在此信号物质 ,而不能泌至胞外。来自Xanthomonasoryzaepv .oryzaeJXOIII粘粒基因文库的hrp基因克隆pUHRX2 4 5 ,所携hrp基因片段大小为 36 .8kb。系列亚克隆 36 .8kbhrp基因片段及各亚克隆对hrp-突变体功能互补作用的结果显示 ,3.3kbSacI片段为最小酶切功能片段。序列测定和分析结果表明 ,3.3kbhrp片段含hrpX oo基因和含与热激蛋白 90家族有关的 2个开放阅读框hspORF1和hspORF2。HspORF1在蛋白质数据库中未发现序列蛋白。HspORF2与Hsp90 Xo的同源性达 99%。hrpXoo与黄单胞菌中已报道的hrpX基因有很高的同源性(90 %以上 )。在黄单胞菌中高度保守的编码α 螺旋 转 α 螺旋结构的 6 0 bp核苷酸序列 ,在交叉功能互补时是必需的。不含此结构的hrpXoo (1.1kb)片段 ,可使JXOIII的hrp-突变体在水稻上具致病性和在非寄主烟草上激发产生HR ,但不能使来自PXO99A 和RS10 5的hrp-突变体恢复在烟草上激发产生HR的功能。黄单胞菌中已知HrpX的同列比较显示 ,X .oryzae和X .campestris种间在 88、196和 2 4 7位点的氨基酸上有     

建立以lipA和purH为靶基因的RTQ-PCR方法对水稻白叶枯病菌侵染过程进行定量分析

 【目的】建立水稻白叶枯病菌（Xanthomonas oryzae pv. oryzae，Xoo）的分子定量法，测定Xoo侵染水稻植株后不同时间的种群量及其变化。【方法】选用以lipA和purH为靶基因序列的引物P4和P5，用SYBR Green I实时定量PCR（RTQ-PCR）分析在水稻接种植株内的病菌种群量。【结果】与细菌平板计数法相比，RTQ-PCR法定量结果基本相近或略高（≤10倍），变化趋势基本相似，用2对引物P4和P5进行RTQ-PCR定量无显著差异。接种3 d的植株内己有菌量积累，但不显症；从接种5 d开始，细菌明显增加，植株显症并逐渐加重；接种9～14 d菌量增加到峰值，并进入稳定平台期，植株显症严重。病菌种群量与植株显症间的关系可能与细菌群体感应机制有关。【结论】用RTQ-PCR分子定量法可以直接对水稻植株内的Xoo进行动态定量研究；提出了水稻病害分子定量“病菌靶基因拷贝数－DNA总量－种群量－植物病症”的研究模式。     

水稻白叶枯病菌hisF基因的克隆及功能初析

根据黄单胞菌hisF基因的同源性设计简并引物,采用PCR方法从水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)中克隆了hisF同源基因,命名为hisFXoo.NCBI网站蛋白质保守结构域搜索表明,HisFXoo属于组氨酸生物合成蛋白家族的一员,具有与其他HisF蛋白相似的结构.序列比较显示,该基因在黄单胞菌中是相对保守的.同源性搜索比较显示,与水稻条斑病菌(Xoryzae pv.oryzicola,Xooc)的hisF(登录号:DQ372107)同源性高达98%.通过同源重组的方法,构建了hisFXoo的插入突变体,在NA+Amp平板上筛选后,并且经过PCR及Southern杂交验证插入正确.在MMX基本培养基中生长测定发现,hisF突变体生长能力明显下降,证明hisF基因与Xoo生长代谢相关.但是,该突变体仍具有致病性,并且毒力与野生型菌株没有明显差异.     

水稻白叶枯病菌糖基化岛GI基因的分子鉴定

为了阐述水稻白叶枯病菌(Xanthomonas oryzae pv.oryzae,Xoo)糖基化岛(Glycosylation Island,GI)基因的结构特征以及可能的生物学功能,研究通过基因克隆和序列分析,对GI基因结构特征进行了鉴定;通过与铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa,Pa)a型短GI基因的比较,对XooGI基因进行了功能推测分析。用特异性引物进行PCR扩增,从野生型菌株PXO99A基因组中克隆了10个GI基因序列。该GI插在鞭毛基因簇中,上游为转录调控因子基因fleQxoo,下游为鞭毛基体蛋白基因fliExoo。GI基因均为单拷贝,转录方向相同。GI基因核苷酸序列在Xoo和Paa型短岛中同源性达41.98%~78.58%,其中糖基转移酶基因rbfC具有保守结构域(Glycos_transf_2),在病原黄单胞中同源性较高。在GI基因启动子中存在σ54保守结合序列GG-(N10)-GC和转录调控因子FleQxoo结合序列CC-(N4)-C-(N4)-T。因此,XooGI可能具有进化上的结构和功能保守性;其基因转录可能受到σ54和FleQxoo的直接调控。     

水稻黄单胞杆菌水稻变种rpfA基因与毒性相关

水稻黄单胞杆菌水稻变种产生两种顺乌头酸酶（XooAcanA和XooAcanB)。编码其中的XooAcanA的rpfA基因已被克隆在重组质粒pGXN3000中。本研究通过转座子诱变pGXN3000及标记置换方法，构建了rpfA突变体T3A01。虽然T3A01丧失了合成顺乌头酸酶XooAcanA的能力，但仍然能够合成顺顺乌头酸酶XooAcanB，植株实验结果表明，该突变体的生长速率与野生型相似。但是引起的症状与野生型相比明显减弱，说明水稻黄单胞杆菌水稻变种的rpfA基因与毒性相关。