溶血性曼氏杆菌PCR检测方法的研究

溶血性曼氏杆菌是导致牛、羊呼吸道传染病的一种病原菌。为快速、准确诊断由本菌导致的疾病 ,从基因库中获得溶血性曼氏杆菌( M.haemolytica )的基因序列 ,再从其基因序列中获得与其它细菌包括 M.annheimiagranulomatis,M.varigena ,M.ruminalis,M.glucosidal ,M.annheimiaspp和多杀性巴氏杆菌等不同的基因片段 ,设计成引物 ,建立了特异性好、敏感性高的 M.haemolytica PCR检测方法。结果表明 ,除溶血性曼氏杆菌为阳性外 ,其余所有细菌均为阴性 ,特异性为 1 0 0 % ,最小检出量为 8× 1 0 2 cfu/ m L 曼氏杆菌或 1 / 1 0个单个菌落。检验人工感染牛 ,检出率为 75%。此PCR检测方法的建立 ,为 M.haemolytica提供了一个快速诊断方法     

一起藏绵羊溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌混合感染的实验室诊断

为查明2021年四川省甘孜州某藏绵羊养殖场呼吸道疾病的发病病因,本研究采用PCR方法对送检的5份深部鼻腔棉拭子进行了“山羊副流感病毒3型、牛病毒性腹泻-黏膜病病毒、牛冠状病毒、多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、绵羊肺炎支原体、丝状支原体簇成员”等常见呼吸道病原的检测。结果显示：多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌为阳性,其他病原为阴性;通过细菌分离培养成功获得5株溶血性曼氏杆菌和5株多杀性巴氏杆菌;分型结果显示5株溶血性曼氏杆菌为A2型,5株多杀性巴氏杆菌为D型。结合临床症状,确诊该场藏绵羊的呼吸道疾病是由A2型溶血性曼氏杆菌和D型多杀性巴氏杆菌混合感染所致。     

某牛场犊牛呼吸道疾病的诊断与药敏试验

2017年3月份,黑龙江省五常市某规模化奶牛场发生犊牛急性肺炎,为了确诊其病因,无菌采取7份呼吸道症状犊牛鼻拭子进行细菌分离鉴定,同时进行生化试验、PCR鉴定和药敏试验。结果表明:共分离得到3株细菌,符合大肠杆菌、巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌生化特性;PCR引物能有效扩增巴氏杆菌OmpH基因、溶血性曼氏杆菌lkt A基因和大肠杆菌Sta基因;分离的大肠杆菌对恩诺沙星、环丙沙星、阿米卡星中敏,巴氏杆菌对恩诺沙星、阿莫西林、青霉素高敏,溶血性曼氏杆菌对阿米卡星、头孢唑林、青霉素高敏;经检查7份鼻拭子中大肠杆菌感染1份,溶血性曼氏杆菌感染1份,巴氏杆菌感染5份。说明该牛场细菌污染严重,应引起重视。     

多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌混合感染引起山羊肺炎的诊断

青海省湟中区某山羊场发生呼吸道疾病,为确定引起本次呼吸道疾病的病原,笔者对病死羊进行剖检,并进行病原分离、鉴定。同时,采用PCR方法,对多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、绵羊肺炎支原体和丝状支原体等呼吸道相关病原进行分子检测。结果发现,患羊临床表现以咳嗽、呼吸困难、精神萎靡和鼻内有粘性分泌物为特征的肺炎,细菌分离获得多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌,未分离获得其他细菌性病原和支原体。PCR检测发现多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌阳性。根据临床症状、剖检变化和实验室检测,最后确诊为由多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌共同感染山羊引起的肺炎。     

四川省某肉牛场犊牛呼吸道疾病的病原学诊断

四川省某肉牛场新引进的犊牛出现发热、咳嗽、呼吸困难、流鼻涕等呼吸道症状,为了解该病的病因,本试验采集了10份病牛深部鼻腔棉拭子样本,采用PCR方法检测了牛冠状病毒（BCoV）、牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）、牛腺病毒3型（BAV-3）、牛支原体（M.Bovis）、多杀性巴氏杆菌（P.multocida）、溶血性曼氏杆菌（M.haemolytica）及睡眠嗜组织菌（H.somni）等8种常见呼吸道病原。结果显示：BCoV检出率为70%,BVDV检出率为30%,其余病原均未检出,表明该肉牛场犊牛的呼吸道疾病是由BCoV和BVDV混合感染引起的。     

牛源荚膜血清A1型溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

探明一起牛运输热的病原及生物学特性,本研究采集病死牛心血、肺脏,对其进行细菌分离、生化试验和PCR鉴定,并对分离株进行毒力基因检测、致病性研究。结果显示,该分离菌为革兰氏阴性菌,呈球状或短杆状、两端钝圆、两极浓染。生化试验结果显示,分离菌能发酵葡萄糖、麦芽糖、阿拉伯糖、甘露醇、甘露糖、乳糖、木糖等碳水化合物,不发酵脲酶和吲哚,产生少量酸而不产气,符合溶血性曼氏杆菌的生化特性。PCR鉴定为荚膜血清A1型溶血性曼氏杆菌,并完成了毒力基因的检测。结果表明,引起该批牛运输热的病原为携带毒力基因的荚膜血清A1型溶血性曼氏杆菌,本研究结果为进一步研究溶血性曼氏杆菌的致病机制、防控措施等提供参考。     

溶血性曼氏杆菌的分离鉴定

溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica)原名溶血性巴氏杆菌(Pasteurella haemolytica),是巴氏杆菌属的一个新成员.该菌是绵羊肺炎、新生羔羊急性败血症的病原菌,还可以导致牛的呼吸道疾病、羊的呼吸道疾病和败血症,也是牛的运输热、圈舍热的主要致病菌.     

绵羊肺脏中溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及其药物敏感性分析

为了对引起绵羊肺炎的病原进行分离、鉴定和耐药性分析,本研究通过无菌采集绵羊肺脏并对细菌进行分离纯化、生化试验和PCR鉴定,然后对所得到的溶血性曼氏杆菌分离株进行药物敏感性研究。结果显示,分离纯化得到的细菌为革兰氏阴性短杆菌,具有弱溶血性,经生化试验和PCR鉴定为溶血性曼氏杆菌;耐药性分析显示该菌株对恩诺沙星、庆大霉素、四环素等大部分药物敏感。本研究为绵羊溶血性曼氏杆菌感染的有效防制提供有用的信息和数据。     

一种由5种细菌抗原和2种免疫原组成的新型多价牛细菌性呼吸道疾病疫苗安全性和效价检测

牛细菌性呼吸道疾病是造成犊牛高死亡率和巨大经济损失的最严重问题之一。由于没有多价疫苗,牛细菌性呼吸道疾病疫苗接种程序很复杂。本研究研发了新型多价牛细菌性呼吸道疾病疫苗,并进行了安全性和效价检验。新型多价牛细菌性呼吸道疾病疫苗由5种细菌抗原和2种免疫原组成,其中细菌抗原包括A型溶血性曼氏杆菌菌素、多杀性巴氏杆菌菌素、睡眠嗜血杆菌菌素、牛支原体菌素、化脓性隐秘杆菌菌素;免疫原包括A型溶血性曼氏杆菌白细胞类毒素、多杀性巴氏杆菌外膜蛋白。与没有接种疫苗的猪相比,接种5种细菌抗原的几内亚猪的ELISA抗体滴度升高。在本研究中,新型多价牛细菌性呼吸道疾病疫苗对犊牛和妊娠牛是安全的。用溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌对犊牛攻毒,和没有接种疫苗的犊牛相比,接种疫苗的犊牛平均日增重和抗体滴度明显增加（P〈0.05）,呼吸道症状极显著减轻（P〈0.01）,治疗频率极显著减少（P〈0.01）。有趣的是,溶血性曼氏杆菌白细胞类毒素和牛支原体抗体滴度与呼吸道症状减轻有密切相关性。接种新型多价牛细菌性呼吸道疾病疫苗将会是防制牛细菌性呼吸道疾病的一种经济有效的措施。     

兔多杀性巴氏杆菌16S rRNA PCR检测方法的建立

为建立一种快速准确检测兔多杀性巴氏杆菌(P.multocida)的PCR方法,本研究以P.multocida的高度保守的16S rRNA为靶基因,参考已公布的P.multocida的16S rRNA基因设计1对特异性引物,优化PCR反应条件,建立了P.multocida PCR快速检测方法。该PCR方法的敏感性达到60 cfu/mL,采用该PCR方法扩增P.multocida标准株和分离株均能扩增出643 bp的目的片段,扩增兔大肠杆菌、支气管败血波氏杆菌结果为阴性,证明本实验所建立的P.multocida PCR检测方法快速、敏感、特异、可靠,可用于P.multocida的快速鉴定与诊断。同时用建立的PCR方法对临床疑似病兔的脏器分离菌进行扩增,可扩增出目的条带,与细菌的分离结果相一致。     

某牛场奶牛A型多杀性巴氏杆菌的分离鉴定

湖北某奶牛场牛群爆发体温升高、呼吸困难、流涎及颈胸皮下气肿等症状的疾病,部分发病牛衰竭死亡,为确诊牛场牛群发病原因并提出防控方案,本试验采集死亡牛的心脏、肝脏、肺脏及气管组织进行病原菌的分离纯化及PCR鉴定,并对鉴定的病原菌进行生化特性鉴定、致病性试验和药物敏感性分析;同时提取患牛血清RNA,开展牛流行热病毒的RT-PCR鉴定。结果显示,病料在类胸膜肺炎固体培养基上不生长,生化特性鉴定显示能形成靛基质、不发酵肝糖和肌醇;牛流行热病毒RT-PCR扩增阴性;所分离的病原菌经16S rRNA及牛A型多杀性巴氏杆菌特异性引物PCR扩增阳性;致病性试验显示该病原可致死小鼠,且能从死亡小鼠体内分离到感染菌;药敏试验结果显示该病菌对头孢哌酮、左氧氟沙星敏感,其他20种临床常见药物表现耐药。综上所述,该牛场患病牛确诊为牛A型多杀性巴氏杆菌感染,建议根据药敏试验结果选择敏感药物,对患病牛进行隔离治疗,疑似患病牛隔离观察,同时加强通风,及时清理污物并消毒,改善饲养管理,避免拥挤、寒冷及长途运输等应激因素。     

禽霍乱巴氏杆菌的分离鉴定及基因分型

为确定疑似禽霍乱病例病原种类及其病原基因型,本研究采用细菌分离技术对病原菌进行实验室分离培养,应用传统方法和分子生物学方法对分离细菌进行鉴定,并应用PCR扩增和基因序列分析对分离细菌进行基因分型。结果显示,分离菌具有多杀性巴氏杆菌（Pasteurella multocida,Pm）典型培养特征,菌落形态和菌体染色特征、生理生化特性均与多杀性巴氏杆菌相符;PCR扩增到457 bp的基因片段。采用5对分型引物对分离菌进行基因分型显示,仅有A型引物扩增到大小1 050 bp的目的基因片段,序列分析也显示分离菌荚膜基因与A型多杀性巴氏杆菌参考菌株荚膜特异性基因同源性高达97.6%~100.0%,系统进化与A型多杀性巴氏杆菌处于同一进化分支。结果表明,疑似禽霍乱病例病原为A型多杀性巴氏杆菌,本研究结果将为禽霍乱的防控提供参考资料。     

牛溶血曼氏杆菌的分离鉴定及药敏试验

对1例不明原因死亡牛肺脏进行了病原学分离及鉴定。根据已报道的溶血曼氏杆菌基因序列,设计合成引物。通过细菌分离、染色、16S rRNA、溶血曼氏杆菌特异性PCR扩增、荚膜血清型及生化试验来确定该菌株。结果确定该牛感染了溶血曼氏杆菌,进一步分型确定为血清6型。成功从牛肺脏中分离到该菌株,从药敏试验结果可以看出该菌对大多数药物敏感。该试验对牛溶血曼氏杆菌病临床用药具有参考意义,也为牛溶血曼氏杆菌病临床诊断与治疗提供了技术参考。     

一起牦牛呼吸道疾病的病原学诊断

2022年2月,川西北某地牦牛暴发以呼吸道症状为突出特征的传染病。为确定病因,对发病牦牛进行了相关病原的病原学诊断。共采集13头发病牦牛的20份病料,采用PCR方法对牛病毒性腹泻病毒（BVDV）、牛副流感病毒3型（BPIV-3）、牛传染性鼻气管炎病毒（IBRV）、牛冠状病毒（BCoV）、牛呼吸道合胞体病毒（BRSV）、牛腺病毒3型（BAdV-3）以及多杀性巴氏杆菌（P. multocida,Pm）、溶血性曼氏杆菌（M. haemolytica,Mh）和牛支原体（M. bovis,Mb）等9种牛呼吸道病原进行检测。结果显示：在20份样本中共检测出IBRV、BAdV-3和Pm 3种病原,且存在混合感染,其他病原未检出;4份全血样本中检测出3份IBRV、1份BAdV-3阳性,1份胎盘组织样本中检出IBRV阳性,8份鼻拭子样本中检出3份IBRV、5份BAdV-3阳性,2份流产中阴道拭子中检出2份BAdV-3阳性,5份肺脏组织样本中检出4份Pm阳性;进一步对IBRV和Pm进行分型鉴定,确定该地牦牛感染的为1.2型IBRV和A型Pm。结果表明,引发该地牦牛呼吸道疫病的是1.2型IBRV、BAdV-...     

死亡野生大熊猫的细菌分离鉴定

2003年12月，四川省宝兴县送检1只死亡的大熊猫。通过细菌分离鉴定，分离出多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌。结合临床症状、细菌分离培养及寄生虫检验，可以认为大熊猫是因年老体衰、抵抗力下降、感染细菌和寄生虫而死亡。     

一种由5种细菌抗原和2种免疫原组成的新型多价牛细菌性呼吸道疾病疫苗安全性和效价检测

牛细菌性呼吸道疾病是造成犊牛高死亡率和巨大经济损失的最严重问题之一。由于没有多价疫苗,牛细菌性呼吸道疾病疫苗接种程序很复杂。本研究研发了新型多价牛细菌性呼吸道疾病疫苗,并进行了安全性和效价检验。新型多价牛细菌性呼吸道疾病疫苗由5种细菌抗原和2种免疫原组成,其中细菌抗原包括A型溶血性曼氏杆菌菌素、多杀性巴氏杆菌菌素、睡眠嗜血杆菌菌素、牛支原体菌素、化脓性隐秘杆菌菌素;免疫原包括A型溶血性曼氏杆菌白细胞类毒素、多杀性巴氏杆菌外膜蛋白。与没有接种疫苗的猪相比,接种5种细菌抗原的几内亚猪的ELISA抗体滴度升高。在本研究中,新型多价牛细菌性呼吸道疾病疫苗对犊牛和妊娠牛是安全的。用溶血性曼氏杆菌和多杀性巴氏杆菌对犊牛攻毒,和没有接种疫苗的犊牛相比,接种疫苗的犊牛平均日增重和抗体滴度明显增加(P<0.05),呼吸道症状极显著减轻(P<0.01),治疗频率极显著减少(P<0.01)。有趣的是,溶血性曼氏杆菌白细胞类毒素和牛支原体抗体滴度与呼吸道症状减轻有密切相关性。接种新型多价牛细菌性呼吸道疾病疫苗将会是防制牛细菌性呼吸道疾病的一种经济有效的措施。     

猪多杀性巴氏杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

用PCR方法配合生化鉴定，从有肺炎症状猪的肺脏及进行性萎缩性鼻炎(Progressive atrophic rhinitis，PAR)症状猪的鼻拭子中分离出66株多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida，Pm)。然后做了药敏试验，并用PCR方法对这66株Pm进行分型及毒素基因的检测，用豚鼠皮肤坏死试验及小鼠致死试验对产毒素多杀性巴氏杆菌(Toxigenie Pasteurella multocida，T^ Pm)进一步鉴定。结果显示PCR鉴定与生化鉴定Pm结果完全一致；PCR分型表明有46株为D型Pm，18株为A型：Pm，1株为B型Pm，1株无法定型；有8株用PcR检测为T^ Pm；豚鼠皮肤坏死试验及小鼠致死试验对这8株T^ Pm的进一步鉴定也表明均为产毒素菌株。所鉴定的8株T^ Pm都为D型，都分离于有严重PAR症状的猪。     

黄牛阿氏肠杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

为查明广西某牛场病死黄牛的病死原因,提供科学的综合防治措施,用细菌分离、生化鉴定、细菌16S rRNA测序、体外药敏试验、常见病原的PCR检测等方法对送检的病料进行检测。结果显示,化脓隐秘杆菌、多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、肺炎克雷伯菌、牛副流感病毒3型、牛病毒性腹泻病毒、牛支原体和牛传染性鼻气管炎病毒PCR检测结果均为阴性。而从出血肺组织中分离到1株能引起小鼠致死的短杆状革兰阴性菌,该细菌在血琼脂平板上呈灰白色菌落,不溶血;在麦康凯培养基上呈圆形灰色、轻度隆起、光滑湿润、边缘整齐、直径为0.2 mm^0.3 mm的针尖状小菌落;在营养肉汤中生长呈絮状物浑浊。生化鉴定发现其符合阿氏肠杆菌的生化特性,16S rRNA测序结果显示该菌与阿氏肠杆菌的基因序列同源性为99%。体外药敏试验结果显示该菌仅对头孢类药物敏感,头孢类药物作用效果强度为头孢曲松钠>头孢地嗪钠>头孢哌酮钠舒巴坦钠。     

肉牛克雷伯氏菌和溶血性曼氏杆菌混合感染的实验室诊断

2017年12月,大庆安达市某牛场发生一起以30~50日龄哺乳犊牛呼吸困难、流鼻涕、食欲减退和高死亡率为特征的传染病,发病率为30%,死亡率达50%以上,给牛场造成了很大的经济损失。本试验通过临床症状观察、病畜剖检、细菌分离鉴定、PCR诊断等实验室诊断方法,最终确诊为牛流克雷伯氏菌与溶血性曼氏杆菌混合感染。并对分离细菌进行药敏试验,结果显示,硫酸链霉素、和氟苯尼考对溶血性曼氏杆菌和牛克雷伯氏菌高度敏感,而庆大霉素和卡那霉素耐药,从此次试验中总结出肉牛溶血性曼氏杆菌临床症状与多杀性巴氏杆菌症状有许多相似之处,所以必要时要进行实验室PCR诊断来确保万无一失,肉牛克雷伯氏菌在牛只应激抵抗力低下时极其易感,要做好预防措施,一旦发病及时治疗。     

牛多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌的分离鉴定及致病力评估

牛呼吸道疾病(bovine respiratory disease, BRD)是牛场中重要的疾病之一,给我国养牛业造成了严重的经济损失。多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)和溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica,Mh)是与BRD相关的主要细菌性病原。为分离纯化到目前Pm和Mh流行的优势毒株,建立合适的小动物攻毒模型,给BRD疫苗研制提供有效的疫苗候选株。本研究首先从患BRD牛的病料中进行Pm和Mh的检测、分离鉴定,确定基因型且评估分离株对小鼠的致病性,筛选合适的疫苗候选株。结果显示,本研究在2022年11-12月从我国3个省份的6个牛场采集到48份患有BRD的牛鼻拭子,PCR检测结果显示Pm的检出率为47.9%(95%CI:33.3～62.8),Mh的检出率为37.5%(95%CI:24.0～52.6),Pm/Mh共感染的检出率为18.8%(95%CI:8.9～32.6)。在阳性样本中分离纯化得到12株Pm,经血清型鉴定均为A型多杀性巴氏杆菌(PmA);分离到11株Mh,其中7株为A1型,4株为A6型,且在同一头牛的鼻拭子中同时分离...