丝状支原体簇和多杀性巴氏杆菌双重PCR方法的建立及应用

本研究旨在建立丝状支原体簇和多杀性巴氏杆菌的双重PCR检测方法,从而为临床上同时检测这2类病原的感染提供一种更方便、快捷、准确的工具。本研究采用2对特异性检测丝状支原体簇和多杀性巴氏杆菌的引物,对PCR反应体系和反应条件进行了优化,并对双重PCR的特异性及敏感性进行了评价,随后采用该方法对52份临床样本进行了检测。结果显示,所建立的双重PCR方法能同时扩增丝状支原体簇成员和多杀性巴氏杆菌的DNA,而对来源于其他常见病原的DNA均无扩增;对丝状支原体簇和多杀性巴氏杆菌的最低检测限分别为24.8和28.9 pg;能成功地从临床样本中检测丝状支原体簇成员和多杀性巴氏杆菌。结果表明,本研究所建立的双重PCR方法具有很好的特异性和敏感性,为临床丝状支原体簇和多杀性巴氏杆菌感染的快速诊断、病原鉴定及流行病学调查提供了有效的方法。     

山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌双重 PCR 检测方法的建立

为建立一种能够同时检测山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌的双重 PCR 方法,本研究采用2对特异性引物,对退火温度和引物浓度比进行了优化,成功建立了一种能同时检测上述两种病原的双重 PCR 方法。结果显示,该方法具有很好的特异性,仅对山羊支原体山羊肺炎亚种和多杀性巴氏杆菌有扩增,而对其他常见的羊呼吸道病原无扩增;该方法对两种病原的检测限分别为32 pg 和50 pg,与单独 PCR相同;26份临床样品中山羊支原体山羊肺炎亚种的检出率为23．1％,多杀性巴氏杆菌的检出率为26．9％。所建立的双重 PCR 具有特异性好、灵敏度高的特点,为临床上这两种病原感染的快速诊断和流行病学调查等提供了更为有用的手段。     

多杀性巴氏杆菌PCR检测方法的建立

为了研究多杀性巴氏杆菌的PCR检测方法,试验采用特异性引物对32个经鉴定为巴氏杆菌的菌株以及其他5种常见的病原菌进行了扩增。结果表明:该引物对巴氏杆菌的检出率达到91%,对其他5种病原菌的检测结果均为阴性。说明试验所设计的引物可用于巴氏杆菌感染的诊断。     

产毒素多杀性巴氏杆菌菌落双重PCR检测方法的建立

为建立快速特异的PCR方法以及同时检测并区分产毒素与非产毒素多杀性巴氏杆菌,本研究根据GenBank登录的多杀性巴氏杆菌KMT1基因和toxA毒素基因序列,设计合成了2对特异引物。特异性试验表明产毒素多杀性巴氏杆菌C51-6扩增出了460bp和1854bp的2条目的片段,而不产毒素多杀性巴氏杆菌、大肠埃希菌、胸膜肺炎放线杆菌、猪链球菌、支气管败血波氏杆菌、副猪嗜血杆菌和鸡白痢沙门菌的扩增均为阴性;敏感性试验表明该PCR方法能从含450CFU的菌液中扩增出相应的目的片段。同时用豚鼠皮肤坏死试验和小鼠致死试验对该PCR方法进行了验证。     

猪多杀性巴氏杆菌PCR检测方法的建立及应用

设计了一对用以检测猪多杀性巴氏杆菌的引物。对临床送检的有肺炎症状或萎缩性鼻炎症状的发病猪的病料进行细菌培养，然后挑菌做PCR，同时对可疑菌落纯化培养后做生化鉴定。结果，从不同省(市)送检的病料中分离鉴定出66株多杀性巴氏杆菌，PCR检测结果与生化鉴定结果完全符合；该引物对其他6种猪的常见呼吸道病原菌扩增均为阴性；该PCR检测方法能检测出cfu为10^3的巴氏杆菌模板。     

牛多杀性巴氏杆菌的检验

20 0 3年8月,贵州省某养牛场1头母牛突然发病,不食,不反刍,鼻镜干燥,被毛蓬松,高烧4 1.5℃,精神沉郁,不愿行走,下颌肿大,呼吸困难,口流涎,病程不到一天即倒地死亡。经剖检,见颌下淋巴肿大、充血,肺脏呈出血性炎症,肺门淋巴结呈紫红色,心冠脂肪有针尖大出血点,肝质脆,呈土黄色。     

应用双重PCR检测产毒素多杀性巴氏杆菌

参照有关文献设计了2对引物。分别扩增多杀性巴氏杆菌的Kmt及toxA基因。以使同时检测并区分产毒素与非产毒素多杀性巴氏杆菌。该PCR能检出10^3cfu菌量的模板。特异性试验表明。这2对引物都不能从猪的其他6种常见病原菌扩出特异性的带。对扩增的2个PCR产物测序结果表明，2序列都有很高的保守性，从而进一步证明了该PCR方法的特异性及灵敏性。临床应用，从386份病料分离出66株多杀性巴氏杆菌，其中有8株均能同时扩出457bp和864bp的片段，而其他54株只能扩出457bp的片段。     

羊多杀性巴氏杆菌与布鲁氏菌双重套式PCR检测方法的建立及应用

为了建立一种高灵敏度和强特异性的羊多杀性巴氏杆菌与布鲁氏菌的双重检测方法,根据多杀性巴氏杆菌kmt1基因序列和布鲁氏菌BCSP31基因序列分别设计了内外两对引物,构建了双重套式PCR检测方法。结果表明,该方法可以特异性扩增kmt1和BCSP31片段,并能从多种组织样本的DNA中准确检测到多杀性巴氏杆菌与布鲁氏菌的核酸片段。检测沙门氏菌、猪链球菌、大肠埃希氏菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、鲍曼不动杆菌、海藻糖巴氏杆菌和斯氏假单胞菌均为阴性;对于kmt1的检测下限为70.9 copies/μL,对于BCSP31检测下限为89.5 copies/μL;用于检测动物的组织样本符合率为100%。建立的方法有良好的敏感性、特异性和适应性,可以用于动物检疫诊断。     

牛支原体双重PCR检测方法的建立

为鉴别牛支原体(Mycoplasma bovis)与丝状支原体丝状亚种SC(M.mycoides subsp.mycoides SC),本实验通过优化M.bovis特异性引物pMB81-1/pMB81-2s和MmmSC特异性引物SC1/SC2的退火温度,建立了鉴别M.bovis和MmmSC的双重PCR检测方法。该方法能够分别由M.bovis和MmmSC扩增得到528bp和270bp片段。敏感性试验结果显示该方法检测M.bovis和MmmSC培养物的最低浓度分别为106cfu/mL和105cfu/mL。特异性试验结果显示,该方法对无乳支原体代表株PG2、丝状支原体丝状亚种LC型代表株Y-goat、山羊支原体山羊肺炎亚种Mccp、绵羊支原体Y-98、猪鼻支原体BST-7、巴氏杆菌以及结核分枝杆菌扩增结果均为阴性。应用该方法对临床病料的检测结果与培养鉴定结果的符合率为100%,表明该方法具有良好的特异性和敏感性,可以应用于临床检测。     

牛多杀性巴氏杆菌疫苗研究进展

牛巴氏杆菌病是由牛多杀性巴氏杆菌感染所致的一种急性、热性、败血性传染病。该病给养牛业造成巨大经济损失,使用疫苗进行免疫接种是防控本病的主要措施。本文就牛多杀性巴氏杆菌灭活疫苗、弱毒疫苗、亚单位疫苗、基因工程疫苗、联合疫苗及疫苗佐剂比较研究进行综述,以供同行参考。     

兔多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌双重PCR检测方法的建立及应用

根椐Gen Bank公布的兔多杀性巴氏杆菌16S r RNA和支气管败血波氏杆菌fim N基因序列,设计两对引物,在建立两种细菌单项PCR检测方法的基础上,优化双重PCR反应条件,建立了两种细菌的双重PCR检测方法,用这两对引物对同一样品中的兔多杀性巴氏杆菌、支气管败血波氏杆菌核酸为模板进行双重PCR扩增,结果可同时扩增兔多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌的258bp和449bp的特异性片段,而对其他4种兔病原菌的扩增结果均为阴性。敏感性测定结果表明,对兔多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌的最低核酸检出限分别均为1pg。通过对78份临床病料检测,将建立的双重PCR技术和单项PCR方法进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为100%。表明建立的双重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这兔多杀性巴氏杆菌和支气管败血波氏杆菌的同时检测和鉴别诊断。     

兔源A型多杀性巴氏杆菌双重PCR检测方法的建立

为建立一种特异性强且敏感性高的兔源A型多杀性巴氏杆菌快速检测方法,本研究以兔源A型多杀性巴氏杆菌kmt1和hyaD基因为目的基因,设计2对特异性引物进行双重PCR扩增,经反应条件优化,建立检测兔源A型多杀性巴氏杆菌的双重PCR方法。该方法的最佳退火温度为57.8℃,最佳混合引物浓度为0.8μmol/L。该方法特异性强,对兔源A型多杀性巴氏杆菌为kmt1和hyaD基因双阳性,对兔源D型和F型多杀性巴氏杆菌为kmt1基因单阳性,对兔源其它细菌性病原和阴性对照则均为阴性。该方法敏感性高,对兔源A型多杀性巴氏杆菌kmt1和hyaD基因的最低检出限分别为1×10³拷贝/μL和1×10⁴拷贝/μL。该方法重复性好,且与已报道的多重PCR方法的符合率高达96.12%。本研究建立的双重PCR方法对兔源A型多杀性巴氏杆菌具有良好的特异性和敏感性,且重复性好、准确性高,为该病原的快速检测提供了有力的技术支持。     

牛源多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌双重PCR检测方法的建立与应用

多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)和溶血性曼氏杆菌(Mannheimia haemolytica,Mh)是栖息于牛呼吸道的2种常见细菌,可引发牛的呼吸道疾病,对养殖业产生一定经济损失。为提高这2种细菌所导致疾病的临床诊断效率,本研究根据Pm的Kmt1基因、Mh的Lkt基因序列分别设计了特异性引物,建立了一种同时检测2种细菌的双重PCR检测方法。结果显示,建立的双重PCR方法对其他牛源细菌及病毒检测结果均为阴性,Pm、Mh病原基因组DNA的检测下限分别为1.57×10⁵,1.98×10⁶ copies/μL,表明该方法具有较好的特异性和敏感性。应用此双重PCR方法对宁夏地区118份临床样品进行了检测,结果显示Pm的检出率为57.63%(68/118),Mh的检出率为30.51%(36/118),混合感染检出率为24.58%(29/118),而且双重PCR检测结果与单一PCR检测结果一致,表明该方法可用于临床检测。Pm和Mh 2种病原双重PCR检测方法的建立,为牛呼吸道疾病的临床诊断提供了一种方便、快捷和准确的检测...     

猪多杀性巴氏杆菌PCR检测方法的建立及其应用

设计了1对用以检测猪多杀性巴氏杆菌的引物。对临床送检的有肺炎症状或萎缩性鼻炎症状的发病猪的病料进行细菌培养．然后挑菌做PCR，同时对可疑菌落纯化培养后做生化鉴定。结果，从不同省(市)的送检病料中分离鉴定出66株多杀性巴氏杆菌，PCR检测结果与生化鉴定结果完全符合；该引物对其他6种猪的常见呼吸道病原菌的扩增结果均为阴性；该PCR检测方法能检出CFU为10^3／mL的巴氏杆菌模板。     

牛多杀性巴氏杆菌病的诊治

正牛多杀性巴氏杆菌病又称牛出血性败血症,俗称牛出败,是由多杀性巴氏杆菌引起的一种急性、热性传染病,以高热、肺炎、急性胃肠炎以及内脏器官广泛性出血为特征。该病一年四季都可发生,传播速度快、死亡率高,多为散发,病菌存在于病畜的全身各组织、体液、分泌物及排泄物中,经消化道和呼吸道感染,寒冷、闷热、潮湿、拥挤、通风不良、饲料突变、营养缺乏等因素可诱发本病。近年来,动物防疫体系不断健全和完善,牛出败在一定程度上得到了     

牛多杀性巴氏杆菌病的诊治

牛多杀性巴氏杆菌病又称为牛出血性败血症,简称牛出败,是由多杀性巴氏杆菌感染引起的一种急性热性出血性传染性疾病,该种疾病多为散发,有时也呈现地方性流行。牛多杀性巴氏杆菌在牛群中传播速度快,危害大,造成的死亡率高,对畜牧业造成的影响十分严重。最近几年,随着内蒙古丰镇市畜牧养殖产业不断向前发展,牛多杀性巴氏杆菌病呈现高发趋势,常常因为防控不及时,给养殖者造成严重经济损失。因此,做好该种疾病的诊断防治工作就显得十分重要了。笔者主要结合实际案例,就一起牛多杀性巴氏杆菌病的临床症状、病理学变化、实验室诊断方法和防治进行分析。     

兔多杀性巴氏杆菌和兔出血症病毒双重PCR检测方法的建立及初步应用

为建立兔多杀性巴氏杆菌(Pm)和兔出血症病毒(RHDV)的双重PCR检测方法,本研究根据Pm kmt1基因和RHDV VP60基因保守区域,设计2对特异性引物,经PCR分别扩增Pm kmt1基因和RHDV VP60基因保守区域,构建重组质粒p MD-Pm和p MD-RHDV,并经菌液PCR和测序鉴定后作为重组质粒标准品。经各反应条件优化后初步建立了检测Pm和RHDV的双重PCR方法。反应条件优化结果显示,该方法的最适退火温度为59℃,扩增kmt1和VP60基因的最优引物浓度均为0.5μL (10μmol/L)。对Pm和RHDV及其他病原包括兔源支气管败血波氏杆菌、产气荚膜梭菌等20种相关病原的特异性试验结果显示,除Pm和RHDV有特异性扩增条带外,其余相关病原均无扩增条带,特异性较强。将两种重组质粒标准品分别10倍倍比稀释并等体积混合后作为模板,经该双重PCR方法扩增。结果显示,该方法对p MD-Pm的检测限为17.9拷贝/μL,对p MD-RHDV的检测限为1 260拷贝/μL,敏感性较高;对两种病原的DNA和cDNA混合物的批内和批间重复性试验结果均一致,重复性较好。对100份临床...     

禽多杀性巴氏杆菌PCR检测方法的初步建立

禽多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,PM)是引起禽霍乱的一种病原菌,能快速引起家禽的败血症等一系列病症,给我国的家禽业造成了巨大的经济损失。试验通过在Gene Bank中查询禽多杀性巴氏杆菌的全基因组序列,从而找到PM的保守序列,运用Primer5设计引物,常规PCR后得到目的核酸扩增产物。经过敏感性、特异性、干扰性等试验确定了该方法的特异性和稳定性。结果证明该方法特异性强,敏感性高,干扰性极低,并且与生化鉴定得出的结果有较高的符合率。该方法简单易操作,适合广泛应用于临床以检测禽多杀性巴氏杆菌病。     

牛多杀性巴氏杆菌病的诊治

对一个村连续2年出现牛猝死的病例进行诊断。通过细菌分离、生化鉴定和16S r RNA基因序列测定,诊断为多杀性巴氏杆菌引起的牛出败。用荚膜PCR方法进行定型,证实为B型。根据药敏试验结果采用头孢类抗生素进行预防与治疗,结合疫苗免疫,防控效果显著。     

兔多杀性巴氏杆菌16S rRNA PCR检测方法的建立和应用

以兔多杀性巴氏杆菌的高度保守的16S rRNA为靶基因,参考已公布的多杀性巴氏杆菌的16SrRNA基因设计1对特异性引物,优化PCR反应条件,建立了兔多杀性巴氏杆菌PCR快速检测方法。该PCR方法的敏感性达到60cfu/mL,使用建立的PCR方法扩增兔多杀性巴氏杆菌标准株和分离株均能扩增出643bp的目的片段,扩增兔大肠杆菌、支气管败血波氏杆菌结果为阴性,证明本试验所建立的兔多杀性巴氏杆菌病原PCR检测方法敏感、特异、可靠。