魏氏梭菌α毒素核酸探针的制备和应用

根据GeneBank上发表的A型魏氏梭菌α毒素基因序列,设计合成了一对特异性引物,通过PCR的方法,扩增出了大小为470 bp的α毒素基因的部分片段。应用地高辛标记法来标记该片段,制备了α毒素基因探针,该探针只与魏氏梭菌DNA发生阳性反应,与其它多种细菌DNA不发生反应;该探针在1∶1000的工作浓度下,能检出1~5pg/uL的魏氏梭菌基因组DNA。应用该探针对33株魏氏梭菌进行核酸杂交(Dot-Blotting)检测,结果表明该探针具有良好的特异性和灵敏性,可用于对魏氏梭菌的诊断检测以及流行病学调查。     

魏氏梭菌α毒素核酸探针的制备和应用

根据GeneBank上发表的A型魏氏梭菌α毒素基因序列,设计合成了一对特异性引物,通过PCR的方法,扩增出了大小为470bp的α毒素基因的部分片段。应用地高辛标记法来标记该片段,制备了α毒素基因探针,该探针只与魏氏梭菌DNA发生阳性反应,与其它多种细菌DNA不发生反应;该探针在1：1000的工作浓度下,能检出1-5pg／uL的魏氏梭菌基因组DNA。应用该探针对33株魏氏梭菌进行核酸杂交（Dot-Blotting）检测,结果表明该探针具有良好的特异性和灵敏性,可用于对魏氏梭菌的诊断检测以及流行病学调查。     

魏氏梭菌α毒素分子生物学研究进展

魏氏梭菌是引起各种坏死性肠炎、肠毒血症,同时也是引起创伤性气性坏疽以及人类食物中毒的主要病原菌之一,其致病因子是该菌产生的外毒素。根据主要致病的毒素α、β、ε和ι,将该菌分为A、B、C、D、E 5个毒素型。各型魏氏梭菌均产生α毒素,它是魏氏梭菌最主要的毒力因子。α毒素是依赖锌离子的磷脂酶C,具有细胞毒性、溶血活性、致死性、皮肤坏死性、血小板聚集和增加血管渗透性等特性。     

应用反向间接血凝试验检测魏氏梭菌α-毒素

采用兔抗魏氏梭菌 α-毒素 Ig G致敏马红细胞建立了反向间接血凝试验 ,该诊断试剂与魏氏梭菌标准株的培养上清液发生特异的凝集反应 ;在 PB缓冲液中不自凝 ;与其他致病菌培养上清无交叉反应。对现场分离样品的检测结果表明 :该方法与其生化试验结果的符合率为 97.2 %,可用于兽医临床上魏氏梭菌病的快速诊断。     

产气荚膜梭菌贵州分离株α-毒素基因的克隆与鉴定

提取了A型产气荚膜梭菌贵州分离株的染色体DNA，经聚合酶链反应(PCR)扩增并回收获得了1条242bp的特异性片段，将该基因片段克隆到质粒载体pUC19中，并转化至大肠埃希氏菌JM109中；经氨苄青霉素(Amp)抗药性和显色反应筛选及重组质粒酶切分析、PCR鉴定和Southern-blotting检测，表明该重组质粒是产气荚膜梭菌α-毒素基因的克隆。     

魏氏梭菌α毒素基因的克隆表达及其间接ELISA方法的建立

对GenBank上发表的魏氏梭菌α毒素基因的氨基酸序列进行了二级结构、疏水性、抗原决定簇、跨膜区以及抗原性分析,在此基础上,对α毒素基因130～966nt位的837bp长的适合原核表达的区域进行PCR扩增、克隆、核酸序列测定和生物信息学分析。同时,建立了检测魏氏梭菌α毒素抗体的间接ELISA方法。     

羊魏氏梭菌PCR方法的建立及初步应用

根据羊魏氏梭菌A、B、C、D、E型共有的α毒素基因,设计了1对引物,通过对PCR反应条件进行优化,建立了羊魏氏梭菌PCR检测方法。该方法扩增条带大小为255 bp,最低核酸检测量A型为0.39 ng/L、B型为0.62 ng/L、C型为0.52 ng/L、D型为0.87 ng/L、E型为0.92 ng/L,而对羊大肠杆菌、羊链球菌、金黄色葡萄球菌、羊多杀性巴氏杆菌的扩增结果均为阴性。应用该PCR方法对54份临床样本进行检测,PCR检测结果高于细菌学和生化检测结果。结果表明,该PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于临床羊魏氏梭菌病的早期快速诊断。     

魏氏梭菌PCR检测方法的建立及应用研究

根据GenBank发表的序列设计了α毒素引物,建立了魏氏梭菌PCR检测方法。结果表明仅魏氏梭菌扩增出了特异性条带,而大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、葡萄球菌没出现,该方法最低检测灵敏度为1 CFU／ml。用该法对山东齐河、枣庄、泰安、蒙阴等地的猪、牛、羊、兔的样品检测,总检出率为20．6％,与细菌分离、鉴定结果一致。     

A型魏氏梭菌α毒素Asp-56基因定点突变与结构分析

为探索A型魏氏梭菌α毒素第56位天冬氨酸(Asp-56)对其生物学活性的影响,将α毒素Asp-56密码子(GAT)定点突变成甘氨酸(Gly-56)密码子(GGT),构建了含α毒素D56G突变基因表达质粒的重组菌株BL21(DE3)(pM-D56G),该突变体蛋白表达量约为22.48%。α毒素和α毒素D56G突变体蛋白的二级结构主要由α螺旋和无规则卷曲组成,两者的圆二色(CD)光谱检测有微小变化。生物学活性检测结果表明,α毒素D56G突变体蛋白失去了α毒素的磷脂酶C活性,且α毒素D56G突变体蛋白免疫的小鼠能够保护1MLD的A型魏氏梭菌标准株C57-1毒素攻击。此研究为进一步研究α毒素分子结构与生物学功能的关系奠定了基础。     

产气荚膜梭菌α—β融合基因的高效表达

用PCR从含产气荚膜俊菌α毒素基因的质粒pXETA1中扩增出α毒素基因，用NcoⅠ和BamHI双酶切该α毒素基因，回收0．95kb的α毒素基因片段，再用NcoⅠ和BamHI双酶切含产气荚膜梭菌β毒素基因质粒pXCPAB2，与 回收的α毒素基因片段连接，转化至受菌BL21（DE3）中。经NcoI,BamHI,NcoI酶反应鉴定和核苷酸序列分析证实，获得了理想重组质粒pXCPAB2，该重组质粒含有α-β融合基因。重组菌株BL21（DE）3（pXCPAB2)经IPTG诱导后，其表达产物经ELISA检测和SDSPAGE分析，结果表明重组菌株可以高效表达α-β融合基因，该融合蛋白占菌体总蛋白的22．14％。     

产气荚膜梭菌α—β融合基因的构建

用PCR从含产气荚膜松菌β毒素基因的质粒pXETB2中扩增出β毒素基因，NcoⅠ和BamHⅠ双酶切该β毒素基因，回收0.93kb的β毒素基因片段，再用NcoⅠ和BamHⅠ双酶切含产气荚膜梭菌α毒素基因质粒pXETA1,与上述回收的β毒素基因片段连接，转化至受体菌BL21（DE3）中，经NcoⅠ，NotⅠ酶切反应鉴定和苷酸序列分析证实，获得的重组质粒pXCPAB1含有α－β融合基因，重组菌株BL21（CD3）（pXCPAB1)表达产物经ELISA检测和SDS－PAGE分析，表明重组菌株可以表达α－β融合蛋白。     

艰难梭菌毒素及致病基因的研究进展

艰难梭菌是一种革兰阳性厌氧芽胞梭菌,是人类肠道感染的主要致病菌,以肠道病理损伤及菌群失调为主的感染性疾病.使用抗菌药物后可导致艰难梭菌过度生长,分泌大量毒素A(肠毒素)和毒素B(细胞毒素),通过毒素介导致病.毒素A启动细胞损伤后,毒素B即可侵入肠黏膜,引起细胞病变,导致一系列与感染相关的临床表现.少数强毒株艰难梭菌还可以产生二元毒素,该毒素可以导致细胞骨架破坏,增强毒素A和毒素B的作用导致严重病变.研究发现,人和动物艰难梭菌之间具有同源性,成为人类感染艰难梭菌的传染源.对艰难梭菌产生毒素的致病机理进行综述,为治疗艰难梭菌感染提供依据.     

兔肠致病性大肠杆菌和魏氏梭菌毒力基因的快速检测

以一中型肉兔场为研究对象,采集病、死兔肠内容物,粪便样品,饮水,污水,饲料和以兔舍为中心不同距离处的尘土样品,共得到样品135份,运用双重PCR法同时检测样品中的肠致病性大肠杆菌(eaeA基因 )和魏氏梭菌(α-毒素基因 ).结果表明在病、死兔肠内容物中、粪便、生活污水中这两种菌同时存在和仅一种菌单独存在的几率都较大;兔舍周围尘土由近到远肠致病性大肠杆菌(eaeA基因 )存在的几率呈递减趋势,魏氏梭菌(α-毒素基因 )在兔舍周围尘土中存在的几率较少,且变化不大.     

魏氏梭菌毒素中毒引起犬瘁死的诊断报告

20 0 1年冬至 2 0 0 2年春 ,在昆明某地相继发生了 10几头狼种犬不明原因的瘁死 ,经病例剖检、病原分析和动物试验等研究 ,结果证明 :此病为魏氏梭菌毒素中毒引起 ,这一发现 ,不仅解开了当地相继发生的犬瘁死之谜 ,而且也消除了人为投毒破坏之嫌疑 ,化解了复杂的社会矛盾。现报告如下。1　发病情况2 0 0 1年 11月底 ,昆明某养犬场在 1周内相继发生了 4头成年狼种犬 (公母各半 )瘁死 ,12月在上述犬场附近的另一犬场也发生相类似的病例 ,以后又波及到附近的养犬户 ,至 2 0 0 2年 2月底 ,共发生 10几头犬瘁死的病例。2　临床症状病犬生前未发现…