对虾白斑综合征病毒可视化环介导等温扩增(LAMP)检测技术的建立与应用

针对当前对虾(Penacus orientalis)养殖业亟需研究开发一种简便快速、敏感特异的检测技术来实现对对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)进行检测监控的现状,本研究根据WSSV基因组ORF120保守区序列,设计合成6条环介导等温扩增(loop mediated isothermal amplification,LAMP)特异性引物,分别为外引物F3/B3、内引物FIP/BIP和环引物LF/LB。利用钙黄绿素/氯化锰作为检测指示剂,通过对反应条件优化,建立了可视化WSSV-LAMP检测方法。在检测中未发生扩增反应时,钙黄绿素被氯化锰螯合,呈淬灭状态。当样品中有WSSV靶基因存在时,大量DNA被合成,并产生同样大量的焦磷酸根离子,此时焦磷酸根离子竞争性与Mn2+结合,形成稳定的不溶性焦磷酸盐沉淀,钙黄绿素被释放而发出肉眼可见的黄绿色荧光。该扩增一次性反应约60min即可完成对待检样品的检测。经测定,本方法能特异性地检测出阳性样品中的WSSV目的基因,并能通过扩增产物所产生的黄绿色变化与阴性样品区别;本技术对目的基因的最低检测量为1fg。在临床检测试验中,WSSV-LAMP与世界动物卫生组织(OIE)推荐的WSSV-PCR检测方法均能从250份对虾样品中,同时检测到15份编号相同的阳性样品,符合率达100%。除此之外,WSSV-LAMP还能从另外3份PCR检测为阴性的样品中检测到目的基因。比较这两种方法的阳性检出率,WSSV-LAMP为7.2%(18/250),WSSV-PCR为6.0%(15/250),WSSV-LAMP对自然感染的临床样品阳性检出率要比WSSV-PCR高。说明WSSV-LAMP在病毒含量较低的临床样品检测中比OIE推荐的PCR方法具有更高的技术优势,能在对虾养殖生产上的临床诊断、育种及口岸检疫,甚至海洋生态监测中对WSSV进行现场检疫。     

环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测转基因玉米LY038

为了施行对转基因作物的监管,许多国家和机构制定了转基因标识制度的相关条例,因此建立针对转基因产品的检测方法是十分必要的.本研究运用环介导等温扩增技术(LAMP)建立了对转基因玉米(Zea mays L.) LY038外源基因的快速检测技术,该方法依据cordapA基因的序列设计了4条特异性引物,结果表明,引物特异性良好,该检测体系在63℃恒定温度下,反应50 min,可检测到0.01％的样本,是常规PCR方法的5倍.该检测方法具有高度的特异性、灵敏性和稳定性,该方法不需要特殊仪器、快速简便,在基层和现场检测中有很好的应用前景.     

环介导恒温扩增技术快速检测对虾白斑综合征病毒方法的建立

DNA环介导恒温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是一种特异、灵敏、快速的新型基因检测技术,其检测结果可以通过琼脂糖凝胶电泳观察,也可以通过加入核酸染料SYBR GreenⅠ进行肉眼观察。本研究根据对虾白斑综合征病毒(White spot syndrome virus,WSSV)的结构蛋白VP26基因序列,设计一套引物,成功建立了针对WSSV的LAMP检测方法。应用该方法,在65℃温育1h的条件下快速扩增病毒基因组DNA,琼脂糖凝胶电泳得到特异性梯度条带;在反应体系中添加SYBR GreenⅠ染料后,可通过肉眼观察有无荧光直接判定结果。该研究建立的LAMP法能特异性检出WSSV,其检测下限比PCR法低一个数量级,相当于0.563pg/μL的质粒(pMD19-T-VP26)浓度。表明所建立的WSSV LAMP检测法特异性好、灵敏度高、操作简单方便,有望作为WSSV快速诊断的常规方法。     

常温核酸探针点杂交法检测对虾白斑综合征病毒的PCR扩增产物

聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术和核酸探针杂交技术已成为十分重要的病原检测手段,在对虾白斑综合征病毒(white spotsyndrome virus,WSSV)的检测中,已得到广泛的应用[1～3].     

~(125)I标记斜纹夜蛾(Spodoptera litura)病毒DNA探针的制备

用~(125)I碘化法标记斜纹夜蛾病毒DNA(SLNPV-DNA),所制备的~(125)I-DNA用于膜上DNA-DNA分子杂交实验。结果证明,~(125)I-SLNPV-DNA探针具有特异性,可供应用。     

羟基萘酚蓝在伪狂犬病病毒环介导等温扩增检测方法中的应用

伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)传统诊断方法具有程序繁琐、周期长、成本高、特异性差等缺点,本实验建立了敏感、特异的PRV的环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)检测方法,并在此基础上应用金属离子指示剂羟基萘酚蓝(hydroxy naphthol blue,HNB)进行反应结果判定.实验选取保守性较高的gB基因(glycoprotein B,糖蛋白gB)筛选引物,确定反应体系后,可在45 min内完成检测.LAMP方法特异性与PCR方法一致,敏感性是PCR方法的100倍,最低能够检测10个拷贝的目的基因.在HNB的应用试验中,发现LAMP反应体系中,HNB浓度为150 μmol/L时,阴阳性的颜色对比明显且反应的敏感性最高,可用于LAMP扩增产物的判断.临床样本的检测结果表明,PCR方法和LAMP方法的检出率一致.因此,本研究中所建立的LAMP方法是一种高度特异敏感的,可替代PCR方法的检测技术.     

不同外植体对草莓病毒脱除效果及病毒的多重RT-PCR检测

以草莓茎尖和花药为外植体,多重RT-PCR为检测方法研究了不同培养材料对3种草莓病毒,即斑驳病毒(strawberry mottle virus,SMoV)、轻型黄边病毒(strawberry mild-yellow edge virus,SMYEV)和镶脉病毒(strawberry vein-band virus,SVBV)的脱除情况。结果表明,花药愈伤组织再生苗途径对3种病毒的脱除率为100%。而不同大小茎尖脱除病毒效果不同:0.2mm茎尖可完全脱除3种病毒,但成苗率低;0.5mm茎尖可有效脱除SMoV和SVBV,但对SMYEV脱除不彻底;0.5mm茎尖成苗率明显高于0.2mm茎尖,但较难脱除SMYEV。综合病毒脱除率和成苗率,对花药再生频率较高的草莓基因型(如红颊)可以采用花药愈伤组织再生途径进行病毒脱除,而对于花药再生困难的基因型可以考虑选用茎尖分生组织途径获取脱毒苗。     

转基因玉米多重PCR-基因芯片联用检测方法的研究

根据七种转基因玉米的重组DNA结构分别对Bt11、Bt176 、Mon810 、Mon863 、TC1507、 GA21 和NK603设计转化体特异性引物,进行多重PCR检测。在此基础上分别设计和筛选了七种转基因玉米转化体特异性oligo探针,制备转基因玉米的寡核苷酸芯片。实验表明,该探针特异性好,同常用的凝胶电泳检测方法相比,芯片杂交的灵敏度（0.01%）,优于凝胶电泳检测（0.1%）,由于采用了多重PCR技术一次可同时检测多个基因,提高了检测的准确率和效率。     

地高辛(DIG)和碱性磷酸酶标记cDNA探针检测PRSV

根据GenBank发表的PRSV(番木瓜环斑病毒)中国Sm株系的外壳蛋白基因序列,设计特异引物,以美中红(Caricapapaya L.cv.Meizhonghong)带病样品的RNA为模板进行RT-PCR扩增,将其目的cDNA片段克隆到pGEM-Teasy质粒载体上。以重组质粒作模板,用PCR-DIG标记方法制备cDNA探针,另一种非放射性探针是经凝胶电泳分离、纯化cDNA片段,用碱性磷酸酶直接进行标记。利用地高辛(DIG)标记和碱性磷酸酶直接标记的cDNA探针核酸分子杂交及RT-PCR方法对PRSV进行了检测。结果表明,(1)测序结果表明美中红No.2序列与中国优势株系Sm的同源性为94.7%;(2)DIG标记的3种cDNA探针(861,455和215bp)对样品的总RNA检测结果一致,且861bp的探针杂交斑点最为清晰,上述核酸杂交结果与RT-PCR检测结果相符,核酸分子杂交检测的灵敏度和特异性能满足常规检测的需要;(3)碱性磷酸酶直接标记861bp的cDNA探针可进行PRSV的斑点杂交检测,可获得有效的杂交结果;(4)DIG标记探针对叶脉进行了印迹杂交检测,结果与RT-PCR检测结果相符。     

猪胸膜肺炎放线杆菌环介导等温扩增检测方法的建立与应用

本文建立了敏感、特异的胸膜肺炎放线杆菌环介导等温扩增检测方法。以1型胸膜肺炎放线杆菌ApxIV基因片段为靶序列设计了一组引物,并建立了LAMP反应体系,在63℃等温条件下反应45min,最低能检测到102个拷贝的目的基因,敏感性是PCR方法的10倍。通过对1～10型胸膜肺炎放线杆菌、多杀巴氏杆菌、链球菌、支原体等18种病原微生物的检测,证明该法具有很强的种特异性。另外,通过对8头实验感染猪和127份临床发病猪的鼻拭子的检测发现,该法对鼻拭子中胸膜肺炎放线杆菌的检出率为100%,优于PCR方法。     

环介导等温扩增技术及其在水生动物病毒检测中的应用

水产养殖已成为国民经济重要组成部分,但经常受到水生动物病毒的困扰。相关病毒病原的检测已成为水生动物病原研究的热点之一。环介导等温扩增技术具有高特异性和灵敏度,并且扩增时间短,对仪器的要求较低,已广泛应用于水生动物病毒的检测中。本文从环介导等温扩增技术中引物的设计,扩增反应过程及反应产物的检测三个方面来阐述其基本原理,并综述了其在水生动物虹彩病毒、弹状病毒、呼肠孤病毒、疱疹病毒及对虾病毒检测中的应用,最后对其技术和应用上的发展前景进行了展望,以期为水生动物病毒检测相关研究提供参考。     

牛支原体的环介导等温扩增快速检测技术研究

牛支原体(Mycoplasma bovis是感染牛的一种重要的致病性病原体.本研究利用环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术建立了牛支原体的快速检测方法.该方法以牛支原体保守性基因uvrC为靶序列设计了5条特异引物,在58℃等温条件下,60 min即可完成反应.LAMP方法能检测出20 pg牛支原体DNA,较PCR方法高100倍,用牛鼻支原体(M.bovirhinis)、无乳支原体(M.agalactiae)、精氨酸支原体(M.ariginini)、牛副流感病毒(BPIV)、牛腺病毒(BADV)、牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)作特异性检测,两种方法均有很高的特异性.本研究还将荧光显色剂钙黄绿素(calcein)和Mn2+用于LAMP反应结果的可视化检测.临床鼻拭子样品煮沸后,可直接进行等温扩增,省去了DNA提取步骤.在对167个临床鼻拭子样本的检测中,LAMP方法检测结果阳性率(26.95％)高于PCR方法检测出阳性率(19.16％),这证明本研究所建立的方法,与PCR法比较更适于临床样品的检测.研究结果表明,LAMP方法具有操作简便、快速、高效、敏感、特异、经济等特点,适于基层实验室监测的广泛使用.     

环介导等温扩增联合横向流动试纸条可视化检测海豚链球菌方法的建立

海豚链球菌(Streptococcus iniae)是一种革兰氏阳性球菌,呈β溶血,可感染多种淡水和海洋鱼类。本研究利用环介导等温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)进行核酸扩增,通过横向流动试纸条方法 (lateral flow dipstick,LFD)实现检测,建立了一种可应用于海豚链球菌快速检测的LAMP-LFD技术。该技术以海豚链球菌促旋酶B亚单位(gyrase subunit B,gyr B)基因为检测靶标,设计3对引物进行由生物素标记的LAMP扩增反应,产物经异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)标记的探针杂交后,在LFD上完成检测。经优化的核酸扩增最适条件为65℃反应30 min,在此条件下,阳性扩增起始时间与模板浓度之间呈典型的线性相关性。从核酸扩增反应开始到LFD显色,整个检测时程只需40 min左右,比常规PCR技术缩短约2 h。LAMP-LFD能特异性地检出海豚链球菌,针对病原纯培养物的检测灵敏度为8.70×101cfu/m L,是LAMP检测的10倍、常规PCR检测的100倍。以灵敏度浓度(8.70×101cfu/m L)的海豚链球菌基因组DNA为模板进行的LAMP-LFD结果显示该方法具有良好的重复性。针对人工污染花鲈(Lateolabrax japonicus)肝组织的检测灵敏度为4.35×103cfu/m L,同样为常规PCR检测方法的100倍。利用本方法可成功从患病花鲈的组织样品中检测出海豚链球菌,检测结果与常规的细菌分离鉴定方法结果一致。因此,利用LAMP-LFD能特异、准确、高效地检测出海豚链球菌,而且操作简单、费用低、耗时短,有望成为海豚链球菌的常规检测方法。     

环介导等温扩增技术快速检测大西洋鲑的研究

为探究环等温扩增技术(LAMP)在鲑科鱼类物种鉴定方面的应用,以大西洋鲑为研究对象,针对其线粒体CR区段设计特异性的LAMP引物,并通过单因素试验和正交试验研究反应体系中d NTP Mix、Mg~(2+)、甜菜碱终浓度对LAMP扩增结果的影响。结果表明,大西洋鲑LAMP扩增的最优条件为:引物SS-CR-F3/SS-CR-B3各0.2 m M,SS-CR-FIP/SS-CR-BIP各1.6 m M,dNTP Mix 1.4 m M,Mg~(2+)6 m M,甜菜碱0.8M,Bst DNA聚合酶8 U,扩增温度为65℃,反应时间60 min。在此条件下LAMP扩增产物电泳检测特异性强、稳定性好,对大西洋鲑DNA的检出限达0.01 ng·μL~(-1),并可对混合样本进行检测。本研究结果为大西洋鲑快速物种鉴定提供了一种重要技术手段,该技术可应用于鲑科鱼类物种鉴别的日常检验检疫和市场监管工作中。     

同步检测海水养殖动物5种病原菌的扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)方法的建立与应用

鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)、迟缓爱德华氏菌(Edwardsiella tarda)和副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)是我国海水养殖动物5种重要的病原菌.本研究在分析了其致病因子基因的基础上,依据扩增子拯救多重PCR(Arm-PCR)的原理,设计了5套特异性的套式PCR引物,并在各内引物的5'端分别加上能被一对通用引物识别的标签序列;通过对套式PCR中影响扩增结果的引物混合物浓度、退火温度、Mg2+浓度、dNTPs浓度以及Taq DNA聚合酶浓度等5个反应参数的调整和优化,最终建立了一种能同步检测海水养殖动物5种常见病原菌的Arm-PCR方法.优化后的Arm-PCR方法第一步PCR反应体系为:10×PCR Buffer 5 μL(含20 mmol/L的Mg2+),dNTP(各2.5mmol/L)5μL,T的酶(2.5 U/μL)0.6 μL,10×Primer Mix(2 μmol/L)5 μL,DNA模板各1μL,灭菌双蒸馏水补足至50 μL,反应的退火温度为55℃.实验结果表明:对鳗弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌和副溶血弧菌这5种病原菌,使用该方法可以在1支反应管内快速、同步进行检测,得到大小分别为144、190、266、315和371 bp的特异性产物,其检出灵敏度分别为1.745、1.847、16.000、28.126和369.900 pg细菌基因组DNA;该方法特异性强,与大肠杆菌(Escherichia coli)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、河豚毒素假交替单胞菌(Pseudoalteromonas tetraodonis、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等其他细菌以及半滑舌鳎基因组DNA不产生交叉反应.2012年,应用该Arm-PCR方法对分离自病鱼的24个优势菌株进行了检测,确定出5株迟缓爱德华氏菌、3株嗜水气单胞菌、2株哈维氏弧菌及2株副溶血弧菌,证实该方法具有良好的可靠性和实用性.该方法不仅适用于海水养殖动物中致病性鳗弧菌、哈维氏弧菌、嗜水气单胞菌、迟缓爱德华氏菌、副溶血弧菌的快速、同步检测和病原流行情况调查,也为进一步开发相应的基因芯片检测方法打下了基础.