DREB 2A基因的克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

研究提取盐处理的拟南芥植株叶片总RNA,用DREB2A基因特异引物通过RT-PCR扩增出1050bp的片段,并将该片段克隆至pUC18上。序列分析结果表明,该克隆序列与GenBank上的DREB2A基因序列同源性达100%。进一步将DREB2A基因分别克隆至植物表达载体卡盒pCCE12和pCC29A上,构建了分别由E12启动子、rd29A启动子调控的DREB2A基因植物表达载体pCDRE12和pCDR29A。通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为农杆菌介导的DREB2A基因对植物的遗传转化奠定基础。     

DREB1A基因植物表达载体的构建

以 p Bch质粒为基础 ,构建了分别由 35 s启动子、 rd2 9A启动子调控的 DREB1A基因双子叶植物表达载体p BD35 s、p BD2 9A,其植物选择标记为新霉素磷酸转移酶基因 (N PT ) ,适用于双子叶植物的遗传转化。以 p CU质粒为基础 ,构建了分别由 E12启动子、 rd2 9A启动子调控的 DREB1A基因单子叶植物表达载体 p CDE12、p CD2 9A,其植物选择标记为乙酰 Co A转移酶基因 (bar) ,适用于单子叶植物的遗传转化。并分别通过三亲本杂交法和冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌 L BA4 4 0 4中 ,为通过农杆菌介导法将 DREB1A基因导入植物奠定基础     

转录因子DREB1A基因的克隆及植物表达载体的构建

研究转录因子DREB1A在植物抗渗透胁迫反应中的作用。根据GenBank中登录的DREB1A基因的序列设计引物,用PCR方法从拟南芥中克隆DREB1A基因,利用基因重组技术成功构建了植物表达载体pCAMB1A1300-DREB1A。该结果为进一步利用DREB1A基因做遗传转化研究奠定了基础。     

茶陵野生稻DREB类转录因子的克隆及植物表达载体的构建

采用RT-PCR技术获得了茶陵野生稻DREB类转录因子的cDNA全长.序列分析表明,此基因核苷酸序列全长为958bp,编码314个氨基酸,该序列与水稻DREB基因的同源性为98%.其编码的蛋白与小麦CRT/DREB4蛋白的同源性为93%,与大麦CBF2A蛋白和CBFIVc-14.1蛋白的同源性分别为93%和92%.推导蛋白第43～112位氨基酸为典型AP2结构,具有AP2/DREB类转录因子的基本结构特征,并构建了茶陵野生稻DREB基因的植物表达载体pWM101DREB.     

逆境相关转录因子DREB2A转化紫花苜蓿的研究

以逆境性相关转录因子DREB2A为目的基因、除草剂抗性的bar基因为标记,构建了植物表达载体pCD2A,并通过农杆菌介导法以无菌苗子叶为外植体转化公农1号苜蓿。经过共培养、抑菌和筛选培养,在含有2 mg/L Basta的培养基获得71株抗性再生植株。用1 mg/L的Basta对抗性植株叶片进行进一步筛选,并经PCR检测,获得11株阳性植株,表明DREB2A已整合到植株的基因组中。     

拟南芥DREB1A基因的克隆与植物表达载体构建

用PCR方法从拟南芥中克隆DREB1A基因,序列分析发现,所克隆的DREB1A基因与已发表的DREB1A基因序列(AB007787)的同源性为99.69%.利用基因重组技术成功构建了植物表达栽体pBI121-DREB1A,为进一步利用DREB1A基因综合改良植物抗旱性奠定了基础.     

纤维素酶基因(BGLⅠ、CBHⅡ)与DREB1A基因双价植物表达载体的构建

本研究以pAHC17、pCD29A质粒为基础,分别构建了玉米泛蛋白(Ubi)启动子调控的纤维素酶基因(BGLⅠ、CBHⅡ)与rd29A启动子调控的DREB1A基因的双价植物表达载体pBDB,pBDC。其植物选择标记基因为乙酰CoA转移酶基因(BAR),该载体适用于单子叶植物的遗传转化。并通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为利用农杆菌介导法进行BGLⅠ,CBHⅡ和DREB1A基因对单子叶植物的基因工程研究奠定了基础。     

抗真菌、抗渗透胁迫基因多价植物表达载体构建及对黄瓜遗传转化的研究

本研究以黄瓜为试材,建立黄瓜植株再生体系和遗传转化体系;构建了分别由双35S组成型启动子、E12强组成型启动子和rd29A诱导型启动子调控的核糖体失活蛋白基因、几丁质酶基因和DREB1A基因的多价基因植物表达载体;利用农杆菌介导入法将其导入黄瓜优良品种,获得了转pBDCR T0及T1代PCR阳性植株。T1代转基因植株的抗逆性实验表明,DREB1A基因的表达可以提高黄瓜的抗旱性。本研究为培育抗逆境及抗真菌病转基因植株探索途径,并为进一步揭示核糖体失活蛋白基因、几丁质酶基因和DREB1A基因的分子机理提供了理论依据。     

水稻DREB1基因过表达载体的构建与转化

为了研究DREB1的功能,从水稻cDNA中克隆了DREB1基因,成功构建了该基因的高效植物表达载体pCAMBIA-DREB1。采用农杆菌介导法转化水稻,经PCR、Southern blot分析表明,DREB1基因已经成功地整合到水稻基因组中,获得水稻DREB1基因过表达转基因植株。     

rip、chi及DREB1A多价基因植物表达载体的构建

实验构建了分别由rd29A、2×35S以及E12启动子调控的DREB1A、rip、chi三价基因植物表达载体pBDCR,通过冻融法将重组质粒导入根癌农杆菌LBA4404中,为将上述基因联合导入植物从而培育具有广谱抗菌性和抗渗透胁迫的转基因植物新品种奠定基础。     

血管内皮生长因子（VEGF）实时荧光定量PCR质粒标准品的构建

 应用SYBR Green荧光染料检测方法构建VEGF基因质粒标准品,能快速、灵敏、可靠的检测与临床多种疾病密切相关的重要候选基因血管内皮生长因子（VEGF）的表达情况。本研究利用版纳微型猪近交系4~6月龄猪,提取皮肤创面总RNA,设计特异引物,进行RT PCR扩增。纯化目的片段并与pMD18 T载体连接,转化宿主菌DH5α,提取重组质粒DNA,并经酶切、PCR和测序鉴定,计算重组质粒原液拷贝数浓度并制备梯度浓度标准品,进行实时荧光定量PCR。建立的VEGF基因mRNA表达实时荧光定量PCR检测方法特异性较好,检测灵敏度可达1.0×103拷贝,线性范围达1.0×103~1.0×108拷贝,阈值循环数(Ct)与PCR体系中起始模板量的对数值之间存在良好的线性关系(r2=0.982),扩增效率高(E=96.92％)。通过构建版纳微型猪近交系VEGF基因质粒标准品,为探讨VEGF基因在临床多种疾病中所发挥的分子机理奠定基础。     

甘蓝型油菜与萝卜属间杂种的获得及其酶学分析

甘蓝型油菜（ＡＡＣＣ）与萝卜（ＲＲ）杂交以导入抗性基因，应用“胚胎挽救”技术在本研究中产生了１３３株Ｆ１代杂种株与油菜栽培品种回交的第１代杂种株，１４５株回交第２代杂种株．细胞学和同工酶（ＧＰＩ，ＰＯＸ）酶谱分析表明，回交后代中萝卜的抗性Ｒ基因通过染色体工程可望导入到甘蓝型油菜栽培品种中．     

玉米小斑病菌诱导大豆叶片胼胝质沉积的初步研究

 利用菌丝染色和胼胝质特异性染色技术,研究玉米小斑病菌(Bipolaris maydis)与非寄主植物大豆互作时,能否诱导大豆产生胼胝质沉积相关的防御反应。将玉米小斑病菌接种到大豆叶片3h后即可观察到孢子能在大豆叶片上萌发,12h后能诱导大豆叶片细胞中胼胝质沉积。利用实时荧光定量PCR技术,在转录水平检测到β-1,3-葡聚糖酶基因（GLU）表达有变化。本试验研究结果表明大豆作为玉米小斑病菌的非寄主植物,可受玉米小斑病菌诱导而产生胼胝质沉积的防御反应,为进一步探明作物多样性种植降低病害发生的非寄主抗性机理奠定基础。     

黑麦草和紫花苜蓿对紫茎泽兰的竞争作用研究

 紫茎泽兰是我国首批公布的危害最严重的入侵种之一,替代控制是控制其蔓延和危害的主要途径之一。为评价多种牧草混种对紫茎泽兰的替代控制效果,采用多因素随机区组实验,在不同密度梯度和组合条件下研究了黑麦草和紫花苜蓿对紫茎泽兰的竞争作用。结果表明：在芽期,高密度（50粒种子/盆,盆直径=24cm）时,紫茎泽兰与2牧草混合种植可明显抑制紫茎泽兰的发芽;在苗期,2种牧草与紫茎泽兰以高密度（18株幼苗/盆,盆直径=24cm ）和小比例（紫茎泽兰占种植株总数的1/2以下）方式种植时,能够使紫茎泽兰株高和干重受到明显抑制,紫茎泽兰表现出较弱的竞争性,充分体现出牧草混合种植的替代竞争优势作用,讨论了牧草混合种植替代控制紫茎泽兰的可行性。     

甘蓝短散布元件对转基因表达效果的研究*

 为检验甘蓝短散布元件（SINE）对植物转基因表达的影响,采用PCR方法,从甘蓝基因组中克隆了一段短散布元件序列（Short Interspersed Nuclear Element,SINE）,该SINE具有核基质结合区（matrix attachment region,MAR）的结构特征,将其构建到β-葡糖醛酸酶（β-glucuronidase,GUS）基因（uidA）的两侧翼,形成SINE调控的植物表达载体,采用农杆菌介导法,将含SINE序列和不含SINE序列的植物表达载体导入烟草中。对转基因植株进行GUS活性定量测定,结果表明,SINE表现出类似MAR的功能,可以提高外源uidA基因的表达水平,与不含SINE的转化植株相比,外源基因的平均表达水平提高了2倍,但转基因植株个体间表达水平存在较大的差异。     

应用蚕豆微核技术监测金沙江攀枝花市东区段水质

 利用蚕豆微核技术对金沙江攀枝花市东区段水质进行监测,测定了4个断面水样的微核千分率（MCN‰）,据此以蒸馏水为阴性对照推算了各断面污染指数（PI）。结果表明,各断面水样均能使蚕豆出现微核和染色体畸变现象;丰水期,炳草岗大桥、密地桥、倮果桥、雅江桥断面的PI分别为2.944,3.646,2.944,1.708;枯水期则分别为2.851,2.849,3.400,1.615。按照PI值划分标准,炳草岗大桥（PI2.898）、密地桥（PI3.248）、倮果桥河段（PI 3.172）中度污染,雅江桥河段（PI 1.662）轻度污染。     

美洲黑杨遗传转化系统优化的研究

 研究了影响根癌农杆菌（Agrobaterium tumefaciens Conn）介导的美洲黑杨遗传转化的若干因素,建立了美洲黑杨简单、高效的遗传转化系统,获得了大量转基因植株。结果表明：外植体预培养3d,菌液浓度OD600值为0.4~0.6的农杆菌中侵染20min,共培养3d为最佳遗传转化系统,转化率最高时可达10.0%。同时发现选择带叶柄的叶片作为转化受体,转化频率也有明显提高且不同分化培养基的配方对美洲黑杨的转化效果也有一定影响。     

利用平腹小蜂防治荔枝蝽若干技术问题探讨

利用平腹小蜂Ａｎａｓｔａｔｕｓｓｐ．防治荔枝蝽的若干技术问题进行研究与探讨．结果表明，平腹小蜂在田间以成虫和老熟幼虫越冬．平腹小蜂成虫的抗寒性比较差，如３℃条件下待续２～４ｄ就出现部分虫体被冻死，但仍有一定的抗寒能力，在３℃条件下持续１０ｄ以后，还有１／５的被测试虫体未被冻死．成虫羽化的最适温度为３０～３２℃．荔枝蝽产卵始盛期为当年第１次散放平腹小蜂的最适时期，于散放平腹小蜂前１０ｄ喷第１次农药，再行放蜂，又于放蜂后５０ｄ喷第２次农药，还可防治其它病虫害，是最佳的综合防治方案．     

混种非洲狗尾草对紫茎泽兰表型特征的影响

紫茎泽兰是我国最具入侵性的外来杂草之一,现已在西南大部分地区造成危害。研究了紫茎泽兰和非洲狗尾草在重度、中度和轻度3个不同入侵程度的土壤和未入侵土壤中单种和混合种植时的表型特征差异。结果表明,混合种植时非洲狗尾草的长势明显强于紫茎泽兰,混种非洲狗尾草可明显降低紫茎泽兰的生长势。混种区的紫茎泽兰株高、节间距、节数、单株叶片数、绿叶率、叶绿素含量和根长均小于单种区,其中株高、节间距和叶绿素含量差异达到显著水平(P0.05);非洲狗尾草对紫茎泽兰生长的抑制作用随其密度的增加而增强,在非洲狗尾草植株数量3倍于紫茎泽兰时抑制效果最大,紫茎泽兰株高只有其单种的1/3,节间距只有单种的1/2,叶绿素含量不足单种的1/2。对不同入侵类型土壤中的替代效果进行比较研究表明,在相同种植比例下,随着入侵程度的增加,非洲狗尾草对紫茎泽兰的抑制作用呈现逐渐减弱的趋势。在紫茎泽兰与非洲狗尾草等比种植时,重度入侵土壤中的紫茎泽兰节间距和单株叶片数与轻度和中度入侵土壤中的紫茎泽兰节间距和单株叶片数差异达显著水平(P0.05),在轻度入侵土壤中开展紫茎泽兰的牧草替代控制效果最为显著。     

非洲菊灰霉病抗性鉴定技术的研究

 灰霉病是非洲菊切花破坏性的病害,在采后阶段的发生和危害尤其严重,培育抗性品种具有重要意义,抗性非洲菊材料的筛选鉴定是抗性品种培育的必要技术。以生产中显著抗病和感病品种为试材,研究非洲菊灰霉病抗性鉴定技术中适宜的试验材料、灰霉菌孢子浓度、孢子侵染条件和病害评估方法。结果表明, 非洲菊花瓣正面接种病害发展快、不同抗性品种间差异明显;分生孢子的侵染萌发需要充足的氧气和营养,2μL液滴、马铃薯葡萄糖的添加使花瓣发病整齐均匀;病菌的增殖危害与接种时分生孢子和马铃薯葡萄糖的初始浓度相关,在一定浓度范围内,二者呈反比关系,其中分生孢子适宜浓度为3.0×105~1.0×106个孢子/mL,马铃薯葡萄糖的适宜浓度为3%~6%;接种花瓣放置于室温、自然光、近100%湿度条件下,接种48h是最佳的评估时间。