甘蔗黑穗病菌DNA提取及PCR检测

本研究利用尿素混合液直接从甘蔗黑穗病菌孢子提取基因组DNA进行PCR检测鉴定,经过反复试验,建立了一种简便、快速的检测鉴定方法。利用建立的方法对12个甘蔗黑穗病样品进行病菌基因组DNA提取,将甘蔗黑穗病菌特异性引物进行PCR检测,均扩增出大小为420 bp的预期DNA片段条带。PCR扩增产物经克隆测序,与GenBank数据库中的甘蔗黑穗病病原菌序列比对,同源性达99%。     

甘蔗黑穗病菌的快速检测

利用分子生物学方法对甘蔗黑穗病菌进行了检测,建立了该病原菌的快速检测方法.从田间采集样本,在马丁氏培养基上分离获得甘蔗黑穗病菌的单菌落,经培养获得大量菌体,提取菌体基因组DNA并进行PCR检测,证明获得了甘蔗黑穗病的病原菌.该方法能简便、快速、准确、有效的检测甘蔗黑穗病菌,结果稳定、可靠.建立快速有效的检测甘蔗黑穗病的方法,将为甘蔗抗黑穗病育种工作提供方便.     

甘蔗黑穗病菌SCoT-PCR反应体系优化与引物筛选

以甘蔗黑穗病菌(Sporisorium scitamineum)交配型菌株基因组DNA为模板,在单因素优化试验的基础上,采用L16(45)正交试验设计,对影响甘蔗黑穗病菌SCoT-PCR反应体系的Mg2+、dNTPs、引物、r Taq DNA聚合酶和模板用量5个因素进行优化,建立优化的甘蔗黑穗病菌SCoT-PCR反应体系:DNA模板12.50ng、dNTPs 0.17mmol/L、引物0.46μmol/L、Mg2+1.7 mmol/L、r Taq DNA聚合酶0.85U、1×Buffer(Mg2+free),总体积25μL。应用优化体系从30条SCoT引物中筛选扩增条带清晰且多态性丰富的10条引物,并利用这10条引物对10份地理来源和寄主来源不同的甘蔗黑穗病菌交配型菌株基因组DNA进行SCoT标记,结果共扩增出86条带,多态性比率为58.67%,平均每条引物扩增8.60条。UPGMA聚类分析结果表明:在遗传相似系数为0.75的水平上,可将10个菌株分为3类,聚类结果与菌株的地理来源有一定的相关性。     

甘蔗应答黑穗病菌侵染相关酶活性和内源激素含量的变化

[目的]研究不同甘蔗品种与黑穗病菌长期互作过程中相关酶活性及内源激素含量的变化,为甘蔗应答黑穗病菌侵染的抗性机制提供理论依据.[方法]选用抗黑穗病品种桂糖29号和感黑穗病品种崖城71-374,用浸渍法接种黑穗病菌,对照组用无菌水模拟接菌.在接菌后30、60、90和180 d取甘蔗+1位叶为样品,分析几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶和过氧化氢酶(CAT)活性及生长素(IAA)、细胞分裂素(CTK)和乙烯(ETH)含量的变化.[结果]在整个侵染期间,两个甘蔗品种叶片的几丁质酶活性、β-1,3-葡聚糖酶活性及IAA、CTK含量呈逐步降低或波动下降趋势,均在接种后180 d达最低值,而CAT活性整体上呈上升趋势,在接种后180 d达最高值;其中抗性品种桂糖29号的β-1,3-葡聚糖酶活性和ETH含量在整个浸染过程均高于感病品种崖城71-374.[结论]甘蔗在不同时期应答黑穗病菌胁迫的生理生化反应不同,感病品种与抗病品种的防御机制可能存在差异.     

甘蔗黑穗病及其抗病育种的现状与展望

就甘蔗黑穗病及其生理小种,甘蔗对黑穗病菌的抗性机制及其遗传,甘蔗抗黑病性鉴定技术,以及我国甘蔗抗黑病育种的现状进行评述,并对今后的研究方向进行了探讨。     

甘蔗黑穗病菌胁迫对甘蔗内源激素含量的影响

[目的]研究接种黑穗病菌后甘蔗内源激素含量的变化,为揭示甘蔗对黑穗病的抗性机制及抗性育种提供理论依据.[方法]以甘蔗品种GT28和ROC22为材料,设接种黑穗病菌处理,以接种无菌水为对照,研究不同抗性甘蔗品种幼苗叶片内源激素含量的变化.[结果]受黑穗病菌侵染后,甘蔗幼苗叶片内源激素IAA和GA含量降低,ABA、SA和JA含量提高,IAA/ABA值下降且低于对照.与感病品种ROC22相比,抗病品种GT28有较低的IAA、ABA含量和较高的GA、SA含量,IAA/ABA值变化幅度较小,而抗感品种间内源JA含量无明显差异.[结论]受黑穗病菌侵染后,甘蔗幼苗叶片IAA、GA、ABA、SA含量及IAA/ABA值变化与不同甘蔗品种的抗性密切相关,可作为甘蔗对黑穗病抗性的生理指标.     

玉米丝黑穗病菌RAPD分析的引物筛选

采用CTAB法提取了玉米丝黑穗病菌DNA,研究了RAPD最佳优化条件,确定为20μL体系中10×buffer 2μL,25 mmol/L MgCl22μL,dNTP 0.5μL,DNA模板2μL,引物2μL,Taq 0.4μL(5 U/μL),ddH2O 11.8μL,并为玉米丝黑穗病菌RAPD分析筛选出了9个单引物和3个双引物。     

8种杀菌剂对甘蔗黑穗病菌的室内毒力测定

[目的]研究8种杀菌剂对甘蔗黑穗病菌的室内毒力,为甘蔗黑穗病药剂防治提供科学依据.[方法]采用冬孢子萌发抑制法、担孢子增殖抑制法及菌落生长速率法测定8种杀菌剂对甘蔗黑穗病菌的生物活性.[结果]嘧菌酯、苯醚甲环唑·嘧菌酯、噻呋酰胺、吡唑醚菌酯、吡唑醚菌酯·啶酰菌胺、啶酰菌胺、苯醚甲环唑对甘蔗黑穗病菌冬孢子萌发具有很好的生物活性,EC50分别为0.0117、0.0234、0.0636、0.1238、0.1441、13.7620和25.9300 μg/mL,而丙环唑的活性较低,EC50为155.5000 μg/mL.啶酰菌胺对甘蔗黑穗病菌担孢子增殖没有抑制作用,除嘧菌酯对“+”、“-”两种担孢子增殖的EC50分别为4.3250和5.3040 μg/mL外,其余药剂的EC50均小于1.0000μg/mL.对甘蔗黑穗病菌菌丝生长抑制作用较好的药剂依次为丙环唑、苯醚甲环唑、噻呋酰胺、苯醚甲环唑·嘧菌酯、吡唑醚菌酯、吡唑醚菌酯·啶酰菌胺、啶酰菌胺,EC50分别为0.0145、0.0643、0.1291、0.1689、0.2535、0.6767和4.8610 μg/mL,嘧菌酯对菌丝生长的抑制作用稍差,EC50为94.5000 μg/mL.[结论]供试8种杀菌剂对甘蔗黑穗病菌不同生长时期均具有不同的生物活性,可进一步开展这些杀菌剂的田间药效防治试验.     

枯草芽孢杆菌HAS中几丁质酶基因的克隆分析

为揭示枯草芽孢杆菌菌株HAS对甘蔗黑穗病菌抑制作用的机理,选取对多种病原真菌有抑制作用的几丁质酶进行克隆与分析。结果表明:菌株HAS基因组中含有1个ORF全长834bp的几丁质酶编码序列,其具有编码278个氨基酸的几丁质酶蛋白,该序列同GenBank上登录的几丁质酶蛋白(Bacillus subtilis subsp.subtilis str.168)(ref|NP_390566.1)的同源性最高,达98%。推测该几丁质酶在菌株HAS抑制甘蔗黑穗病菌过程中可能起关键作用。     

甘蔗品种与黑穗病菌的互作分析

本文从小种鉴定与品种抗病性测定、小种的区域性变动、互作群体的选择作用等方面对甘蔗品种与黑穗病菌的相互作用作了辨证分析，强调指出今后甘蔗抗黑穗病遗传育种研究应有群体观点、生态观点和进化观点，这对于制定甘蔗抗黑穗病育种策略具有重要指导意义。     

甘蔗鞭黑粉菌ISSR-PCR反应体系的优化

以甘蔗鞭黑粉菌交配型分离物为试验材料,采用CTAB法提取基因组DNA,并对影响甘蔗鞭黑粉菌ISSR-PCR反应体系中的一些重要参数进行摸索和优化试验,建立起适合甘蔗鞭黑粉菌基因组DNA的ISSR-PCR反应体系。优化的反应体系为:在25μL体系中,rTaq DNA聚合酶1.5 U、Mg2+浓度为2.0 mmol/L、dNTP浓度为0.2 mmol/L、引物浓度为0.2μmol/L、DNA模板10～20 ng、10×PCR buffer 1μL、用重蒸水补足25μL。     

一株甘蔗黑穗病菌的分离与系统发育分析

甘蔗黑穗病是由黑粉菌(Ustilago scitaminea Syd.)引起的一种世界性病害,严重危害甘蔗的生产,对该病病原菌的研究有助于甘蔗抗黑穗病育种。由于rDNA序列兼具保守区域和进化水平不同所致可变区,因此,rDNA序列分析是研究真菌系统发育、分类鉴定和分子检测非常有效的手段。笔者采用单孢分离方法,从高抗品种NCo376的病株上分离单孢,培养菌丝体,提取基因组DNA,分析其rD-NA序列,以期丰富该真菌的遗传多样性研究。用真菌rDNA序列分析的通用引物ITS1和ITS4,通过ITS-PCR得到目的片段,克隆在pMD18-T载体上后进行测序,结果显示该片段的长度为692bp,与Genebank中已报道的真菌序列进行Blast和系统发育树分析,表明所获得的序列与Sporisorium属真菌具有更高的亲缘关系,而与Ustilago属真菌的亲缘关系较远,这与一直沿用的甘蔗黑穗病菌的命名似乎并不吻合,有待进行更多的研究以证实。     

中国李基因组DNA提取方法的优化

3种常用的植物基因组DNA提取方法在中国李上的实验，结果表明：改良陈大明法提取的DNA纯度高，产率高。为满足植物样品较少时提取DNA的需要，将该法进一步优化的结果表明，不使用液氮研磨而是在低温条件下将组织捣碎的微量法同样提取出了产率高、纯度高的DNA，完全满足RAPD扩增的需要。裂解缓冲液中NaCl的浓度以1．1mol／L提取DNA的产率最高，且DNA的质量与其他浓度之间没有明显差异。     

羌活基因组DNA提取方法

[目的]探索一种用于RAPD分析的羌活基因组DNA提取方法。[方法]分别采取CTAB法S、DS法和改良的CTAB法提取羌活基因组DNA,通过紫外分光光度法、琼脂糖凝胶电泳和RAPD分析对提取的DNA进行检测。[结果]3种方法均能有效地从羌活中获得较高产量的DNA,以改良的CTAB法所得的DNA纯度最高,此法提取的羌活基因组DNAOD260/OD280为1.8~2.0,DNA干重得率约为0.235μg/mg。[结论]改良的CTAB法更适于羌活基因组DNA的提取,可以完全满足RAPD扩增的需要。     

一种快速提取甘薯基因组DNA方案的建立

建立了一种小量快速提取甘薯基因组DNA的方法。用该法以甘薯幼叶为实验材料,用小量快速法提取甘薯基因组DNA。提取的DNA经酶切、琼脂糖凝胶电泳检测,结果表明DNA质量较好,所提取的DNA可用于RAPD、AFLP等技术。此方法具有提取速度快、利于规模化提取、DNA质量好和经济实用等优点,为甘薯及其它相关植物基因组DNA的提取提供了一种快速、简便的途径。     

两种方法提取柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊基因组DNA的对比试验

为寻找一种合适的提取球虫基因组DNA的方法,试验采用氯化苄法(BC)和常规提取DNA的方法提取了鸡柔嫩艾美耳球虫孢子化卵囊基因组DNA。氯化苄的化学性质类似于苯酚,在65℃条件下与蛋白质和几丁质等发生反应,能够有效地破坏球虫卵囊壁,可用于大规模提取基因组DNA;常规方法提取DNA的程序是用蛋白酶K消化处理,用酚/氯仿抽提,再用氯仿抽提,部分步骤需要重复。2种方法对比试验结果表明,二者均可用于鸡球虫基因组DNA的提取,所获得的DNA数量和质量都很高,可用于各种分子生物学实验。但BC法具有简便、快速、经济实用的特点,更适用于球虫卵囊大量样品的DNA快速提取。     

杨树基因组DNA提纯方法的优化及其RAPD鉴定

为获得一种较为理想的杨树基因组DNA的提纯方法,根据提取植物基因组DNA的经验,优化了Clark利用CTAB提取植物基因组DNA的方法。加入了一系列的去除蛋白、酚类物质,利用MgCl2沉淀DNA,通过与三种常规的提纯方法进行比较,经紫外检测和电泳检测,结果表明优化的方法获得了高质量的DNA,是较为理想的杨树基因组DNA的提纯方法。能满足RAPD及其他分子生特学研究的需要。在试验中还利用该方法提纯了五个品种的杨树基因组DNA,采用RAPD分子标记技术,在引物S174作用下成功地进行了PCR扩增及品种鉴定。     

一种简易有效的提取真菌DNA化学改良方法

[目的]探索适合真菌基因组DNA提取的有效方法。[方法]以酵母茵（Hansenula sp.HS07A）和青霉菌（Penicillium sp.HS07）为供试菌株,分别采用煮沸裂解法、石英砂研磨法、研磨和反复研磨冻融法和化学改良法提取其基因组DNA,比较这4种方法的提取效果。[结果]化学改良法提取基因组DNA,除去了机械破壁过程,减少了机械力对DNA造成的破坏,运用阴离子去污剂SIB提取DNA安全、价廉,能有效、完整地提取高质量的基因组DNA,凝胶电泳条带清晰、无弥散,以此基因组DNA作为目的片段的PCR扩增模板,扩增效果优于改良前的方法,并且这种方法也适合多种真菌和细菌基因组DNA的提取。[结论]化学改良法是提取真菌基因组DNA的有效方法。     

一种快速微量提取柑橘早期胚基因组DNA的方法（英文）

[目的]建立一种快速微量提取柑橘基因组DNA的方法。[方法]采用优化的CTAB微量提取法,以20.0,10.0,5.0,2.5mg的早期杂种胚为材料进行基因组DNA的提取,并对其DNA进行质量检测和SSR验证。[结果]该方法简单易行,所需材料少,提取的DNA纯度较高,OD260nm/OD280nm在1.800～2.000,可满足SSR等以PCR扩增为基础的试验需要。[结论]建立的方法可以用于快速微量提取柑橘基因组DNA。     

枸杞干果DNA不同提取方法的比较

[目的]为枸杞DNA分子标记、种质资源研究及地道药材鉴别等提供技术支持。[方法]以枸杞干果为试材,分别采用常规CTAB法、高盐CTAB法、改进CTAB法、5×CTAB法、常规SDS法、改进SDS法等12种方法提取其基因纽DNA,比较不同方法的提取效果。[结果]12种方法中,5×CTAB法、改进SDS法等4种方法的提取效果不理想,其余8种方法均能有效提取枸杞干果的基因组DNA,且8种方法所提DNA的质量和产量均无明显差异。[结论]所用12种DNA提取方法中,8种方法提取的枸杞干果基因组DNA能够满足RAPD试验分析的需要。