PRV、PCV-2、PPV多重PCR检测方法的建立及其应用

根据GenBank上已发表的猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪Ⅱ型圆环病毒(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)核苷酸序列,设计并合成能分别特异性扩增PRV、PCV-2、PPV的引物。经条件优化,建立了同时检测PRV、PCV-2、PPV的多重PCR方法,所扩增特异性产物片段大小分别为217bp、394bp、748bp。该方法不仅特异性强、敏感性高,还克服了对上述病原分别进行检测所带来的诸多弊端,为猪伪狂犬病、猪Ⅱ型圆环病、猪细小病的临床诊断和流行病学调查等研究提供了新手段。     

猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒多重PCR检测方法的建立

摘要:本研究根据GenBank上已发表的猪圆环病毒2型（PCV2）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪细小病毒（PPV）的基因序列,设计了3对特异性引物,扩增PCV2、PRV、PPV,建立了同时检测PCV2、PRV、PPV的多重PCR方法。所扩增特异性产物片段大小分别为350、191、270 bp。该方法特异性强、敏感性高,可以用于猪圆环病、猪伪狂犬病、猪细小病的实验室诊断和流行病学调查。     

猪圆环病毒2型、猪伪狂犬病病毒、猪细小病毒多重PCR检测方法的建立

本研究根据GenBank上已发表的猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)的基因序列,设计了3对特异性引物,扩增PCV2、PRV、PPV,建立了同时检测PCV2、PRV、PPV的多重PCR方法。所扩增特异性产物片段大小分别为350、191、270 bp。该方法特异性强、敏感性高,可以用于猪圆环病、猪伪狂犬病、猪细小病的实验室诊断和流行病学调查。     

检测PRV野毒株、PCV-2及PPV多重PCR方法的建立及初步应用

根据GenBank中的猪伪狂犬病病毒(PRV)gE、猪圆环病毒2型(PCV-2)ORF2、猪细小病毒(PPV)VP2基因序列,设计了3对引物,成功建立了检测PRV野毒株、PCV-2和PPV的多重PCR诊断方法,扩增产物分别为288 bp、419 bp、681 bp。敏感性、特异性试验结果显示,该PCR对3种病毒的最低核酸检测量分别为PRV 48.2 pg/L、PCV-2 36.7 pg/L、PPV 0.25 ng/L,而PRV(gE基因缺失株)、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、大肠杆菌的扩增结果均为阴性。对87份自然感染病猪样品的检测结果表明,该多重PCR检测结果与单一PCR检测结果完全符合。结果表明,该多重PCR方法具有很好的特异性和敏感性,可用于临床PRV野毒株和gE基因缺失疫苗株、PCV-2和PPV的检测。     

猪细小病毒、伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立及应用

根据猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的基因序列,分别选取各自的保守区段设计引物,通过反应条件的优化,建立了检测PPV、PRV和PCV-2的多重PCR方法.用建立的方法对采自陕西省部分猪场的286份病料及血样进行检测,从对临床健康猪全血样品中PPV、PRV和PCV-2的检测结果看...     

PCV2、PPV、PRV、PRRSV和CSFV复合PCR检测方法的建立

根据GenBank上猪圆环病毒2型（PCV2）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征（PRRSV）和猪瘟病毒（CSFV）的已发表序列,分别设计并合成了5对特异性扩增引物,建立PCV2、PPV、PRV、PRRSV和CSFV单项PCR检测方法,分别扩增出预期的466bp、759bp、349bp、202bp和706bp片段。在优化单项PCR反应条件基础上,建立了PCV2．PPV-PRV-PRRSV-CSFV复合PCR检测方法,为预防和控制上述几种病毒性传染病提供了一种快速、敏感、特异的检测方法。     

多重PCR快速检测猪伪狂犬病病毒、猪圆环病毒2型方法的建立

根据GenBank上猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪圆环病毒2型（PCV2）的已知序列,利用Primer Premier 5.0及DNAstar软件对上述病毒基因保守区进行引物设计,选出扩增序列为PRV gB基因373 bp、PCV2 ORF2基因430 bp两对引物。在优化单项PCR反应条件基础上,建立了PRV-PCV2两重PCR检测方法。敏感性及特异性试验结果显示,该mPCR对2种病毒的核酸检测可至1.47×10-6~1.62×10-6 ng,而对灭菌双蒸水、猪细小病毒（PPV）猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）多重PCR的扩增结果均为阴性,作为临床上猪伪狂犬病和猪圆环病毒2型感染的病原学快速诊断方法具有可行性。     

多重PCR方法用于检测猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病病毒、猪繁殖与呼吸综合征病毒诊断方法的建立

本文建立了一种能够同时检测猪圆环病毒2型（PCV2）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的多重PCR方法（mPCR）。借助于Oligo6.0引物设计软件,设计了4对引物分别用于扩增PCV2ORF2基因353bp片段、PPVNS-1基因271bp片段、PRRSVMN基因美洲型434bp片段、PRVgB基因194bp片段。通过人为混合以上4种病毒进行特异性及敏感性试验,结果表明,该方法具有很好的特异性和敏感性。对猪瘟病毒、大肠杆菌和双蒸水的PCR扩增结果均为阴性;该mPCR方法对PPV的最低检测量为8.64×10-3μg,PRV的最低检测量为2.36×10-3μg,PRRSV的最低检测量为3.68×10-3μg,PCV2的最低检测量为2.90×10-4μg。该方法的建立对临床上PCV2、PPV、PRV、PRRSV的鉴别诊断以及以上这4种病毒的流行病学调查具有十分重要的意义。     

猪伪狂犬病毒、猪细小病毒、猪圆环病毒2型三重PCR快速诊断试剂盒的研制与应用

为了快速、灵敏、准确的鉴定猪伪狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)、猪细小病毒(Porcine parvoviurs,PPV)、猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2),从而为猪病的预防以及诊断提供依据,根据GenBank上发表的核苷酸序列分别设计了三对能特异性扩增PRV、PPV、PCV2的引物,并成功构建了重组质粒作为阳性对照,经过条件优化后建立了检测PRV、PPV、PCV2的三重PCR检测方法,对试剂盒的特异性、敏感性、重复性和保质期进行研究,并进行了初步的临床验证.试验证明,该检测试剂盒能同时扩增出猪伪狂犬病毒219bp的核苷酸片段,猪圆环病毒2型410bp的核苷酸片段以及猪细小病毒71 1bp的核苷酸片段,并通过在PCR缓冲液中添加5％的DMSO和1M的甜菜碱,减少了非特异性扩增,提高了检测试剂盒的灵敏度.该诊断试剂盒为流行病学的研究以及疾病的诊断提供了简单快速的选择.     

猪圆环病毒2型地高辛标记探针检测方法的建立与应用

根据GenBank中已发表的猪圆环病毒2型(PCV-2)基因序列,在ORF2内设计1对特异性引物,利用PCR反应扩增出371 bp的核酸片段,回收并纯化PCR产物,用地高辛标记,建立了地高辛标记核酸探针诊断PCV-2的方法。该探针与8个PCV-2重组菌的核酸抽提物均能发生特异性杂交,而与对照猪圆环病毒Ⅰ型(PCV-1)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)的核酸杂交均为阴性;对PCV-2 DNA的最低检测量为10 pg。     

断奶仔猪多系统衰竭综合征的防控

断奶仔猪多系统衰竭综合征（PMWS）主要是由猪圆环病毒Ⅱ型（PCV-2）感染所引起的一种新的病毒性疾病。单纯的PCV-2感染只表现轻微的临床症状。但在与其他病原并发或继发感染后病情严重,症状复杂。其他病原包括猪繁殖与障碍综合征（蓝耳病PRRSV）、猪瘟病毒（HCV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、细小病毒（PPV）、胸膜肺炎放线杆菌（APP）、     

多重PCR检测猪细小病毒和猪伪狂犬病病毒的研究

根据GenBank上已发表的猪细小病毒（Porcine parvovirus，PPV）的VP2基因序列和猪伪狂犬病病毒（Porcine pseudorabies virus，PRV）的gH基因序列，设计合成了两对特异引物，分别建立了PPV和PRV的单项PCR诊断方法，通过对扩增条件的筛选，最终成功地建立了PPV和PRV的复合PCR诊断方法，即利用一次PCR反应，可同时扩增PPV的751bp和PRV355bp的特异性片段，而扩增猪圆环病毒Ⅱ型（PCV．2）及相应的培养细胞（PK-15）核酸结果均为阴性，对PPV和PRV的最低检出量分别为100Pg和10Pg的DNA。该方法适合对PPV和PRV的联合检测和鉴别诊断。     

猪伪狂犬病病毒和猪圆环病毒2型多重PCR检测方法的建立与初步应用

为了建立可同时检测猪伪狂犬病病毒(PRV)和猪圆环病毒2型(PCV-2)的多重PCR检测方法,本研究根据GenBank中登录的PRV gE基因和PCV-2 ORF2基因的核苷酸序列,分别设计了2对特异性引物PRV-S/PRV-A和PCV-2-S/PCV-2-A,产物分别为270 bp和189 bp。检测结果显示,该方法具有较高特异性,检测PRV和PCV-2的DNA最低量均为1×10~(-4)μg/μL。对136份临床上疑似为PRV和PCV-2感染病料样品进行检测的结果表明,本研究建立的多重PCR检测方法可用于临床上PRV和PCV-2引起的单纯或混合感染的传染病病原学诊断。     

猪伪狂犬病病毒及猪细小病毒二联PCR检测方法的建立

根据猪伪狂犬病病毒（PRV）和猪细小病毒（PPV）2种病原体的基因保守序列，分别设计并合成了与PRv的gp50基因序列和PPV的VP2基因互补的两对引物，进行单相PCR，分别扩增出预期的217bp片段及158bp片段；同时，用这两对引物对混合的样品中的PRV和PPV的DNA模板进行二联PCP扩增及二联PCR反应条件的优化，结果得到2争与试验设计相符的217bp（PRV）和158bp（PPV）特异性务带：敏感性检测结果表明，对PRv的检测可以达到10^6.11／20μL TCID50对PPV的检测可以达到0．008HA单位的核酸模板。本文建立的PCR方法，可以在24h内对样品进行快速检测，可作为PRV、PPV感染和临床样品检测的可靠手段。     

多重PCR／RT—PCR技术检测PRRSV、PPV、PRV和PCV-2

根椐GenBank中已发表的猪蓝耳病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、伪狂犬病毒(PRV)和猪圆环病毒Ⅱ型(PCV-2)等4种病毒基因序列,对各病毒基因区进行同源性分析,确定PRRSV M和N、PPV VP2、PRV gD、PCV-2ORF2基因的保守区为各病毒的诊断靶序列.在建立各病毒单项PCR技术的基础上,优化多重PCR反应条件,建立了4种病毒的四重PCR技术,可同时扩增PRRSV的660 bp(北美株),PPV的313 bp,PRV的217 bp,PCV-2的447 bp的特异性片段.用82份临床病料对本研究多重PCR技术和单项PCR/RT-PCR技术进行对比验证,结果显示,两者的总符合率为93%以上.表明建立的多重PCR检测方法,具有特异、快速、准确的特点,可用于对这4种病毒的同时检测和鉴别诊断.     

检测猪伪狂犬病病毒和猪细小病毒的二重PCR方法的建立

作者建立了一种同时检测猪细小病毒(PPV)和猪伪狂犬病病毒(PRV)的二重PCR方法。根据GenBank上发表的PPV和PRV基因序列,针对各自保守区各设1对特异性引物,用这2对引物对同一样品中的PPV和PRV进行检测,结果同时扩增出942 bp(PPV)和485 bp(PRV)2条特异性片段。特异性试验表明,对其他几种病原的PCR扩增结果均为阴性。敏感性试验结果表明,该二重PCR能检出PPV 和PRV最低浓度分别为22、11.7 pg/L。该方法的建立对临床上进行这2种疾病的鉴别诊断和混合感染的检测都具有重要意义。     

PRV、PPV双重PCR检测方法的建立及其应用

为建立一种能够快速诊断猪伪狂犬病毒(PRV)、猪细小病毒(PPV)的方法,根据GenBank上发表的PRV、PPV核苷酸序列分别设计并合成了两对能特异性扩增PRV、PPV的引物,经过条件优化后,建立检测PRV、PPV的双重PCR方法,扩增两种病毒的片段分别为570bp、748bp。试验证明,该方法具有良好的特异性和敏感性,省时、省力、快速、敏感、高效的特点,为PRV与PPV的快速诊断试剂盒组装及流行病学的研究提供了技术支持。     

猪6种常见病毒多重PCR检测方法的建立及应用

旨在建立一种可同时检测猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)和猪巨细胞病毒(PCMV)的多重PCR检测方法。参考相关文献及序列比对结果设计6对特异性引物,建立了可同时检测以上6种病毒的多重PCR方法并应用此方法对临床病例进行了检测。结果表明,所建立的多重PCR方法灵敏度高,对6种病毒的最低核酸检测量分别为12.8pg(PRRSV)、46pg(CSFV)、16pg(PRV)、23.5pg(PCV-2)、72pg(PPV)、8.6pg(PCMV),对猪流感病毒(SIV)、猪乙型脑炎病毒(JEV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)和猪轮状病毒(PoRV)无特异性扩增。应用该方法对临床145份样品进行检测,总阳性率为83.45%,2种以上病毒混合感染阳性率为69.66%。说明所建立的多重PCR检测方法敏感,可用于猪群中上述6种猪病病原的单一感染或混合感染的鉴别诊断。     

猪圆环病毒2型SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立

为了建立猪圆环病毒2型（PCV2）SYBR Green I荧光定量PCR检测方法,采用PCR扩增PCV2 ORF2基因242 bp片段,并克隆入pMD18-T载体中,以纯化的重组质粒为模板作荧光定量PCR扩增,建立了PCV2荧光定量PCR检测方法,该方法检测灵敏度可达1.2×101拷贝/μL,与猪圆环病毒1型（PCV1）、猪瘟病毒（CSFV）、猪蓝耳病病毒（PRRSV）、猪细小病毒（PPV）、猪伪狂犬病病毒（PRV）、乙型脑炎病毒（JEV）核酸均不发生扩增反应,具有很好的特异性和重复性。结果表明：建立的PCV2实时荧光定量PCR检测方法具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床PCV2的检测。     

猪圆环病毒2型、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒的多重PCR诊断临床应用研究

为了研究规模猪场病毒性疾病早期、快速诊断方法,试验采用多重PCR方法对来自宁夏灵武地区某种猪场的临床血清进行了猪圆环病毒2型(PCV-2)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病毒(PRV)的病原诊断。结果表明:在哺乳仔猪、保育猪、母猪及种公猪中均检测出PRV、PCV-2阳性个体,PCV-2的阳性率达87.5%,PRV的阳性率为12.5%,但未检测出PPV。临床样品主要为PCV-2和PRV混合感染,阳性率达45.3%,其中1头主要采精的长白种猪携带有PCV-2和PRV。因此,推断该场仔猪发病可能与种公猪的带毒有关,建议该场仔猪全群免疫,同时对感染与带毒种猪群进行净化。