兔出血症研究

一种新的病毒病-兔出血症（Rabbit Haemorrheagic Disease,RHD）已被确认,其病原-兔出血症病毒（RHDV）首次在中国得到鉴定,RHDV为二十面体的小病毒,直径32-34nm,无囊膜,浮密度1.36-1.38g/cm#+3,沉降系数162 S。核酸为ssDNA,线性,分子量2.4×10#+(6)d,碱基的mol%为C=23.7、G=20.5、T=31.9、A=24,G+Cmol%为44.2,含4条结构多肽,分子量为VP#-(1)58-60kd、VP#-(2)54.7kd、VP#-(3)51-53kd和VP#-(4)26kd,能凝集人红细胞,抵抗乙醚、氯仿,对pH3和50℃60分钟稳定,能形成核内包涵体。据此,该病毒似可归于细小病毒属,为该属的一个新的有特殊个性的成员。该病为一种急性烈性传染病,只侵害成年家兔,在易感兔中传播迅速,发病率和死亡率均极高,常引起毁灭性流行,人工接种多于24-72小时内死亡,以全身性出血和多发性血管内凝血为主要特征。临床诊断的流行病学特点为：急性猝死,肺严重出血,肝充血、出血和坏死。用肝、脾等匀浆或血清作血凝（ HA）和血凝抑制（HI）试验即可确诊该病。脏器甲醛灭活疫苗能在3-4天内控制该病流行,免疫血清效果亦佳。由于预防接种、正确诊断和综合防治措施的贯彻执行,该病在我国已基本得到控制。     

兔出血症诊断方法的比较研究

应用血凝和血凝抑制试验、SPA协同凝集试验、生物素——亲和素免疫酶组化技术,检查5例健康对照兔和25例实验感染RHDV的不同发病阶段病兔的肝脏,联系病理组织学变化,比较上述3种方法在诊断RHD中的可靠性与灵敏度。结果表明:SPA协同凝集试验、生物素——亲和素免疫酶组化技术,同血凝与血凝抑制试验一样,是诊断RHD的特异、灵敏的可靠方法。三种方法比较以生物素——亲和素免疫酶组化法最灵敏,其次是血凝和血凝抑制试验,SPA协同凝集试验居第3位,但从定性角度而言此方法与血凝试验无差别。而且特异、简便。     

兔出血症病毒的特性

从实验发病兔肝经过聚乙二醇葡聚糖硫酸钠(PEG-DS)二相分配法和蔗糖密度梯度离心提取和纯化兔出血症病毒。紫外测定呈典型的病毒紫外吸收曲线,260nm/280nm比值为1.33,1％的琼脂电泳检查呈一条带。负染电镜下观察,病毒无囊膜,二十面体立体对称,直径34—36nm,病毒子表面有直径5—6nm的壳粒32个。另外,电镜下还见到22nm左右的病毒颗粒。病毒在氯化铯中的浮密度为1.36—1.38g/cm~3,沉降系数为162S。琼脂糖电泳在pH8.3条件下,病毒子向阴极移动。     

兔出血症病毒形态学的研究

用氯仿抽提、PEG沉淀、Scpharosc 4B柱层析、超离及蔗糖密度梯度离心等方法纯化了兔出血症病毒。电镜下观察到兔出血症病毒粒子为无囊膜,大小为32～34nm。外观呈现独特的结构。正二十面体对称,髓蕊直径15～17nm,衣壳厚8～9nm。由内、外衣壳组成。外衣壳上按T=3排列着32个壳粒,壳粒呈中空的管状,长5～6nm,直径约4～5nm。中心孔径约2nm。有一环状呈不连续的内衣壳,厚2～3nm,内环上不连续每段约4nm,与壳粒相连。在5、3和2次轴对称时,病毒表面有大的、3个以上特征性的表面凹陷(Surfacc dcpression),这种表面凹陷呈一定的分布。呈五次轴对称时,病毒表周有10个向外管状突起。病毒表周不规则,表面含丰富的突起和大、小的凹陷(dcpression and small indentation)是兔出血症病毒形态学特点之一,其大小和形态,在动物病毒中比较类似于嵌杯样病毒。     

兔出血症病毒结构多肽的研究

纯化ＲＨＤＶ经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ,硝酸银染色显示８条多肽,分子量分别为８５．１,７１．２,６４．５,６１．４,５７．３,５４．０,２９．２,２８．１ｋＤ,免疫转印结果确认其中的６条多肽为病毒结构多肽,分子量分别为６４．５,６１．４,５７．３,５４．０,２９．２,２８．１ｋＤ且其相对百分含量分别为６５．８７,３．１７,３．９７,１０．３２,９．５２,７．１４％,表明分子量为６４．５ｋＤ的多态为病毒主要     

应用协同凝集试验检测兔出血症

以兔出血症阳性血清制备5％协同凝集诊断液,并用于检测人工感染兔和健康对照兔的血浆,结果表明病毒人工感染兔濒死期血浆阳性检出率为100％(5/5),而体温升高1～2℃的疾病明显期血浆和对照兔血浆为阴性。提示用葡萄球菌 A 蛋白协同凝集试验检测濒死期血浆是诊断兔出血症的一种实用方法。     

实验性兔出血症的病毒抗原定位及病理形态学研究

对5例健康对照兔及25例实验感染RHDV的不同发病阶段病兔用生物素—亲和素免疫酶组化(BA)技术和常规病理学方法进行研究。结果表明RHDV是侵害多种组织细胞的泛嗜性病毒,但其主侵器官是肝脏,主要靶细胞是肝细胞及血管内皮细胞。感染初期RHDV首先在宿主细胞核内出现,随着病情发展在核内增殖、聚集,至疾病严重期核内感染强度达到高峰,濒死期略有下降。疾病后期,核内的RHDV颗粒通过破损的核膜或核崩解向细胞浆扩散。但只要核的轮廓尚存,核内RHDV的密度始终高于胞浆。本病的主要病理变化为急性坏死性肝炎,诸多器官出血、弥漫性血管内凝血,后期发展为急性败血症。疾病的实质是RHDV损伤肝细胞引起的病毒性肝炎。出血是重要的病理变化之一,它是血管内皮损伤、DIC和其它多种因素致使毛细血管壁通透性增强的反映,属于继发性病变。本文对RHDV在宿主细胞内的定性、动态变化,以及各器官组织的病理形态学变化及临床症状作了详细描写。     

等电聚焦分析兔出血症病毒多肽

人工感染ＮＪ株ＲＨＤＶ病毒死兔肝经低温反复冻融,氯仿处理,ＰＥＧ沉淀、Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－４Ｂ柱层析得纯化病毒。纯化病毒经尿素－聚丙烯酰胺圆盘等电聚聚焦,考马斯亮蓝染色紫外扫描显示８条多肽,其等电点及相对百分含量分别为Ａ：６．３,１８,５１％;Ｂ＝６．７,１１．２２％;Ｃ：７．４％;Ｄ：７．７,８．５３％;Ｅ：８．１,７,２７％Ｆ：８．７,１２．４４％Ｇ：９．０。１６,１８％,Ｈ：９．５,２２．２     

实验性兔出血症超微结构研究

取实验感染发病的兔出血症病例和健康对照兔的肝、肾、脾、淋巴结和大脑皮层,以2.5％戊二醛—钺酸固定、常规超薄切片、染色、电镜观察。除见细胞病变外,在肝细胞、肾小管上皮细胞、网状细胞、淋巴细胞和神经细胞的胞核内,有时也在胞浆中发现有病毒粒子,后者呈类圆形,直径为26.7～31.1nm。观察表明,病毒粒子在胞核内生成并存在于核内,但随感染细胞病变加剧、核膜变性与破损,病毒粒子可从核内扩散到胞浆中。同时还在肝细胞核内发现病毒性包含物。     

兔出血症病毒VP60主要抗原表位的原核表达及其免疫原性

[目的]研究兔出血症病毒（RHDV）VP60主要抗原表位基因原核表达蛋白的免疫原性。[方法]采用RT-PCR方法扩增了RHDV衣壳蛋白VP60主要抗原表位基因。以pET-28b（＋）为表达载体,在E.coliRosetta菌株中表达重组蛋白。通过Western blot分析和接种家兔检测了重组蛋白的免疫原性。[结果]经Western blot检测,在相对分子量24.0k Da处出现特异性的反应带。以纯化的重组蛋白制备的抗血清可以与纯化的RHDV发生特异性的ELISA反应。[结论]RHDV VP60主要抗原表位的原核表达产物具有较好的免疫原性。     

兔出血症自然病死兔的病理形态学研究

以常规病理学方法,对30例兔出血症自然病死兔进行研究。结果表明本病的主要病理变化是以肝细胞严重损伤为主要表现的急性坏死性肝炎,受检例100%发生;其次是诸多器官出血和弥漫性血管内凝血;其他病变为网状淋巴组织坏死和不同程度的活化、增生,急性肾病,肾上腺皮质细胞的变质性变化,肺内广泛性微血栓及多发性血栓形成,疾病后期发展为急性败血症。     

Ultrastructural Pathologic Observation on the Gut-Associated Lymphoid Tissues of Sacculus Rotundus of Rabbits Infected with Rabbit Haemorrhagic Disease Virus

Ultrastructural pathological changes in the gut-associated lymphoid tissues of sacculus rotundus(SR) of rabbits infected with rabbit haemorrhagic disease virus (RHDV) were first observed. There were nu-merous holes at the luminal and basement membrane surfaces of the dome epithelium(DE), consistently ac-companied by necrosis of lymphocytes and M-cells, and pronounced depletion of lymphocytes in the domes andfollicles, decrease of DE complex with formation of pseudomembranous structure on the surface of the domeepithelium. A specific finding in lymphocytes and macrophages was that severe destruction detraction of themembrane of rough endoplasmic reticulum(RER) was accompanied by conspicious increase of solitary, ribo-some-like particles in the cytoplasm, with appearances of intranuclear particles and intranuclear inclusions. Itwas found that there were many round and dense virion-like particles, with 26 nm in diameter, in the nucleiand cytoplasm of lymphoctes, plasma cells, macrophages and fibroblasts, or in degenerated cells and cellulardebris. At the same time, another round virion-like particles about 34 nm in diameter were also seen in the cy-toplasm of some cells and interstitium. The results indicated that the appearances of the ribosome-like parti-cles, virion-like particles and inclusion bodies were related to the replication and assembly of RHDV. Thepresent observations suggested that DE of sacculus rotundus could be a open pathway and a transporting routefor the entry of antigens into hosts. While the antigen is profoundly deleterious, DE may be as a closed portalor a barrier preventing the foreign antigenic materials from invading.     

兔出血症病毒核酸的电镜图

病毒性出血症病兔肝悬液离心去杂后其上清用聚乙二醇浓缩,又经正丁醇-异戊醇除去杂蛋白,然后以差速离心和蔗糖梯度离心,提取兔出血症病毒(RHDV)。提纯的病毒用核酸酶降解污染的细胞核酸后,加入8mol/L尿素,使核酸从病毒粒子中释放出来,经水相法展开,附于有碳膜的铜网上。检样经醋酸铀染色和铂旋转喷涂投影,于透射电镜下观察。RHDV核酸呈线状,平均长度为1.92μm。经公式推算出分子量为2.30×10~6道尔顿(Dalton)。     

兔出血症病毒浙江分离株核衣壳蛋白基因的克隆及遗传变异分析

【目的】探讨兔出血症病毒的遗传变异情况,为兔病毒性出血症的防治提供理论资料。【方法】对1989~2006年7株兔病毒性出血症病毒(RHDV)浙江分离株的核衣壳蛋白基因(VP60)进行了克隆与测序,同时利用分子生物学软件将其与国内外RHDV的基因组序列进行了比对和分析,并绘制了系统发生树。【结果】此7株RHDV的VP60基因均由1 740个核苷酸组成,编码580个氨基酸,其与参考序列之间的氨基酸同源性为94.0%~99.8%;系统发生树分析显示,所选的RHDV分离株可分为2个基因群,每个基因群又可分为两个亚群,其中中国分离株主要位于C亚群,与欧洲分离株的遗传距离较近,基因群之间的遗传距离有逐渐加大的趋势。【结论】RHDV在长期流行与演化过程中存在一定的遗传变异趋势。     

兔出血症病毒衣壳蛋白VP60主要抗原域基因的克隆

从人工感染兔出血症病毒(Rabbithemorrhagicdiseasevirus, RHDV)致死的兔肝脏组织中粗提病毒,采用SDS 蛋白酶K法提取RHDVRNA作为扩增摸板,根据Genbank已发表的RHDV的核酸序列,自行设计了 1对引物,进行RT PCR扩增,获得RHDVVP60的主要抗原域片段。经琼脂糖凝胶电泳分析其大小约为1 393bp,将扩增产物提纯后克隆至PET 32α( )载体质粒中,经转化和进一步筛选,酶切鉴定证实获得了RHDVVP60主要抗原域基因的克隆,从而为该基因的表达和基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

兔出血症病毒主要结构多肽的纯化及免疫保护性试验

人工感染ＲＨＤＶ－ＮＪ株病死兔肝经－５０℃反复冻融,氯仿处理,ＰＥＧ沉淀、差速离心,Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ－４Ｂ柱层析得纯化病毒,纯化ＲＨＤＶ经ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、ＣｕＣｌ２负染色后,切取主要结构多肽ＶＰ１（６４．５ＫＤ）凝胶带,除去ＣｕＣｌ２和ＳＤＳ获得ＶＰ１,高效液相色谱鉴定只有一个蛋白峰,Ｗｅｓｔｅｒｎ－Ｂｌｏｔｔｉｎｇ,ＨＡ和ＨＩ结果显示纯化ＶＰ１具有良好的抗原表位稳定性。无母源抗体的３月龄兔１