白蜡虫蜡酯合酶在昆虫细胞Sf9中的表达

[目的]本研究欲利用Bac-to-Bac表达系统,在Sf9细胞中表达WS.[方法]将WS编码序列克隆到质粒pFastBac^TMHT B后,转化大肠杆菌DH10Bac^TM,经抗性和蓝白斑筛选,获得重组杆粒rBacmid/EpelWS.将rBacmid/EpelWS转染Sf9细胞.[结果]免疫荧光标记检测表明:WS在受感染细胞的细胞质中表达.[结论]本研究成功表达了白蜡虫WS,为白蜡虫WS的生化特性研究奠定了基础.     

白蜡虫ws基因RNAi载体构建及原核表达dsRNA

[目的]构建白蜡虫(Ericerus pela)蜡酯合酶(wax synthase,WS)基因干扰载体并建立其体外dsRNA(doublestranded RNA,dsRNA)原核表达体系,低成本大量制备白蜡虫ws基因的dsRNA。[方法]克隆白蜡虫蜡酯合酶基因ws片段,连入L4440载体,将重组质粒转入大肠杆菌HT115感受态细胞,经IPTG诱导获得与目的片段相对应的dsRNA。[结果]白蜡虫ws基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)载体成功构建,重组质粒转入HT115感受态细胞经IPTG诱导后菌体成功表达dsRNA,dsRNA的平均获得量1 705 ng·m L~(-1)。[结论]该研究通过原核表达白蜡虫ws基因的dsRNA,为后续利用RNAi实验研究白蜡虫ws基因功能及作用机理奠定基础。     

蜡梅几丁质酶基因的克隆与原核表达

在构建好蜡梅花cDNA文库并进行EST分析基础上,通过随机克隆测序,得到1个蜡梅几丁质酶的cDNA基因,命名为Cpchia(GenBank登录号:FJ749130).Cpchia cDNA全长为1 184 bp,开放阅读框为954 bp,编码317个氨基酸,其结构包括信号肽、几丁质结合域、可变交联区、催化区,无C端延伸区,为Class Ⅰ b型胞外几丁质酶,属于几丁质酶第19家族.将Cpchia克隆到原核表达载体pET-28a(+),在大肠杆菌BL21细胞中以包涵体形式表达融合蛋白,利用透析法获得复性蛋白,其几丁质酶活性经DNS法检测达到200 U·mL~(-1).酶活性和稳定性分析表明,试验条件下,pH 7.0有利于酶的稳定和活性发挥,40 ℃活性最高,在0 ℃低温下也有较高活性.上述结果说明,分离的Cpchia基因编码蛋白具有几丁质酶活性,而且可能与蜡梅花的抗寒性形成有关.     

油桐LACS4基因的克隆与原核及真核表达

长链酰基辅酶A合成酶(LACS)在油脂代谢过程中发挥着重要的作用。以油桐近成熟种子为材料,在已构建的转录组数据库基础上,克隆得到一个油桐长链酰基辅酶A合成酶基因,在此基因c DNA全长序列的基础上,成功构建了油桐LACS4基因的真核表达和原核表达载体,其中,酵母表达载体p YES2-LACS4成功转入酿酒酵母菌株INVSc1中,并进行相关生长趋势分析;在大肠杆菌BL21(DE3)宿主细胞中,原核表达载体p ET30a-LACS4也成功诱导表达,并获得大约为74k Da的表观分子量的相应目的蛋白。     

油茶查尔酮合酶和异构酶基因的cDNA克隆

查尔酮合酶和查尔酮异构酶是类黄酮代谢与色素苷代谢的关键酶.以油茶近成熟种子cDNA文库和EST文库为材料,通过分子克隆方法鉴定了1条查尔酮合酶基因全长cDNA和1条查尔酮异构酶全长cDNA.结果表明:油茶查尔酮合酶基因的cDNA含1479 bp,编码412个氨基酸,为目前最长的查尔酮合酶,与其它物种的查尔酮合酶具有极高的相似性,在进化上高度同源;油茶查尔酮异构酶基因的cDNA含899 bp,编码206个氨基酸,与茶的查尔酮异构酶基因高度同源,但与其它物种的相似性较低.     

白蜡虫β1-微管蛋白基因cDNA克隆及序列分析

采用RACE和RT-PCR对白蜡虫雌成虫β1-微管蛋白基因进行了克隆,获得的cDNA全长序列为1 492 bp,完整开放阅读框为1 341 bp,编码447个氨基酸残基,包含β微管蛋白的保守区域和GTP结合位点,理论分子量约为50.20 Kda,等电点为4.75。同源性分析表明:所获得的β1-微管蛋白与其它昆虫的β微管蛋白基因在氨基酸水平上是高度同源的,该基因cDNA序列已经递交到Genbank,获得的登录号为JF731244。     

湖南蜡蚧长角象发生规律及防治

随着虫白蜡放养规模的不断扩大,传统害虫蜡蚧长角象已上升为白蜡虫主要害虫。通过标准地定期随机取样及室内饲养,研究了白蜡虫蜡蚧长角象发生规律。结果表明:蜡蚧长角象在湖南每年发生1代,成虫6月中旬至次年3月上旬,在大叶女贞等寄主植物树皮下休眠长达9个月时间,成虫3月中旬活动产卵,4月上旬幼虫开始孵化取食白蜡虫卵为害,幼虫3龄,幼虫期平均食卵1 458粒/头。该虫在传统白蜡虫产种区比产蜡区及新产区为害严重,平均为害率30%以上,最高达76.85%,湖南芷江作为传统产蜡区,为害率为16.9%。提出了适于生产操作的"虫种粒选"、"网袋放养"、"及时收包"相结合的蜡蚧长角象综合防治方法。     

刺五加鲨烯合酶基因的表达及其对皂苷含量的影响

为了了解刺五加鲨烯合酶基因(squalene synthase,SS)的表达特点及其对刺五加中皂苷含量的影响情况,以GAPDH基因为内参照基因,采用实时定量PCR技术,分析了SS基因在刺五加不同生长发育时期不同器官中的表达量及茉莉酸甲酯对其表达的影响情况;还利用SPSS 17.0软件分析了SS基因的表达量与刺五加中皂苷总含量的相关性。结果表明,在刺五加的整个生长期中,SS基因的表达量呈现出"低—高—低—高—低"的变化趋势:萌芽期(4月26日)该基因的表达量最低,而盛花期(6月26日)该基因的表达量最高,为萌芽期的3.11倍;SS基因在刺五加根中的表达量显著高于茎、叶和叶柄中的表达量(P<0.05),其在茎中的表达量最低,仅为根中表达量的51.88%。茉莉酸甲酯可提高SS基因的表达量,但其与对照组的差异未达到显著水平。刺五加中的皂苷总含量与SS基因的表达量间呈现出同升同降的变化趋势,存在极显著的正相关关系(P<0.01)。文中初步判定,鲨烯合酶是刺五加皂苷生物合成的关键酶。     

欧美杨107次生木质部纤维素合酶基因片段的克隆及序列分析

以欧美杨107次生木质部为材料提取总RNA,克隆得到了一个纤维素合酶基因片段.序列分析表明:该基因序列为883bp,与Populus tremula×Populus tremuloides木质部特异性纤维素合酶基因CesAl和Populus×canescen纤维素合酶基因的相似性均达到99%,与Populus tremuloides木质部特异性纤维素合酶基因Cex43的相似性达到98%.此片段拟表达的氨基酸序列具有纤维素合酶共有的锌指结构和一个不完全的高突变区,证明此DNA片段是纤维素合酶基因的片段,构建了重组质粒,并命名为pMD20-T-CesA1.     

日本落叶松纤维素合酶基因片段的克隆及单核苷酸多态性分析

[目的]纤维素合酶(cellulose synthase,CesA)在植物纤维素合成途径中发挥主要调节作用,是控制木材纤维品质和产量的重要基因.从日本落叶松中分离克隆与纤维素合成相关的LkCesA基因,并对其进行核苷酸多样性以及连锁不平衡分析,为在日本落叶松中开展基于LkCesA基因的连锁不平衡作图及其辅助日本落叶松木材纤维性状的分子育种提供理论依据.[方法]依据日本落叶松转录组数据库检测到的纤维素合酶(CesA)基因ESTs序列设计引物,从日本落叶松中分离获得LkCesA基因片段.在此基础上,利用DnaSP5.0软件对日本落叶松40株基因型个体的LkCesA序列进行核苷酸多样性和连锁不平衡分析.[结果]从日本落叶松中成功克隆了CesA基因片段:该片段长1 209 bp,包含部分开放阅读框,长度为1 053 bp,可编码350个氨基酸,所推导的蛋白质氨基酸序列与火炬松Pt-CesA2的蛋白质氨基酸序列同源性为95.4％.在日本落叶松40株基因型个体的LkCesA序列中共检测到83个SNP位点,SNP发生频率为1/21 bp,多样性指数πT为0.006 05.在这些SNPs中,69个属于转换,14个属于颠换,其中19个为常见SNPs,64个为罕见SNPs.在外显子区域,共检测到54个SNP位点,其中34个为错义突变,20个为同义突变.进一步的连锁不平衡分析显示,随着核苷酸序列长度的增加,SNP连锁不平衡程度逐渐减弱.[结论]克隆到的LkCesA为植物CesA基因家族中的一员.LkCesA基因的连锁不平衡在基因内部就已衰退,说明选择该基因作为候选基因,在日本落叶松中开展连锁不平衡作图用于指导日本落叶松的定向培育及木材品质改良是可行的.此外,在LkCesA基因中检测到多个常见SNP位点,为进一步开展该基因的连锁不平衡作图提供了材料.     

白蜡虫肠道微生物分析及立克次氏体分子检测

肠道微生物对于昆虫的生长和发育起着重要作用,不仅参与维生素合成、脂肪和碳水化合物的吸收与利用、孤雌生殖、信息素的合成,同时在抵御外来菌的侵入与定植以及在加强免疫系统的功能中也起着重要作用[1-2]。对于刺吸式昆虫来说,由于植物枝干韧皮部汁液营养组成不均衡,碳水化合物含量丰富而必需氨基酸组分欠缺或含量较低[3],这些昆虫体内的共生细菌能提供寄主昆虫所缺乏的必需氨     

外源保幼激素类似物对白蜡虫泌蜡和发育的影响

[目的]探讨外源保幼激素类似物(JHA)对白蜡虫泌蜡和发育的影响。[方法]使用高、中、低浓度保幼激素类似物经喷施、涂干、注射处理白蜡虫2龄雄幼虫。[结果]表明:白蜡虫2龄雄幼虫经外源中等浓度保幼激素类似物(2.5 mg·m L-1)喷施处理可以显著提高白蜡虫2龄雄幼虫的个体泌蜡量,昆明地区增产率平均可达41.50%,峨眉地区增产率平均达25.56%;但此方法在2地区之间表现出差异性,原因可能与两地种虫来源所处的生态环境差异有关。在中、低浓度范围内,JHA对白蜡虫蛹体质量表现出促进作用,高浓度表现出抑制作用;JHA对蛹体长的抑制随着外源保幼激素浓度的增加而增强;外源保幼激素类似物还可以提高白蜡虫蛹的羽化率,羽化率达62.70%~81.62%。[结论]中浓度JHA(2.5 mg·m L-1)喷施处理2龄雄幼虫显著提高白蜡虫泌蜡量;白蜡虫蛹的体长与JHA浓度之间存在一定的负相关性;白蜡虫蛹的体质量表现出低浓度促进,高浓度抑制;喷施和涂干处理,高浓度可显著提高白蜡虫蛹的羽化率;白蜡虫蛹的羽化可能并不受其体质量和体长的影响。     

白蜡虫孵化行为的研究

白蜡虫卵孵化主要受温度的影响，湿度和光照对其孵化行影响不大。白蜡虫卵在温度１２℃温度范围内卵都能孵化，以２０－２５℃条件下孵化率较高，达９５％左右。     

越冬白蜡虫微生物多样性分析

[目的]了解白蜡虫越冬时体内微生物的多样性,比较昆明与长春越冬虫体内微生物种类和数量的差异,为了解白蜡虫低温适应机制提供有用信息。[方法]采用Miseq高通量测序方法对昆明越冬雌成虫(KM)和长春越冬雌成虫(CC)体内细菌16s rRNA及真菌ITS基因进行测序,利用Usearch软件进行细菌和真菌OTU(Operational Taxonomic Unit)划分,并利用Mothur软件对OTU进行分类学分析和多样性指数分析。[结果]细菌KM和CC样品中共得到344个OTU,真菌KM和CC样品中共得到230个OTU。细菌共鉴定到15门、137属,在KM中乳球菌属占主要比例(29.78%),而在CC中立克次氏体占主要比例(55.77%),真菌中共鉴定到6门、83属,在KM中仅鉴定到41个属,而CC中鉴定到75个属,其中线虫草科无法归类的属在2个样品中均为优势菌群,但CC中含量远低于KM。[结论]昆明与长春越冬虫体内细菌及真菌种类和数量均不相同,与昆明越冬虫不同,需要应对极端低温的长春越冬虫体内立克次氏体为优势菌群。     

白蜡虫雄虫真蛹转录组分析

[目的]蛹期对于白蜡虫雄虫发育和交配具有重要意义,但目前缺乏对于白蜡虫真蛹基因转录情况的分析,本研究旨在获得白蜡虫真蛹转录组数据,了解其转录组特征。[方法]采用Illumina Hi Seq 2000进行高通量测序,并进行生物信息学分析;采用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测3个热激蛋白基因(hsp)在不同虫态中的表达动态。[结果]共获得63 957条unigene、63 272个开放阅读框(ORF)、9 561个SSR分子标记,unigene平均长度674 bp,共有14 327条unigene获得了注释,Gene Ontology(GO)注释和Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes(KEGG)注释分析表明,很多基因参与的功能与白蜡虫蛹期的生理特征吻合。[结论]该转录组数据为白蜡虫基因功能鉴定和蛋白组学分析研究奠定了数据基础。     

白蜡虫热激蛋白基因在低温胁迫下的表达分析

白蜡虫对低温的高度耐受性对其生存、繁殖及白蜡生产都至关重要。为探讨低温胁迫对白蜡虫hsp表达的影响,采用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）,对白蜡虫二龄雄虫在低温胁迫下7个不同的 hsps（hsp21.5,hsp21.7,hsp40,hsp60,hsp70,hsc70,hsp90）的基因表达情况进行了检测。结果发现,除hsc70外,其余hsps均能被低温不同程度地诱导,其中hsp70、hsp21.7和hsp90的上调量十分显著。说明多数hsps都与白蜡虫幼虫应对低温胁迫相关。     

白蜡虫泌蜡研究 Ⅱ.不同寄主植物上的泌蜡比较

本文报道了在昆明地区女贞、白蜡树和小叶女贞三种不同寄主植物上白蜡虫的泌蜡状况。试验结果表明,通过在三种寄主树上放养昆明种虫和昭通种虫,不同寄主的雄虫个体平均泌蜡量,单头种虫产蜡量因种虫和寄主不同而不同;白蜡虫在不同寄主上泌蜡存在高峰期,泌蜡高峰期因寄主和种虫不同而异;白蜡虫历时基本上不受寄主的影响,在３种寄主上大致相同。用白蜡虫雄虫个体平均泌蜡量、单头种虫产蜡量和泌蜡历时等指标衡量,在昆明地区,女贞是白蜡虫的优良寄主。     

毛竹微管蛋白基因PeTua3的原核表达及其 功能初步研究

作为细胞骨架的重要组成部分,微管蛋白在细胞壁发育过程中起着重要的调控作用。采用RT-PCR技术从毛竹叶片中克隆到一个微管蛋白(Tua3)同源基因的cDNA序列,长1 356 bp,编码451个氨基酸,命名为PeTua3。构建原核表达载体pET-32b-PeTua3,并将其转入大肠杆菌中诱导表达。蛋白电泳检测结果表明:温度和诱导时间对PeTua3基因蛋白的表达影响差异显著,其中,在37℃用0.4 mmol.L-1IPTG诱导2 h的表达效果最好。用PeTua3基因体外表达的重组蛋白处理拟南芥种子,其幼苗上胚轴明显增粗,侧根增多;超薄切片显微观察显示,重组蛋白处理的拟南芥上胚轴和主根的薄壁细胞数量均增多,细胞体积变大,维管束增粗。