外源诱导提高茶树新梢EGCG含量过程的相关基因分离

以福鼎大白茶为试验材料,用荧光标记的mRNA差异显示技术,研究外源诱导物ID1在诱导提高茶树新梢EGCG含量过程中基因转录水平的变化,分离相关基因片段。从诱导茶树芽叶及对照中分离出18个差异显示的cDNA片段,反向Northern杂交显示其中5个片段可能是来自差异表达基因的转录产物,其中编号DD2、DD9、DD12、DD16为诱导表达上调片段,编号DD3为诱导表达下调片段。将这5个片段克隆于pGEM T-Easy载体,酶切鉴定结果显示载体以及插入的特异片段。序列测定表明,DD12的cDNA片段出现未识别码。通过NCBI网站(http:/www.ncbi.nlm.nih.gov)作Blast序列同源性分析。结果表明,DD2的差异cDNA片段与烟草的硫氧还蛋白过氧化物酶的基因序列同源;DD3的差异cDNA片段,是茶树一个RAPD产物(AJ516005.1)的一段序列,功能未知;DD9的差异cDNA片段与拟南芥、莲子的NADH脱氢酶具有很高的同源性;DD16的差异cDNA片段未能找到与之同源的基因序列,可能为新基因。     

茶树CsCHLI基因的克隆及其在不同叶色白化茶树中的表达分析

镁离子螯合酶是叶绿素合成过程中的关键酶之一,与植物叶色的白化现象密切相关.以陕茶1号、白叶1号、极白1号、黄金芽和黄金叶等5个茶树品种叶片为试验材料,分别克隆其镁离子螯合酶I亚基(Mg-chelatase I subunit,CHLI)编码基因CsCHLI全长CDS序列.多序列比对显示,白叶1号中两个碱基差异位点(G5...     

茶树丝氨酸羧肽酶基因的克隆及表达分析

近年来,人们发现丝氨酸羧肽酶类蛋白(SCPL)参与植物次生代谢产物的酰基转移过程,即具有转酰基功能。本研究采用RT-PCR技术,获得了3个茶树丝氨酸羧肽酶基因的全长序列;生物信息学分析表明,3个CsSCPL蛋白均包含了1个底物结合位点、3个催化作用保守区和多个N-糖基化位点,及其Ser-Asp-His三联体催化中心等SCPL家族的典型特征;进化树分析表明,3个CsSCPL可能具有酰基转移酶的功能。实时荧光定量PCR结果表明3个基因在芽叶茎根中都有表达,其中,CsSCPL1和CsSCPL3在叶中的相对表达量明显高于茎和根,而CsSCPL2则在根中高表达。本研究成功地将CsSCPL重组到表达载体pET32a(+)上进行原核表达,并对诱导时间及诱导温度进行了优化;经IPTG诱导、SDS-PAGE检测,目标蛋白条带分子量为70 kD,与预测大小相符。     

茶树磷酸烯醇式丙酮酸转运子基因CsPPT的克隆与表达分析

以白叶1号为试验材料,通过RT-PCR和RACE技术克隆获得茶树磷酸烯醇式丙酮酸转运子基因CsPPT（GenBank登录号：KJ652972）。CsPPT完整ORF长度为1β227βbp,编码408个氨基酸,蛋白分子量为44.7βkDa,理论等电点为10.16;无信号肽位点,属于非分泌型蛋白;建立了茶树CsPPT蛋白的系统发育树;磷酸化修饰预测该蛋白质多肽链中共有26个磷酸化位点;TMHMM预测表明CsPPT蛋白为跨膜蛋白;亚细胞定位发现,CsPPT蛋白定位于叶绿体上,推测CsPPT蛋白可能定位于叶绿体膜上。荧光定量PCR结果表明CsPPT基因在茶树花中表达量最高,其次为芽、叶和嫩茎,根中最低。     

茶树磷转运蛋白基因CsPT4的克隆、亚细胞定位及表达分析

茶园中磷肥的利用效率取决于茶树体内与磷元素吸收、转运及生理利用等相关蛋白的协同调控,而磷转运蛋白(Phosphate transporter proteins,Phts)在此过程中起着关键的调控作用。本研究以茶树品种龙井长叶(Camellia sinensis cv.Longjing-changye)为试验材料,采用同源克隆的方法首次克隆获得茶树磷转运蛋白编码基因Cs Pht1:4(Cs PT4)的全长c DNA。该基因全长1 642 bp,开放阅读框(ORF)1 620 bp(Gen Bank登录号:KY132100),编码539个氨基酸。生物信息学分析显示,Cs PT4基因编码蛋白分子量为59.12 k D,理论等电点(p I)为8.51;具有典型的Pht1家族特性:"6-亲水-6"跨膜结构。亚细胞定位结果显示,该蛋白分布于质膜上,与Softberry软件预测结果一致。荧光定量PCR表明:Cs PT4在正常生长的茶树根、茎、嫩叶、老叶中均有表达,在老叶中的表达量较高,在根部表达量最低。低磷处理,根和叶中Cs PT4上调表达水平均先上升后下降;根部Cs PT4表达量48 h内各个时间点均高于叶部。缺磷处理,根和叶中Cs PT4上调表达水平均升高;根部和叶部分别在72 h和48 h达最大值。本研究为茶树响应低磷的分子机制提供了参考。     

白鸡冠茶树CsPPH基因全长cDNA克隆与表达分析

脱镁叶绿素酶（Pheophytinase,PPH）是叶绿素降解过程中的一个关键酶,它能使脱镁叶绿素a转化为脱镁叶绿酸a,脱镁叶绿酸a是叶绿素降解途径中最后一个保持植物绿色的产物,被认为是叶片衰老和黄化的关键步骤。以新梢白化茶树白鸡冠叶片为材料,克隆获得CsPPH基因cDNA的全长序列（登录号：MK359094）,并对其进行生物信息学分析。结果表明,CsPPH全长为1 298 bp,包含的ORF序列为1 241 bp,编码413个氨基酸。序列分析表明,该基因编码的蛋白质为稳定疏水蛋白,其预测分子量为45 741.50 Da,理论等电点为6.12。预测该基因主要定位于叶绿体中。qRT-PCR结果显示,遮荫抑制白鸡冠叶片CsPPH的表达,叶绿素升高,叶色变绿;光照促进白鸡冠叶片CsPPH的表达,叶绿素降解,导致叶片白化。     

外源诱导提高茶树EGCG含量过程的蛋白质组差异分析

通过无公害化学诱导子的诱导可使茶树芽叶的EGCG含量提高20.15%～25.00%。为了探明诱导的分子机制,用固相pH梯度双向凝胶电泳分离诱导芽叶与正常芽叶的总蛋白质,结果获得了分辨率和重复性较好的双向电泳图谱,差异表达分析发现,诱导出现的特异蛋白有14种,诱导消失的特异蛋白有8种,诱导表达上调相差10倍的特异蛋白有11种,诱导表达下调相差10倍的特异蛋白有6种。选取两个差异蛋白质点进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF-MS)测定其酶解后的肽质指纹图谱,通过http:/www.matrixscience.com网站,利用Mascot软件检索NCBInr数据库。查询结果:一种为光合系统Ⅰ的铁硫蛋白,另一种为未知蛋白。这些结果表明,茶树诱导芽叶与正常芽叶的蛋白质组存在差异,这些特异蛋白可能在诱导过程中起着重要的作用。     

茶树CsANS基因及其启动子的克隆与生物信息学分析

采用RACE技术,获得茶树武夷奇种C18叶片花青素合成途径中的花青素合成酶(ANS)基因的c DNA全长序列。采用染色体步移技术获得该基因的启动子序列。采用实时荧光定量PCR技术检测该基因在不同遮光处理下的表达动态。结果表明,Cs ANS全长c DNA为1 000 bp,其中ORF(Open Reading Frame)为957 bp,编码320个氨基酸,含有DIOX-N和20G-Fell-Oxy保守功能结构域;分离得到Cs ANS基因上游调控序列1 010bp,其含启动子核心元件TATA-box及ACE、GT1-motif、Sp1(光响应元件)、circadian(生物钟相关元件)等与花青素合成途径相关的重要顺式作用元件。荧光定量PCR分析表明,该基因在全光照处理(CK)时表达量较高,75%遮光时表达量较低。说明该基因的表达受光照强弱的控制。     

茶树花粉中丙酮酸脱氢酶(CsE1α)的定位分析及其启动子的克隆与表达

根据以往试验获得的Cs E1α的c DNA全长序列,利用TAIL-PCR克隆Cs E1α启动子。测序验证与生物信息学分析后发现,该启动子片段长336 bp,含有2个CAAT-box,2个TATA-box,2个GATA-box,1个LTR,1个G-box等顺式作用元件。构建载体转入洋葱内表皮细胞瞬时表达,启动子可启动下游报告基因,使荧光蛋白表达于整个细胞,表明所克隆的启动子具有启动功能。Cs E1α与GFP融合蛋白瞬时表达表明Cs E1α定位于线粒体。本实验为下一步转基因拟南芥稳定表达,进一步研究Cs E1α基因的表达调控,探讨茶树花粉抗寒的分子生物学机理奠定基础。     

茶树钙依赖性蛋白激酶基因CsCDPK17的鉴定及表达分析

钙依赖型蛋白激酶(Calcium-dependent protein kinases,CDPKs或CPKs)是植物细胞中重要的钙离子信号受体,普遍参与了植物生长发育和胁迫响应等调控过程。本研究从茶树龙井43中克隆到1条CDPK基因,经测序验证该序列包含1611bp的完整ORF,编码536个氨基酸。结合序列比对和进化分析发现该蛋白N-末端具有豆蔻酰化位点,具备钙依赖性蛋白激酶的保守结构域,并且与拟南芥AtCDPK17的同源关系最近,因此命名为CsCDPK17(Genbank登录号为:MK238482)。蛋白质理化特性分析发现其蛋白分子量为59.9kD,理论等电点pI为5.43,属无跨膜结构域的亲水性蛋白。使用水稻原生质体和烟草叶片两种瞬时表达的方法均证明CsCDPK17是细胞质膜和细胞核双定位蛋白。对克隆到的CsCDPK17上游2000bp的启动子区分析发现了多个与基因转录、光、激素(ABA、SA、MeJA等)相关的顺式作用元件。表达分析显示,CsCDPK17在成熟叶和种子中表达水平较高,而在根中的表达水平最低;在龙井43、大面白等4个品种冷驯化过程中,该基因的表达随着冷驯化过程显著上调,随着脱驯化过程下调;同时还发现CsCDPK17能够不同程度地响应低温(最高5.1倍)、干旱(最高2.3倍)、渗透(最高2.4倍)胁迫。本研究的结果表明CsCDPK17在茶树的生长发育和低温、干旱、渗透等非生物胁迫响应的过程中均发挥一定的调控作用。     

茶树P5CS基因克隆及其在渗透和高盐胁迫下的表达分析

△1-吡咯琳-5-羧酸合成酶是植物脯氨酸合成过程中的关键酶。应用同源克隆方法获得茶树P5CS,序列长为1 316 bp,编码323个氨基酸;其编码蛋白分子量为34.7 ku,p I为7.62;N端有1个氨基酸激酶超家族[Amino Acid Kinases(AAK)superfamily]功能区,C端有1个醛脱氢酶超家族[Aldehyde Dehydrogenas(ALDH)superfamily]功能区,预测为亲水性跨膜蛋白;对18个物种的P5CS进行聚类分析,结果生物学分类及进化关系吻合。并与美味猕猴桃高度同源,相似度达89%。应用实时荧光定量PCR分析表明,该基因转录本在水分胁迫24 h内升至对照组水平的2.6倍,而高盐胁迫48 h后才升至9.9倍的最高值;水分胁迫应答速度快,但相对表达量较高盐胁迫低。由此推测该基因被诱导参与了渗透胁迫应答响应,并且对渗透胁迫中的旱害脱水更为敏感。     

茶树几丁质酶基因的克隆及其在干旱胁迫下的表达分析在干旱胁迫下的表达分析

以铁观音茶树叶片为材料,利用逆转录PCR及RACE法,克隆了茶树几丁质酶基因CsChi(GenBank登录号为KR078345).CsChi基因的cDNA全长为1 192 bp,包含972 bp的开放阅读框(ORF),编码323个氨基酸.生物信息学分析结果表明,CsChi蛋白的分子量为34.33 ku;理论等电点pI为8.44;原子组成为C1519H2285N413O464S18,总原子数为4 699;蛋白质结构分析显示该蛋白有6个蛋白的跨膜区域,属于跨膜蛋白;存在于细胞外;没有卷曲螺旋结构存在;CsChi基因编码的蛋白属于糖苷水解酶19家族,含有保守的ChtBD1结构域,与溶菌酶的保守结构域类似,可能兼具几丁质酶活性和溶菌酶活性,qPCR定量分析结果显示在不同干旱胁迫处理下茶树的CsChi基因的表达量,与对照组相比有所增加.推测CsChi基因在茶树干旱等逆境胁迫中起重要作用.     

茶树丙氨酸氨基转移酶基因的克隆与表达分析

丙氨酸氨基转移酶(Alanine Aminotransferase,Ala AT)是与碳氮代谢相关的一种重要酶类。采用反转录PCR的方法克隆了茶树Cs Ala AT1的c DNA序列,该序列全长1 747 bp,包含一个完整的ORF(1 626 bp),编码541个氨基酸,推导的蛋白质分子量为59.4 k D,理论等电点(p I)为5.82。同源比对结果表明,Cs Ala AT1含有丙氨酸氨基转移酶亚家族保守的辅酶磷酸吡哆醛结合位点,其氨基酸序列与拟南芥At Ala AT1蛋白的相似性为84%。二级结构预测显示该蛋白由α-螺旋(40.67%)、无规则卷曲(29.57%)、β-折叠(13.68%)和延伸链(16.08%)组成,定位于线粒体,不含信号肽与跨膜结构。实时荧光定量PCR(RT-PCR)检测发现Cs Ala AT1在茶树各组织中均有表达,在根中的表达量最高;Cs Ala AT1基因表达对氮素的响应研究表明,成熟叶中Cs Ala AT1受氮素诱导上调表达,高浓度(1 mmol·L-1 NH4NO3)氮素的诱导效应比低浓度(0.1 mmol·L-1 NH4NO3)氮素诱导效应更强烈;在根中,处理24 h后,高氮诱导Cs Ala AT1上调表达,低氮诱导Cs Ala AT1下调表达。     

茶树CsLHTs亚家族基因的克隆与表达分析

氨基酸是茶叶的重要品质成分和氮素贮存形式,因此开展茶树体内氨基酸转运蛋白的研究尤为重要。本研究从茶树转录组中筛选得到5条茶树LHTs(Lysine histidine transporters,赖氨酸/组氨酸转运蛋白)家族基因序列,并从龙井43中成功克隆获得4个茶树LHTs基因,分别命名为CsLHT1、CsLHT6、CsLHT8.1和CsLHT8.2。对该亚家族编码的氨基酸序列的理化性质和功能结构进行预测,结果显示CsLHTs亚家族含有9~11个跨膜区;且含有与氨基酸转运相关的结构域。为了明确在不同茶树品种和氮素水平间CsLHTs基因的表达差异,本研究选用3个茶树品种的扦插苗为试验材料,水培条件下氮饥饿两周后,分别用0.2、2、10mmol·L^-1的NH4NO3进行处理。利用qRT-PCR分析了CsLHTs在不同组织间的表达情况,结果表明4个基因在茶树营养组织中均有表达。经氮素处理后,CsLHTs基因在3个氮素水平和3个品种中呈现出不同的变化规律。CsLHT1、CsLHT6和CsLHT8.2在品种间的表达差异程度高于不同氮素水平间的基因表达差异。CsLHT8.1对氮素处理有明显的响应,尤其经0.2mmol·L^-1和10mmol·L^-1的NH4NO3处理72h后,在氮高效品种中茶302根中呈上调表达,表明CsLHT8.1可能参与氨基酸由根部向地上部的转运过程。     

苦瓜果实S-腺苷蛋氨酸脱羧酶基因McSAMDC的克隆、表达及亚细胞定位

根据已构建苦瓜果实均一化文库中获得的1个与SAMDC基因相关的EST序列,采用3′RACE技术,克隆获得1个苦瓜SAMDC基因的cDNA全长序列,命名为McSAMDC(GenBank登录号为KC632099).生物信息分析结果表明,该cDNA全长l900bp,5′UTR和3′UTR分别长501、325bp.该cDNA序列存在3个开放读码框(微型tORF、上游读码框uORF和主读码框mORF),其中mORF长1077bp,编码358个氨基酸,预测分子量为39.31ku,含有酶原剪切位点结构域和蛋白快速降解有关的PEST二个保守结构域.二级结构分析显示,McSAMDC含有无规卷曲(45.53％)、α-螺旋(29.33％)、伸展链(19.83％)、β-转角(5.31％).序列分析结果表明,McSAMDC与拟南芥(CAA69073.1)、琴叶拟南芥(XP002882231.1)和雪里红(AAS45435.1)的氨基酸序列相似性分别达到69％、68％和68％.亚细胞定位结果表明,McSAMDC定位在细胞质中.荧光定量结果表明,McSAMDC在果实膨大期表达量最高,并随之迅速下降,并从成熟初期至完全成熟期该基因表达量逐渐增大.     

金花茶体细胞胚胎Cn-SERK基因的克隆及其生物信息学分析

以金花茶体细胞胚胎为材料,采用RT-PCR和RACE技术,获得了含有完整开放阅读框的金花茶Cn-SERK基因cDNA全长序列和DNA全长序列。Cn-SERK基因编码1个含有624个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析显示该蛋白质为亲水、且具有信号肽的跨膜蛋白,定位于内质网的可能性最高。二级结构主要有α螺旋和无规则卷曲构成,存在1个蛋白激酶位点。此蛋白可能发生磷酸化的位点有25个。内含子分析结果表明,Cn-SERK基因由11个外显子和10个内含子组成,内含子的剪切位点符合真核生物GT-AG规则。系统进化树分析结果