中华绒螯蟹RXR基因全长cDNA克隆及表达分析

维甲类X受体(retinoid X receptor,RXR),属于核受体超家族(nuclear receptor super family)成员,是一种重要的调控因子,对甲壳动物生长发育和繁殖具有十分重要的作用。本研究根据陆地蟹 RXR基因保守区序列设计上下游引物,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)以及cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)RXR基因并进行各组织间的表达分析。序列分析表明中华绒螯蟹RXR cDNA全长1517bp,编码433个氨基酸。经BLASTn和BLASTx分析表明,中华绒螯蟹RXR氨基酸序列与陆地蟹RXR基因的氨基酸序列相似性最高,为96%。系统进化树分析显示,中华绒螯蟹RXR的氨基酸序列与陆地蟹RXR聚为一支。荧光定量PCR结果显示,RXR在所有检测的组织中均有表达,且在中华绒螯蟹Y器官中表达量最高,肝胰腺、鳃和肌肉中有少量表达,心脏、胃、肠、胸神经节和脑神经节中微量表达。在中华绒螯蟹不同蜕皮时期中,Y器官中RXR表达量在D期最高,与AB期、C期呈显著性差异（P＜0.05）;肌肉中RXR在AB期表达量最高,与其他蜕皮时期呈显著性差异（P＜0.05）;肝胰腺和鳃中RXR在AB期表达量最高,E期表达量最低,但各蜕皮时期表达量之间差异不显著。     

中华绒螯蟹高血糖激素基因的克隆和分子结构解析

为深入研究中华绒螯蟹（Eriocheir sinensis）高血糖激素（Crustacean Hyperglycemic Hormone, CHH）基因的结构与功能,我们首次从中华绒螯蟹眼柄中克隆得到高血糖激素基因的全长cDNA序列（Ers-CHH, GenBank 注册号：JX485664）。序列及分子结构分析结果显示：Ers-CHH基因全长585bp,ORF区为 453bp,编码150 个氨基酸,N端30个氨基酸为预测的信号肽区域,其后为42个氨基酸的前体相关肽和78 个氨基酸的成熟肽。其成熟肽区具有典型的CHH家族结构域,包括3个二硫键C7-C43、C23-C39 、C26-C52和4个α螺旋（alpha-helix）,但不具有β折叠结构（beta-sheet）。Ers-CHH成熟肽氨基酸序列与溪蟹（Ptychognathus pusillus）相比有92%的相似性;其三维结构与其它物种CHH三维结构比较结果显示,4个α螺旋所处的位置及所含氨基酸的相似性较高。与中华绒螯蟹MIH相比,CHH序列前段缺少一个螺旋,但其4个α螺旋的位置及氨基酸数目与MIH的α2-α5螺旋高度一致,空间结构也基本相同,这可能是两种激素功能部分重叠的分子基础。上述结果为进一步研究CHH在中华绒螯蟹生长发育及能量代谢过程中的调节机制和人工控制甲壳动物生长代谢提供了重要信息。     

中华绒螯蟹延伸因子EF-1δ基因全长cDNA克隆及表达

根据非洲爪蟾延伸因子-1δ(elongation factor-1δ,EF-1δ)基因的保守序列设计引物,采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)以及cDNA末端快速扩增(RACE)技术克隆出中华绒螯蟹EF-1δ基因并进行各组织间的表达分析.序列分析表明,中华绒螯蟹EF- 1δ cDNA全长933 bp,编码263个氨基酸,经BLASTN和BLASTX软件分析表明,此EF-1δ cDNA核苷酸序列与非洲爪蟾EF-1δ核苷酸序列的同源性最高,其相似性为70％;所编码的氨基酸序列与大红斑蝶EF-1δ的氨基酸序列相似性为54％.聚类分析表明,中华绒螯蟹EF-1δ的氨基酸序列与鱼虱EF-1δ聚为一支.荧光定量PCR结果显示,EF-1δ在正常成熟中华绒螯蟹肌肉中表达量最高,精巢、肝胰腺中有少量表达,心脏、卵巢、胃、肠、鳃中有微量表达.不同发育状态的中华绒螯蟹EF-1δ在肌肉组织中表达量均显著高于肝胰腺和鳃组织中表达量(P＜0.05);3个不同发育状态蟹EF-1δ在肌肉中的表达量也呈显著性差异(P＜0.05),在早熟蟹肌肉中表达量最高,正常成熟蟹肌肉中次之,幼蟹肌肉中最低;不同发育状态蟹EF-1δ在肝胰腺和鳃组织中的表达没有显著差异(P＞0.05).     

中华绒螯蟹蜕皮激素受体基因（Ers-EcR）的克隆和组织表达分析

蜕皮激素受体(ecdysteroid receptor,EcR)介导调控甲壳动物蜕皮生长、附肢再生等重要生命活动。为了解EcR在人工控制甲壳动物的繁殖和生长中的作用,采用RACE方法结合同源克隆技术,首次从中华绒螯蟹Y-器官中克隆得到蜕皮激素受体基因全长cDNA序列(Ers-EcR,登录号:KF736985),并进行了结构解析和组织表达分析。结果发现,Ers-EcR编码基因全长2 176 bp,开放阅读框为1 638 bp,编码545个氨基酸,具有DNA结合域(DBD)和配体结合域(LBD)等典型的核受体超家族结构域,但不具有信号肽结构。其中,DBD含有8个保守的Cys残基,可以形成2个锌指结构(C156-C159-C173-C176、C192-C198-C208-C211),是典型的DBD特征。多重序列比对分析表明,Ers-EcR氨基酸序列与拳手招潮蟹同源性最高,达到91%。荧光定量PCR结果显示成体中华绒螯蟹ErsEcR基因在Y-器官和肌肉组织中表达量最高,在血液、肠道、卵巢、眼柄、心脏和肝胰腺中有一定表达,在鳃、胸神经节和精巢表达量较低。这表明Ers-EcR基因在中华绒螯蟹各组织器官中的表达不具有典型的特异性,提示Ers-EcR基因可能参与体内多种生命活动的调控。     

伊乐藻对中华绒螯蟹生长和营养品质的影响

本研究分析了有伊乐藻(Elodea nuttallii)组和对照组(无伊乐藻)中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)在生长、肌肉氨基酸和脂肪酸组成等方面的差异,探讨伊乐藻对中华绒螯蟹生长和营养品质的影响。结果显示,有伊乐藻组中华绒螯蟹体重、壳长和壳宽增长率与肥满度均显著高于无伊乐藻组(P0.05),但肝胰腺指数和性腺指数差异不显著(P0.05)。伊乐藻组中华绒螯蟹肌肉的氨基酸总量、必需氨基酸和鲜味氨基酸含量均显著高于无伊乐藻组(P0.05);伊乐藻组的雌蟹肝胰腺中的鲜味氨基酸含量也显著高于无伊乐藻组(P0.05),而伊乐藻组和无伊乐藻组的雄蟹肝胰腺氨基酸含量差异不显著(P0.05)。伊乐藻组和无伊乐藻组的中华绒螯蟹肌肉脂肪酸组成和含量差异不显著(P0.05),但伊乐藻组中华绒螯蟹的肝胰腺饱和脂肪酸(SFA)、单不饱和脂肪酸(MUFA)和多不饱和脂肪酸(PUFA)含量均显著高于无伊乐藻组(P0.05)。综上所述,伊乐藻不仅有利于中华绒螯蟹的生长,而且能改善中华绒螯蟹的营养品质。     

中华绒螯蟹细胞色素CYP2基因的克隆与表达分析

为研究细胞色素CYP2基因在中华绒螯蟹蜕皮及生长发育中的作用,本试验通过逆转录聚合酶链式RT-PCR反应以及cDNA末端快速扩增RACE技术获得了中华绒螯蟹CYP2基因cDNA全长。用实时荧光定量PCR技术,分析该基因在中华绒螯蟹蜕皮过程中各组织的相对表达量。试验结果显示,中华绒螯蟹CYP2的cDNA全长1772bp,编码491个氨基酸序列,包括一个84bp的5′端非编码区,一个212bp的3′端非编码区、一个1475bp的开放阅读框,经BLAST比对,该核苷酸序列与岸蟹、三疣梭子蟹的相似性分别为66%、64%。实时荧光定量PCR结果显示,中华绒螯蟹蜕皮前,CYP2基因在鳃中的表达量相对最高;在肝胰脏、肌肉中表达量略低于鳃;在Y器官、眼柄、胸神经节、脑神经节、肠中少量表达;在心和胃中表达量最低。中华绒螯蟹在不同的蜕皮时期中,通过荧光定量试验得出,肝胰脏中CYP2基因表达量在蜕皮前期和蜕皮期最高;眼柄中CYP2基因表达量从蜕皮期到蜕皮后期有上升趋势;鳃中CYP2基因表达量在蜕皮前期最高;Y器官、脑神经节和肠中CYP2基因表达量在蜕皮期最高;肌肉中CYP2基因表达量在蜕皮前期最高;胸神经节和胃中CYP2基因表达量在蜕皮后期最高;Y器官中CYP2基因在蜕皮前期表达量高于蜕皮后期和蜕皮期。以上试验结果表明,CYP2对中华绒螯蟹蜕皮生长中的调控可能起到重要作用。     

中华绒螯蟹脂肪酸延长酶(ELOVL)基因全长cDNA 的克隆及其表达分析

根据脂肪酸延长酶保守区序列设计引物,采用RT-PCR和RACE技术首次克隆得到中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)脂肪酸延长酶(ELOVL)基因全长(Gen Bank登录号:KR005628)。分析ELOVL序列表明,该基因c DNA全长2089 bp,开放阅读框(ORF)长1065 bp(包含终止密码子),编码的354个氨基酸具有典型的延长酶特征:1个高度保守的氧化还原中心组氨酸簇HVIHH,多个保守区和多个跨膜区(KFTEFLDT、NTFVHIVMYVYY、TNFQMI)。经氨基酸同源性和系统发育树分析,中华绒螯蟹ELOVL预测氨基酸序列与顶切叶蚁(Acromyrmex echinatior)ELOVL氨基酸序列相似性最高,为59%;同时与家蝇(Musca domestica)聚为一支,进而与日本囊对虾(Marsupenaeus japonicus)等聚为一大支。通过实时荧光定量PCR技术研究ELOVL m RNA在中华绒螯蟹不同组织中的表达量,及投喂不同配合饲料后在可食部位组织中的表达情况。结果显示,ELOVL在各组织中均有表达,在肝胰腺和肠道中表达量最高,心脏中最低,其他组织中少量表达。养殖98 d后分析表明,卵巢和肝胰腺组织中ELOVL m RNA在SO饲料组中表达量最高,并且表达水平随着饲料中鱼油(富含n-3 PUFA)比例减少、豆油(缺少n-3 PUFA)比例增加而显著升高(P0.05);精巢组织中ELOVL m KNA表达量在SO饲料组中最高;肌肉组织中ELOVL m KNA表达水平较低,且各饲料组间表达量差异不显著(P0.05)。以上结果表明,中华绒螯蟹存在ELOVL基因,并且ELOVL的表达受饲料脂肪水平的影响,这为探究中华绒螯蟹自身合成HUFA途径及调节机制奠定了基础。     

中华绒螯蟹Scarb1基因功能及其与生长性状的关联分析

为研究B类Ⅰ型清道夫受体(SCARB1/SR-BI)在中华绒螯蟹代谢、生长以及免疫等生物学过程中的分子功能，实验对中华绒螯蟹Scarb1的克隆及时空表达进行了分析，观察了RNA干扰该基因后的相关组织结构和类胡萝卜素含量变化，筛选了该基因的SNP标记并与生长相关性状进行关联分析。结果显示，中华绒螯蟹的Scarb1由2个外显子和1个内含子组成，开放阅读框为2 415 bp，编码805个氨基酸；系统进化分析显示中华绒螯蟹与三疣梭子蟹的氨基酸同源性高达80.51%，具有较高的物种间保守性。该基因在不同蜕壳时期的肝胰腺、肠道、血淋巴细胞、心脏、鳃和肌肉组织中均有表达，但在肝胰腺、肠道和血淋巴细胞中的表达量相对较高。RNA干扰Scarb1后，组织切片观察发现肝胰腺的肝小管管腔模糊并产生了部分空泡化结构，肠道内膜的肌肉层和黏膜下层处出现显著空洞现象；肝胰腺的颜色由黄色变成灰白色，其中的类胡萝卜素含量显著下降。在该基因的第一外显子筛选到1个SNP位点(C432T)与蜕壳后体重和壳长增长率存在显著相关性。本研究结果为Scarb1在中华绒螯蟹的遗传研究和育种应用提供参考。     

中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1(Ers-MIH1)-GST融合蛋白在大肠杆菌中的表达

蜕皮抑制激素(molt—inhibiting hormone，MIH)属甲壳动物高血糖激素(crustacean hyperglycemic hormone，CHH)家族。MIH抑制Y-器官蜕皮激素的合成。以中华绒螯蟹(Eriocheir japonica sinensis)眼柄总RNA为模板，根据中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1(Eriocheir japonica sinensis molt—inhibiting hormone-1，Ers—MIH1)基因序列设计引物，用RT—PCR的方法获得了Ers—MIH1基因成熟肽的cDNA片段。序列分析表明，Ers—MIH1基因成熟肽编码区含有228bp，编码75个氨基酸残基，与已发表的序列一致。将该cDNA片段插入到中间载体pMD18-T中，酶切后再将该片段插入到pGEX-4T-1表达载体中，构建成表达质粒pGEX-4T—MIH1。在BL21细胞中经IPTG诱导表达，得到GST—MIH1的融合蛋白。SDS—PAGE分析表明，经0．1mmol／L IPTG诱导4h，发现大量GST—MIH1融合蛋白表达，在分子量(Mr)为34kD处有1条特异的蛋白质条带。中华绒螯蟹蜕皮抑制激素1融合蛋白的成功表达为进一步深入研究MIH在中华绒螯蟹蜕皮过程中的作用机制奠定了基础。     

中华绒螯蟹4E-BP1基因的克隆、表达特征及其在蜕壳中的作用

真核翻译起始因子 4E 结合蛋白 1 (4E-BP1)是 mTOR 信号通路下游的翻译抑制因子, 调节翻译的起始和蛋白质的合成。为探究中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis) 4E-BP1 基因特征、时空表达模式及其在蜕壳过程中的潜在作用, 本研究利用 RACE 技术克隆获得中华绒螯蟹 Es4E-BP1 全长 cDNA 序列, 利用 qPCR 技术探究其时空表达, 利用 dsRNA 干扰探究其在中华绒螯蟹蜕壳中的作用。测序结果显示, Es4E-BP1 cDNA 全长 1678 bp, 包括 134 bp 的 5? 非编码区、1193 bp 的 3?非编码区和 351 bp 的开放阅读框。氨基酸序列分析发现, Es4E-BP1 含有 1 个 eIF4E 超级家族的典型保守域, 且包含 1 个超二级结构 TOS 基序和 1 个 YXXXXLΦ 基序。多序列比对和系统进化树分析显示, Es4E-BP1 与蓝蟹(Callinectes sapidus)、三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)聚为一支并且具有很高的同源性 (95.69%和 93.16%)。qPCR 结果显示, Es4E-BP1 在成蟹各个组织均有表达, 其中 Y 器官表达量最高, 其次为肌肉, 鳃丝中表达量最低。一个完整蜕壳周期内, 幼蟹不同组织表达模式不同, 但均在蜕壳后期 A-B 期表达量最高, 蜕壳前期表达量较低。注射 dsEs4E-BP1 后, 中华绒螯蟹存活率远低于对照组 CG 组; 蜕壳间隔显著高于 CG 组。研究结果表明, Es4E-BP1 在中华绒螯蟹各组织中广泛表达, 在调控蜕壳生长中具有重要作用, 为进一步研究甲壳动物 4E-BP1 基因提供了重要参考。     

A chimeric recombinant crustacean hyperglycemic hormone from Litopenaeus schmitti (Burkenroad) obtained as C‐terminus fusion protein boost hemolymph glucose concentration in Litopenaeus vannamei (Boone)

To date, no hormonal treatments are available for control of shrimp reproduction and only eyestalk ablation is of practical use. The crustacean hyperglycemic hormone (CHH) is the most abundant neuropeptide of the eyestalk CHH family. It plays an important role in the regulation of hemolymph glucose levels, as its principal function, but it is also implicated in additional physiological processes such as moulting and reproduction. In the present study, the cDNA encoding Litopenaeus schmitti (Burkenroad) mature CHH was cloned into the Escherichia coli pTYB2 expression vector. Using this strategy we have obtained, for the first time, the recombinant CHH from L. schmitti with its C‐terminus fused to an intein tag. The expected fused protein of about 63 KDa was expressed in E. coli forming inclusion bodies. It was purified in a soluble form by electroelution following molecular size fractionation in sodium dodecil sulphate polyacrylamide gel electrophoresis. The ability of the chimeric CHH protein to elevate glucose levels in the hemolymph of the eyestalk‐ablated Litopenaeus vannamei (Boone) shrimps indicates that its biological activity as hyperglycemic protein is preserved. The results provide an alternative tool to obtain soluble recombinant proteins from the CHH family of neuropeptides to get a better understanding of shrimp endocrinology.     

中华绒螯蟹Akt基因的cDNA克隆、序列分析及表达特征

为研究Akt基因在中华绒螯蟹蜕壳前后肌肉生长过程中的功能,应用RACE技术克隆得到编码中华绒螯蟹Akt(命名为Es Akt)的全长为2 200 bp的c DNA序列,包括159 bp的5′非翻译区(5′-UTR)、496 bp的3′非翻译区(3′-UTR)和长度为1545 bp编码514个氨基酸的编码序列。蛋白质结构域分析显示Es Akt含有丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶家族的3个特征性保守结构域。多序列比对和系统发育分析显示,Es Akt与中国明对虾、凡纳滨对虾的Akt序列一致性都为0.889,在系统发育树中节肢动物Akt形成一个分支。应用荧光定量RTPCR技术分析Es Akt在性成熟中华绒螯蟹各组织及幼体不同蜕壳时期不同部位肌肉组织中转录水平上表达量的变化。结果显示,Es Akt在性成熟个体的肝胰腺、眼柄、表皮、卵巢、精巢、心脏、螯足、鳃、三角膜等组织中均有表达,其中卵巢、眼柄和精巢中表达量较高,肝胰腺中表达量最低。在幼体不同蜕壳时期不同部位的肌肉中,Es Akt表达量变化不同,步行足肌肉组织中Es Akt m RNA无显著的统计学差异。腹部肌肉组织中Es Akt m RNA水平在蜕壳前晚期D3~D4期表达量显著高于蜕壳后A~B期和蜕皮间期C期。螯足肌肉在蜕壳前晚期D3~D4期急剧下调,蜕壳后A~B期开始表达量显著升高,直至蜕皮间期C期。研究表明,Es Akt在中华绒螯蟹蜕壳过程中不同部位肌肉组织中的表达量变化与蜕壳周期密切相关,说明Es Akt参与中华绒螯蟹蜕壳诱导的肌肉萎缩、生长及重建过程。     

Isolation and characterization of an additional crustacean hyperglycemic hormone from the greasyback shrimp <Emphasis Type="Italic">Metapenaeus ensis</Emphasis>

Crustacean hyperglycemic hormone (CHH) is released from the X-organ/sinus gland complex located in the eyestalks. In this study, the most abundant CHH in the sinus gland of the greasyback shrimp Metapenaeus ensis was purified by reversed-phase HPLC and identified by N-terminal amino acid sequencing. Although two CHH molecules (Mee-CHH-A and Mee-CHH-B) have already been identified from M. ensis by cDNA cloning, this study revealed the presence of an additional CHH peptide based on differences in the N-terminal amino acid sequences of the CHH-A and CHH-B. Therefore, this novel CHH was designated as Mee-CHH-C. A cDNA encoding the Mee-CHH-C precursor was cloned by RT-PCR coupled with 5′- and 3′-RACE, and it was found that the mature Mee-CHH-C consisted of 72 amino acid residues containing 6 conserved cysteine residues and possessed an amidated C terminus. Mee-CHH-C had 62 and 68% identities with Mee-CHH-A and Mee-CHH-B, respectively, and was highly homologous to CHHs characterized from other penaeid shrimp species. The hyperglycemic activity of Mee-CHH-C was examined by an in vivo bioassay using the kuruma prawn Marsupenaeus japonicus. Injection of Mee-CHH-C increased hemolymph glucose levels significantly and dose-dependently. These results indicate that Mee-CHH-C is possibly one of the major molecules in M. ensis that regulate glucose levels in the hemolymph.     

饲料中Pb和Cd在中华绒螯蟹体内的吸收与释放特性

为获知饲料中重金属与中华绒螫蟹各组织间的富集与释放特性,应用生物富集双箱动力学模型,模拟中华绒螫蟹分别在Pb含量为10.21、22.01、40.81 mg/kg,Cd含量为1.78、2.80、4.48 mg/kg的饲料驯养过程中,其鳃、肝胰腺和肌肉对Pb和Cd的生物富集与释放特性,为Pb与Cd在中华绒螫蟹体内的分布、富集和迁移提供理论依据,为中华绒螫蟹安全生产提供指导。同时通过非线性拟合得到中华绒螫蟹对饲料中Pb和Cd的富集速率常数k_1、排出速率常数k_2、生物富集系数BCF、生物半衰期B_(1/2),富集平衡时生物体内Pb和Cd含量CAmax等动力学参数。结果显示:①中华绒螫蟹对饲料中的Pb和Cd具有明显的富集,蟹鳃、肝胰腺和肌肉中Pb的含量与富集时间和饲料中Pb的添加量表现出了很好的正相关,在富集的第48天,各组织器官中Pb的含量达到最大,在鳃中的含量分别为0.18、1.14、1.27和1.91 mg/kg;肝胰腺中含量分别为1.00、2.17、2.33和3.50 mg/kg;肌肉中含量分别为0.18、0.73、1.00和1.35 mg/kg。鳃和肝胰腺对饲料中Cd的吸收与Pb情况类似,在富集的第48天,4个饲料组蟹鳃中的浓度值均达到最高,分别为0.026、0.073、0.107和0.154mg/kg;肝胰腺除了在C组实验的第24天含量达到最高,为1.90mg/kg外,其他3组实验,在富集的第48天含量达到最高分别为0.33、1.05和1.24 mg/kg,C组在第48天的含量有所降低,为1.76 mg/kg。但是肌肉中Cd含量没有明显的规律。②中华绒螫蟹对Pb和Cd的生物富集和释放都较缓慢。达到平衡状态时,鳃、肝胰腺、肌肉各组织器官中Pb含量分别为1.07~1.69、4.87~4.95、0.79~1.28 mg/kg,鳃、肝胰腺中Cd含量分别为0.06~0.14和1.25~2.66 mg/kg。Pb和Cd在组织器官中的生物富集系数(BCF)范围分别为0.03~0.48和0.03~0.87,中华绒螫蟹对Cd的富集能力明显高于Pb;Pb和Cd在各组织器官的生物学半衰期(B_(1/2))范围分别为9~67 d和8~48 d。中华绒螫蟹对Pb的排除能力明显低于Cd。③Pb和Cd在中华绒螫蟹组织器官中的富集具有选择性,在经不同含量Pb和Cd的饲料驯养后得到统一含量分布规律:肝胰腺鳃肌肉。     

中华绒螯蟹ELOVL6 cDNA全长克隆及其表达分析

为了探究中华绒螯蟹自身脂肪酸合成能力,采用RACE技术,克隆获得中华绒螯蟹ELOVL6 c DNA序列全长(Gen Bank accession:KT779219)。该序列全长2247 bp,包括235、873和1139 bp的5'非编码区(5'-UTR)、开放阅读框(ORF)和3'非编码区(3'-UTR),编码290个氨基酸(AA),具有ELOVL家族的全部特征:6个跨膜区、高度保守的组氨酸簇HXXHH、多个保守区以及内质网滞留信号KXKXX。分析发育树表明,ELOVL2与ELOVL5聚为一支,ELOVL6聚为另一支,其中中华绒螯蟹ELOVL6与其他节肢动物ELOVL6聚为一支,与凡纳滨对虾聚为一小支。采用异源表达方法研究ELOVL6编码的蛋白质对脂肪酸的作用,GC-MS结果显示,转基因的酵母培养物C16:0和C16:1n-7含量下降,而C18:0和C18:1n-9的含量升高,同时有新产物C18:1n-7产生。通过荧光定量PCR(q PCR)技术研究ELOVL6基因在中华绒螯蟹不同组织及不同脂肪源喂养下的表达情况,显示该基因在肠道、胃、心脏、肝胰腺、胸神经节、肌肉、眼柄、鳃和脑神经节9个组织均有表达,其中在肝胰腺中表达量最高,显著高于其他组织;在不同脂肪源饲喂的结果中,肝胰腺、肌肉、卵巢和精巢4个组织中均有表达,并且各组织在全鱼油组饲喂下表达量最低,其中用全豆油组饲喂后,肝胰腺中的表达情况显著升高,明显高于全鱼油组和鱼油豆油混合组。以上结果综合表明,中华绒螯蟹中ELOVL6能够催化C16的饱和及C16的单不饱和脂肪酸延长,同时受到饲料中不同脂肪源的一定影响,这为探究中华绒螯蟹PUFA合成途径及脂肪酸调控机制提供了依据。     

Effect of recombinant crustacean hyperglycemic hormones rCHH‐B1 and rCHH‐B2 on lipid metabolism in the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei

The crustacean hyperglycemic hormones (CHH) are pleiotropic neuropeptides controlling diverse processes in the life cycle of crustaceans. In the Pacific white shrimp Litopenaeus vannamei, CHH‐B1 and CHH‐B2 are generated by alternative splicing of the same gene, and the recombinant versions of these peptides have shown differential effects on glucose metabolism and osmoregulation in this species. In this work, we explored the role of both recombinant variants, expressed in yeast Pichia pastoris, on lipid metabolism. The results showed that rCHH‐B1 and rCHH‐B2 injections into eyestalk‐ablated shrimp significantly increased the phospholipid and triglyceride levels in haemolymph and restored free fatty acid levels, suggesting that these CHH variants mobilize lipid reserves in shrimp. The effects on lipids were concomitant to its hyperglycemic activity, suggesting that both variants, in addition to their hyperglycemic activity, have hyperlipidemic functions.     

日本沼虾C型凝集素结构域家族3的cDNA克隆、原核表达和定位分析

C型凝集素(C-type lectin)是一类能与糖类结合的非抗体的蛋白质或糖蛋白家族,为了研究C型凝集素基因在日本沼虾组织分布、细胞定位和细菌感染过程中的表达情况,本研究应用cDNA末端快速克隆(rapid-amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了日本沼虾C型凝集素结构域家族3基因(MnLec3)的全长序列,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)分析MnLec3基因在不同组织、细菌感染后不同时间的表达水平,Western blot和免疫荧光分别分析蛋白的表达水平和细胞定位。结果显示,MnLec3基因cDNA全长1 357 bp,包括125 bp的5′末端非翻译区(UTR)、1 026 bp的开放阅读框(ORF)和206 bp的3′UTR,其中开放阅读框编码341个氨基酸。氨基酸序列比对显示,日本沼虾MnLec3基因含有保守钙结合点(Met 1-Glu17)和糖识别结构域(CRD)。同源性分析结果显示,MnLec3与罗氏沼虾C型凝集素3相似度较高;邻接法(Neighbor-Joining,NJ)进化树分析结果显示,MnLec3与其他甲壳动物C型凝集素聚为一支。通过构建原核表达载体获得体外重组蛋白rMnLec3,并将纯化重组蛋白免疫大鼠获得抗血清,免疫荧光结果显示,绿色荧光信号主要在肝胰腺细胞核中表达。qRT-PCR结果显示,MnLec3在日本沼虾所检测组织中均表达,其中肝胰腺中表达量最高,血细胞次之;与对照组相比,在嗜水气单胞菌刺激12～48 h时MnLec3表达量显著升高,48 h表达量最高,Western blot分析结果显示,MnLec3蛋白表达丰度与基因表达模式基本相似,提示克隆得到的MnLec3参与日本沼虾抵御细菌入侵的免疫过程。