香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种菌株侵染和定殖巴西蕉和粉蕉根系的观察

尖孢镰刀菌古巴专化型1号和4号生理小种菌株对巴西蕉和粉蕉的致病性不同,其在巴西蕉和粉蕉根系的侵染和定殖过程是否不同仍未阐明。笔者将绿色荧光蛋白标记的1号（T320）和4号（B2-63）生理小种菌株分别接种巴西蕉和粉蕉,借助激光共聚焦显微镜观察侵染过程。发现这2个生理小种菌株菌丝均可沿巴西蕉和粉蕉根系表层细胞之间的凹槽生长,并进一步侵入维管束;而且B2-63侵入粉蕉根系维管束快于其侵入巴西蕉根系维管束。在接种T320 菌株15 d后,在轻微褐变的巴西蕉球茎组织中未观察到其菌丝体,而在褐变粉蕉球茎中可观察到。推测T320在粉蕉根系维管束中的扩展较其在巴西蕉根系维管束中的扩展容易。结果为进一步研究尖孢镰刀菌古巴专化型生理小种与不同基因型香蕉的互作奠定基础。     

香蕉枯萎病菌分子检测研究进展

香蕉枯萎病是全世界香蕉产业共同面临的毁灭性病害,但目前生产上仍缺乏适宜的抗病品种和有效的治疗措施。因此,借助快速准确的枯萎病菌检测技术及时明确病原菌以控制该病的传播和蔓延显得尤为重要。本文回顾了近年来国内外香蕉枯萎病菌分子检测技术的发展历程,归纳和总结了DNA指纹图谱、普通PCR、多重PCR、荧光定量PCR及等温扩增技术在该病菌检测中的研究进展,分析了不同检测技术的优缺点,并指出可能存在的问题和研究发展方向,为该病的分子检测技术优化和防控策略制定提供参考。     

香蕉枯萎病菌4号生理小种cat1基因敲除与表型分析

前期蛋白质组学研究发现尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种(Foc4)中的过氧化氢酶1(cat1)基因受到巴西蕉诱导上调表达,为研究cat1基因在Foc4侵染香蕉过程中的作用,利用同源重组方法敲除Foc4的cat1基因,并对获得的敲除突变体开展表型分析和致病性测定。结果表明:cat1基因缺失对Foc4的菌丝、孢子形态、菌落生长、抗渗透压胁迫和细胞壁选择性压力等没有影响;但引起菌株抵抗外源氧胁迫、细胞壁穿透能力、纤维素利用能力减弱和对巴西蕉的致病性减弱。显示cat1基因的产物通过清除香蕉分泌的活性氧在Foc4对香蕉的致病过程中起作用,并参与病原菌对寄主纤维素成分的代谢。此结果为进一步深入研究香蕉枯萎病菌的致病机理奠定基础。     

3种碳源条件下香蕉枯萎病菌次生代谢物合成基因的表达谱分析

在前期获得的香蕉枯萎病菌（Fusarium oxysporum f. sp. cubense, Foc）转录组数据基础上,本研究利用antiSMASH、PHI-base数据库对3种碳源条件下香蕉枯萎病1号小种（Foc 1）和4号小种（Foc 4）表达的次生代谢物合成基因进行了预测和表达谱分析。结果表明：3种碳源条件下,Foc共有486个候选的次生代谢物合成基因表达,并分类到32个次生代谢产物合成基因簇,其中13个基因可能与Foc的致病性相关。此外,Foc在3种碳源条件下次生代谢物合成基因的表达模式存在明显差异,特别是在寄主细胞壁条件下Foc差异表达的次生代谢物合成基因最多;而且Foc 4相较于Foc 1在侵染寄主细胞壁时有更多的次生代谢物合成基因特异表达或高表达。以上研究结果将为进一步明确次生代谢产物在Foc致病过程中的作用机理提供理论依据。     

香蕉枯萎病菌esyn1基因的克隆与序列分析

采用RT-PCR方法扩增了香蕉枯萎病菌恩镰孢菌素合成酶基因esyn1的cDNA片段,测序结果表明,esyn1基因核苷酸序列阅读框架全长546 bp。核苷酸序列分析显示该基因片段编码181个氨基酸,推测分子量为19.9 ku,等电点为5.06。氨基酸序列比对结果表明,它与半裸镰刀菌、层出镰刀菌、拟枝孢镰刀菌esyn1基因的氨基酸序列的相似性分别为96%、94%、77%。     

香蕉枯萎病菌cyp1基因的克隆与序列分析

为了解亲环素基因(cyp1,其编码亲和蛋白)在尖孢镰刀菌古巴专化型生理小种1号和生理小种4号之间及与其他镰刀菌之间的差异,分析cyp1基因与两生理小种之间的寄主选择性差异的关系,通过比对现有镰刀菌属的亲环素基因序列,设计并合成引物,采用PCR和RT-PCR方法扩增了尖孢镰刀菌古巴专化型生理小种1号和生理小种4号2个生理小种的cyp1基因,并测序进行比较分析,同时对编码蛋白进行了氨基酸序列比对和功能分析。结果表明,2个生理小种cyp1基因全长均为1066bp,开放阅读框均为675bp,编码224个氨基酸,基因序列间差异性为0.8%,编码蛋白间仅存在1个氨基酸的差异;两生理小种的cyp1基因序列与镰刀菌属其他专化型或不同种间存在差异性,与不同属之间其他种间的差异最大达50%,比对蛋白序列发现仅存在0.85%的差异,这进一步证明亲和蛋白在真菌中较保守。从cyp1基因序列及其编码蛋白的氨基酸序列在两生理小种之间的差异性分析结果推测,2个生理小种寄主选择性差异与cyp1基因并无明显对应关系,这为进一步研究cyp1基因功能奠定了基础。     

尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种红色荧光蛋白基因转化

采用PEG-CaCl2介导的原生质体转化体系,成功地将红色荧光蛋白基因DsRed转入到尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种B2菌株中。在显微镜下观察连续转接6代的转化子,结果都可以观察到很强的红色荧光,表明DsRed基因在转化的B2菌株中能稳定遗传。通过PCR验证,也表明红色荧光蛋白基因DsRed已经转入到尖孢镰刀菌中。对香蕉的致病力测定结果表明,转化子与野生型菌株B2相比没有明显差异。     

香蕉枯萎病菌pgx4基因的克隆与序列分析

为了解pgx4基因在尖孢镰刀菌古巴专化型侵染香蕉过程中的作用,及其与尖孢镰刀菌古巴专化型生理小种1号和生理小种4号之间的致病力差异的关系,以尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种和4号生理小种的基因组DNA和cDNA为材料,采用PCR和RT-PCR方法扩增了2个生理小种的pgx4基因,并对扩增产物进行克隆测序后再用生物信息学软件对序列进行比对分析.结果表明:2个生理小种pgx4基因的开放阅读框均为1 395 bp,编码465个氨基酸,且前17个氨基酸均构成该基因的信号肽.通过DNAStar 7.1比对发现,尖孢镰刀菌古巴专化型2个生理小种pgx4基因的核苷酸序列存在25个碱基的差异,而其编码的465个氨基酸中,也有3个氨基酸不同,分析这些核苷酸序列和氨基酸序列的差异可能与尖孢镰刀菌古巴专化型1号生理小种和4号生理小种在侵染蕉类不同栽培种时的识别专性寄主机制有一定关系.     

香蕉枯萎病菌假定G蛋白偶联受体基因Fogpr1的功能分析

为了研究尖孢镰刀菌古巴专化型假定G蛋白偶联受体基因fogpr1的功能,构建了fogpr1基因敲除突变体。与野生型相比,fogpr1基因敲除突变体在菌丝生长、产孢量和菌落形态等方面没有明显变化,对巴西蕉的致病性也没有降低。此外,酵母双杂交实验结果表明,Fogpr1可以与G蛋白Fga1、Fga2和Fgb1互作。这些结果表明Fogpr1可能是一个G蛋白偶联受体,但不参与调控尖孢镰刀菌的发育和致病性。     

香蕉枯萎病菌假定分泌蛋白SP10的功能分析

为了研究尖孢镰刀菌古巴专化型假定分泌蛋白基因SP10的在致病过程的作用,构建SP10基因敲除菌株,分析SP10敲除菌株的表型特征。结果表明:SP10基因敲除菌株在菌丝生长、产孢和菌落形态等方面无明显变化,但SP10基因敲除菌株对巴西蕉的致病性减弱;在接种30 d后,采用共聚焦显微镜显微观察香蕉根系,结果显示,SP10基因敲除菌株可在根系维管束中定殖。上述结果表明,假定的分泌蛋白SP10参与调控尖孢镰刀菌对香蕉的致病性,但不参与该病原菌生长和发育的调控。此结果为进一步研究尖孢镰刀菌分泌蛋白的功能奠定了基础。     

香蕉枯萎病菌1号生理小种遗传转化体系的建立

利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化方法,建立香蕉枯萎病菌1号生理小种(Fusariumoxysporum f.sp cubense race 1)遗传转化体系,并对影响转化效率的因子进行优化,明确了高效转化的条件为:农杆菌OD600为0.15,AS诱导浓度为150μmol/L,诱导时间为7 h,Focr1-N2孢子浓度为1×106个/mL,潮霉素B筛选的浓度为150μg/mL,诱导培养基pH值为5.5,共培养温度为25℃,共培养时间为48 h为最佳条件。构建了包含1 200个突变体的突变体库,并对1 200个突变体进行了致病性测定,初步筛选出致病性丧失突变体20个,致病性显著减弱突变体18个,致病性严重增强突变体53个。     

香蕉枯萎病菌2个生理小种MAPK基因的克隆及序列分析

为了解香蕉枯萎病菌(Fusarium oxysporum f.sp.cubense)1号生理小种(race 1)和4号生理小种(race4)丝裂原活化蛋白激酶(MAPK)基因focMK1,focMK4的序列差异,根据番茄枯萎病(Fusarium oxysporum f.sp.lycopersici)的MAPK基因相关序列设计引物,利用PCR和RT-PCR技术,分别克隆了香蕉枯萎病菌2个生理小种的基因序列和开放阅读框。结果表明,所获得的2个MAPK基因均含有3个内含子和4个外显子,2个基因序列只有一个碱基差异,编码氨基酸355个,氨基酸组成无差异;根据生物信息学软件预测编码蛋白没有信号肽,具有2个功能位点,分子量和pI分别为41ku和6.47。该基因编码的蛋白具有高度保守性,与大多数植物致病菌的同源性都在90%以上,不同病原镰刀菌间的同源性接近100%。     

香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种在几种培养基上的生长特性

测定10株分离自广东省不同香蕉种植区的香蕉枯萎病菌1号和4号生理小种在不同培养基上的形态、生长速率和产孢能力的差异。结果显示,不同生理小种菌株在PDA、Komada改良培养基、粉蕉组织浸提液培养基和香蕉组织浸提液培养基上的形态、生长速率和产孢能力等特性差异不明显,不能依据这些特性区分1号和4号生理小种;但在康乃馨叶片琼脂(Carnation leaf agar,CLA)培养基上产生的孢子形态具有明显差异,4号生理小种的菌株产生典型的尖镰刀状大孢子,孢子多6个隔,长约(36.80±5.33)～(44.93±4.80)μm,宽约(3.40±0.20)～(4.27±0.25)μm,占总孢子数的比例较大,为(40.87±9.67)%～(62.50±7.84)%,而1号生理小种个体产生的大型孢子前端钝圆,弯曲程度低,多4个隔,孢子长约(22.31±3.89)～(25.01±6.16)μm,宽约(3.42±0.23)～(3.90±0.24)μm,占总孢子数的比例很小,为(2.55±1.95)%～(4.50±1.76)%。     

香蕉枯萎病菌fga1基因的克隆与序列分析

为了解fga1基因在尖孢镰刀菌古巴专化型侵染香蕉过程中的作用,及其与尖孢镰刀菌古巴专化型生理小种1号和生理小种4号之间的致病力差异的关系,采用PCR和RT-PCR方法扩增了2个生理小种的fga1基因,并对扩增产物进行了测序及相似序列搜索和比对,还对基因编码的蛋白进行了氨基酸序列比对和功能分析.研究结果表明2个生理小种fga1基因开放阅读框均为1 062 bp,编码353个氨基酸,基因同源性为99.5%,氨基酸序列相同.推测fga1基因可能与香蕉枯萎病菌自身繁殖和附着胞的形成有关.从fga1基因序列及其编码蛋白的氨基酸序列看,2个生理小种致病力的差异与fga1基因并无明显对应关系,这为进一步研究fga1基因功能奠定了基础.     

一种简便分离香蕉枯萎病菌的选择性培养基

为探寻在非无菌操作下能从土壤中快速且大量分离检测香蕉枯萎病菌,研制了一种用于检测香蕉枯萎病病原菌的选择性培养基-PCEA,其成分为:马铃薯200 g,CuSO_4·5H_2O 0.5 g,MgSO_4·7H_2O 0.6 g,KH_2PO_4 0.1 g,敌克松结晶粉(75%)3 g,硫酸链霉素0.75 g,95%酒精10mL,水1 000mL,pH5.8,琼脂18～20g.该培养基与其它常见分离培养基相比,无需无菌操作,且成分简单、检测率显著,抑菌效果好,病菌在其上生长快、菌落典型,是一种较为理想的选择性培养基.     

香蕉枯萎病菌pacC基因的克隆与序列分析

采用PCR和RT-PCR方法扩增尖孢镰刀菌古巴专化型(Fusarium oxysporum f sp.cubense,FOC)1号和4号生理小种的pacC基因(FOC1-pacC,FOC4-pacC),对FOC1-pacC和FOC4-pacC相似序列进行搜索和比对,以及对基因编码蛋白进行结构预测,发现FOC1-pacC和FOC4-pacC开放阅读框分别为1 863、1 905 bp,编码634、620个氨基酸,2个小种之间基因序列和氨基酸序列差异明显,FOC1-pacC比FOC4-pacC缺少1个基因片段,FOC-pacC与其相似序列有显著差异,比对缺少2个基因片段;初入侵转录组表达分析说明,2生理小种pacC基因在小种侵染不同品种香蕉过程中表达有差异,FOC1-pacC基因只在粉蕉中检测到表达,而FOC4-pacC则在粉蕉和香蕉中都检测到表达,但在粉蕉中的表达量明显高于香蕉。