孔雀草试管苗叶片AP1基因的克隆及其生物信息学分析

以孔雀草试管苗叶片为材料,成功克隆了孔雀草AP1基因的cDNA全长,并对其进行了生物信息学分析。AP1基因全长919 bp(GenBank登录号为JX310277),其中5′-UTR 92bp、3′-UTR 149bp、3′端poly(A)尾巴25 bp,开放阅读框为678 bp,编码225个氨基酸。AP1-1可能存在于细胞核中,为亲水蛋白,不含信号肽,共形成4个卷曲螺旋结构;二级结构主要有α螺旋和无规则卷曲构成,存在亮氨酸拉链结构和1个MADS-box区。此蛋白可能发生磷酸化位点的位置有7个。从系统进化树分析表明,该蛋白与甘菊具有较高的亲缘关系。     

玉米ZmCPB1基因的克隆、表达及生物信息学分析

从玉米中克隆ZmCPB1基因的cDNA序列,全长1 446 bp,编码481个氨基酸,蛋白质理论分子量为54.05 KD,等电点为8.59。生物信息学分析表明,ZmCPB1蛋白N端有跨膜结构,是跨膜蛋白。蛋白质二级结构含有48.44%的α-螺旋、4.99%的β-转角、10.60%的延伸链以及35.97%的无规则卷曲,该蛋白定位于内质网中。序列比对结果显示,ZmCPB1蛋白含有与子粒发育相关的保守区VKFVHRKALK。系统进化树分析表明,该蛋白与高粱、谷子、水稻和大麦的同源蛋白亲缘关系最近,同属一个亚支。实时荧光定量PCR分析ZmCPB1基因的表达模式,结果表明,ZmCPB1基因在3叶期的根、茎、叶以及雄穗和苞叶中表达量较低,在雌穗中的表达量较高。在玉米子粒发育的不同时期,ZmCPB1基因的表达量呈现一定的规律变化,在授粉后0～10 d,表达量逐渐达到最高峰,之后开始下降,在授粉15 d后降到较低水平。初步判断ZmCPB1基因与玉米子粒早中期发育有关。     

甘蔗ScHTD2基因的克隆及生物信息学分析

D14是一类能够有效抑制水稻分蘖的水解酯酶,可能是独脚金内酯信号传导途径中的重要组分。为研究该基因在甘蔗分蘖性状中的功能,利用RT-PCR和RACE技术从甘蔗主栽品种ROC22中克隆出D14同源基因的c DNA全长,命名为Sc HTD2,并对其进行生物信息学分析。结果表明:Sc HTD2基因的c DNA全长为1 302 bp(KP137674.1),具有927 bp的开放阅读框,编码308个氨基酸;蛋白质分析表明,Sc HTD2为不稳定的水溶性非分泌蛋白,主要作用于氨基酸的生物合成或者作为生长因子调控生物生长发育。亚细胞定位于叶绿体,存在14个磷酸化位点,不存在乙酰化位点和信号肽。二级结构以α螺旋和无规则卷曲为主,还有一些残基形成β-折叠和链延伸。保守结构域和三级结构预测均表明该蛋白包含一个α保守水解酶家族,属"D14-Like"或者"DAD2-Like"蛋白家族。推测Sc HTD2可能作为独脚金内酯调控甘蔗分蘖信号转导中一个具有催化特性的水解脂酶而起作用。进化树分析表明该蛋白与高粱、玉米等单子叶植物进化关系较近。     

橡胶树胶乳HbPLDα1基因及其启动子的克隆与生物信息学分析

植物磷脂酶PLDα1与伤害信号转导密切相关,是伤害诱导内源茉莉酸（Jasmonic acid, JA）生物合成的关键酶之一。橡胶树胶乳PLDα1基因（HbPLDα1）表达的研究将有助于揭示橡胶树乳管细胞JA信号转导及其调控橡胶生物合成的机制。在EST序列的基础上,通过RACE和Genome Walking方法分别克隆了橡胶树胶乳的HbPLDα1基因及其启动子序列。HbPLDα1基因的cDNA全长为2 870 bp,包含长度为2 427 bp的完整开放阅读框（ORF）,具有典型的植物PLDα蛋白保守功能域,与同属大戟科的蓖麻和麻风树的PLDα1基因亲缘关系最近。HbPLDα1基因启动子区域长为1 559 bp,除含有TATA box和CAAT box等基本顺式作用元件外,还存在JA和脱落酸等激素响应元件以及干旱胁迫等环境信号响应元件,这表明HbPLDα1基因的表达可能受激素和环境信号的调控,在橡胶树乳管细胞对激素和环境信号的响应过程中发挥重要作用。     

甘蔗HD-Zip Ⅰ亚家族转录因子基因ScGT1的克隆和生物信息学分析

Grassy Tiller1(GT1)属于植物HD-Zip Ⅰ亚家族转录因子,通过抑制侧芽萌动和侧枝伸长调控植物分蘖性状。本研究使用RT-PCR和RACE技术从甘蔗品种ROC22中克隆出甘蔗GT1同源基因ScGT1 (MK318528)。生物信息学分析发现该基因cDNA序列包含一个长度为723 bp的开放阅读框,可编码一个含240个氨基酸的蛋白。该蛋白具有一个Homeodomain保守结构域,分子量为26.44kD,理化等电点pI为6.04,属于亲水蛋白,无跨膜结构,不存在信号肽,可能定位于细胞核,参与氨基酸生物合成的可能性较高。蛋白结构及同源性分析表明该蛋白空间结构与高粱和玉米较为相似,Homeodomain结构域高度保守,变异较少。系统发育树分析表明该蛋白属于HD-Zip I亚家族中的gt1 Clade类群,与高粱和玉米GT1亲缘关系较近,初步推测ScGT1可能通过腋芽分生组织发育的调控来影响分蘖表现。该研究可为后续该基因更深入的功能鉴定和分子辅助育种奠定重要的前期基础。     

甘蔗花穗ScRS31基因的克隆与初步表达分析

应用RT-PCR法从甘蔗（Saccharum L.）花穗中克隆了1个丝氨酸精氨酸丰富蛋白（Serine/ Arginine-rich proteins, SR proteins）家族基因ScRS31,属于RS亚家族成员。该序列全长1 120 bp,包含编码285个氨基酸的完整开放读码框,具有典型的RS亚家族结构特征。生物信息学分析显示,ScRS31编码蛋白是一个不稳定蛋白,表现亲水性;含有41个潜在丝氨酸磷酸化位点,推测通过磷酸化和去磷酸化实现功能调控;与高粱、玉米中的SR蛋白氨基酸序列的同源性最高,分别为97.5％、96.1％。实时荧光定量分析发现,ScRS31在根、花和芽中的表达量远高于其它组织中该基因的表达量。     

甘蔗苏氨酸脱氨酶基因的克隆与表达分析

应用电子克隆技术,以烟草AAG59585序列为探针,获得了甘蔗苏氨酸脱氨酶(threonine deaminase)基因的全长cDNA,命名为ScTD。经RT-PCR扩增和验证,该基因序列与电子克隆结果一致性高达99%。序列分析结果表明:ScTD基因全长2 120 bp,具有完整的开放阅读框(ORF,164~1 681 bp),编码505个氨基酸,该基因编码蛋白定位于微体,为可溶性蛋白,不存在信号肽,二级结构原件多为α-螺旋,含有多个保守功能域,主要在氨基酸合成中发挥作用。电子表达分析结果显示,该基因在甘蔗根尖、根颈、花序、叶片、全株、芽和茎中组成型表达,其中在花序和根中的表达量最高。荧光定量PCR结果分析表明:该基因在甘蔗各组织中均有表达,且在根中的表达量最高。此外,该基因的表达受水杨酸胁迫后表达量最高,约为对照组的43.16倍,其次为聚乙二醇和茉莉酸甲酯,分别为6.90倍和4.40倍,推测该基因的表达与甘蔗抗病虫和抗渗透胁迫有关。此结果为甘蔗ScTD基因的克隆和功能验证以及在甘蔗基因工程中的应用奠定基础。     

玉米ZmNAS1和ZmNAS2基因启动子的克隆与序列分析

根据已知玉米全基因组序列设计引物,采用PCR方法从基因组DNA中克隆两种玉米材料的Zm-NAS1和ZmNAS2基因启动子,利用生物信息学软件对启动子元件进行分析预测并比较在两种材料间差异。结果表明,ZmNAS1基因启动子在两种材料上差异明显,沈137较K12除一段574bp缺失外,他们之间还有24处单核苷酸多态性位点;两种材料间的ZmNAS2基因启动子无差异。ZmNAS1和ZmNAS2基因启动子均具有一些与光调控、激素诱导、响应逆境胁迫等有关的顺式作用元件,但数目存在一定差异;两个基因启动子上都有一定数目缺铁诱导元件的核心序列。根据启动子元件分析,初步判断ZmNAS1和ZmNAS2基因除受缺铁诱导表达外,还可能受到其他多种信号的共同调控,是一个复杂的调控过程。此外,ZmNAS1基因启动子在两种材料间差异明显,推测该基因在两种材料间受到的表达调控水平也不相同。     

甘薯等7种植物NPR1基因的生物信息学分析

水杨酸介导的植物系统获得性抗性的正向关键调控基因NPR1功能上在许多植物中极其保守。本研究利用生物信息学相关软件对以甘薯NPR1基因为主要分析对象的7个NPR1基因的核苷酸序列及其相应氨基酸序列的组成成分、氨基酸翻译后修饰、导肽、跨膜结构域、疏水性/亲水性、蛋白质二、三级结构以及功能结构域等进行分析。结果表明:该类基因属于不具信号肽的疏水性蛋白,α-螺旋和无规则卷曲是蛋白质二级结构最大量的结构元件,β-转角和延伸链散布于整个蛋白质中,具有BTB/POZ和ANK功能结构域。这一结果可为植物NPR1的结构与功能分析及利用研究提供进一步的信息与参考。     

抗花叶病转SrMV-P1基因甘蔗的活性氧代谢分析

转SrMV-P1基因甘蔗经过2个世代的试验,表现出对甘蔗花叶病一定的抗性,但不同转基因无性系中,其抗性呈现出不同程度的分化.本研究以受体材料(FN95-1702)和空转对照P7(未插入外源基因SrMV-P1的载体)为对照,以国家发明专利授权的转基因无性系TF53和T64为试验材料,研究其在不同甘蔗花叶病毒剂量,以及载体效应和外源基因效应作用下的活性氧代谢分析,从代谢水平上解析转基因材料抗性呈现不同分化规律的机理.结果表明:转基因无性系在较高病毒剂量胁迫下,通过活性氧代谢相关指标的变化对病毒侵染起到应激作用;载体效应和外源基因效应对活性氧代谢影响存在一定差异,这段差异时期也主要发生在较高病毒剂量的情况下;外源基因对不同无性系中活性氧代谢的影响,表现在高病毒剂量的作用下,其活性氧代谢相关指标在变化幅度上存在一定差异,导致其对病毒的抵御能力上的不同,这可能是转SrMV-P1基因抗性分化的生理基础.     

苏云金芽胞杆菌cry1Ib2基因的克隆与生物信息学分析

BRC-ZLL4是一株从鱼尾葵(Cargota mitis Lour)上分离到的,对柑橘凤蝶幼虫具有毒性的苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)菌株。本试验采用PCR-RFLP技术鉴定该菌株中含有cry1Ib基因。设计一对特异引物,分别引入SalⅠ和BamHⅠ酶切位点,以BRC-ZLL4的总DNA为模板,扩增cry1Ib全长基因。生物信息学分析表明,该基因全长2160bp,编码一个由719个氨基酸组成的、相对分子质量为81.39ku、等电点为6.425的蛋白。该基因已在GenBank上登录(登录号为EU233027),并被Btδ-内毒素国际命名委员会正式命名为cry1Ib2。信号肽预测显示,Cry1Ib2蛋白没有信号肽,为胞内蛋白。二级结构预测显示,在Cry1Ib2蛋白二级结构中,25%为α-螺旋,28%为β-片层,18%为β-转角,29%为无规则线圈。此外还对Cry1Ib蛋白的功能区和三级结构进行了预测和分析。     

与甘蔗抗黑穗病性相关的14-3-3基因的克隆和表达分析

为了解14-3-3基因在甘蔗黑穗病抗性中的作用,本研究以课题组前期构建的甘蔗抗黑穗病抑制消减杂交文库中筛选出的1个与14-3-3基因同源的EST序列作为探针,利用电子克隆和RT-PCR方法从甘蔗ROC22品种中分离到1个Sc14-3-3基因(Gen Bank Accession Number:KJ577592),并对其序列信息和基因表达情况进行分析。结果显示,该基因ORF长771 bp,编码256个氨基酸残基;Sc14-3-3是定位于细胞质的亲水蛋白,无跨膜螺旋区及信号肽,有10个Ser、3个Thr和7个Tyr潜在的磷酸化位点,并在N-端有4个蛋白结合区和1个多核苷酸结合区,对翻译和能量新陈代谢起着重要作用;该蛋白属非ε类群,其N-端和中间区域在不同物种间相对保守,C-端差异相对较大。基因表达模式分析显示,Sc14-3-3基因可能参与甘蔗对生物逆境的细胞免疫响应,其对Me JA介导的信号途径应答较SA和ABA早;黑穗病菌胁迫下,Sc14-3-3基因在甘蔗抗感品种中的表达模式存在差异,其在抗黑穗病品种YC05-179中上调表达且表达量变化明显,揭示了该基因参与甘蔗对黑穗病的应答反应。以上结果为甘蔗Sc14-3-3基因的功能研究积累了一定的基础资料,并为今后甘蔗的抗病分子育种提供后备基因资源。     

福州宦溪野生蕉（Musa spp.，AB group）CHUP1基因克隆及其生物信息学分析

CHUP1(chloroplast unusual positioning 1)参与了叶绿体移动信号转导过程,对植物避免光伤害及提高光合效率方面具有重要作用,并且与植物抗寒性有密切关系.本研究以福州宦溪野生蕉(Musa spp.AB group)叶片为材料,采用同源克隆的方法,分离出CHUP1基因cDNA和DNA序列,GenBank登录号分别为JX123753、JX880084,命名为Mu-CHUP1.Mu-CHUP1 cDNA全长3232 bp,ORF 2931 bp,编码976个氨基酸.福州宦溪野生蕉Mu-CHUP1 cDNA序列与小果野蕉(M.acuminata,AA Group)全基因组测序中的CHUP1 cDNA序列的相似性为84.71％;福州宦溪野生蕉Mu-CHUP10RF的DNA序列含8个内含子、9个外显子,而小果野蕉全基因组测序中的CHUP1基因组DNA序列则有11个内含子、12个外显子,两者相差较大.生物信息学预测分析表明,Mu-CHUP1磷酸化位点多达62个,并且含有3个保守结构域,可能与其行使多样性的功能有关.     

玉米隐花色素基因的电子克隆及生物信息学分析

用电子克隆的方法得到玉米隐花色素的cDNA全长序列,发现该基因包括4个外显子和3个内含子,其表达产物与水稻、大麦等具有较高的相似性。     

霍山石斛HMGR基因的克隆及其定量表达分析

获得甲羟戊酸生物合成途径中的关键酶基因——3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶基因的信息是确定该基因与倍半萜类石斛碱含量相关性的重要基础工作。本研究采用RT-PCR结合RACE技术,以霍山石斛原球茎为材料,克隆得到霍山石斛HMGR基因的全长c DNA序列,其在Gen Bank中的登录号为KF011508。HMGR基因全长2 240 bp,包含144 bp的5′-UTR,407 bp的3′-UTR(含poly A),开放阅读框为1 689 bp,共编码562个氨基酸。生物信息学分析表明:该蛋白可能是定位于细胞质的一种疏水性不稳定蛋白,无信号肽,不含卷曲螺旋结构,具有14个功能位点、27个磷酸化位点,其二级结构由α螺旋、β折叠和无规则卷曲组成。系统进化树分析表明,该基因与黄姜HMGR基因亲缘关系最近,聚为同一类,主要负责催化萜类化合物生物合成途径中的辅酶A和甲羟戊酸的生成。q PCR结果显示:霍山石斛HMGR基因在茎中的表达量最高,而根中的表达量最低。     

大豆MPBQ-MT基因的克隆与生物信息学分析

以大豆品种合丰25和Bayfield为材料,克隆大豆2-甲基-6-植基-1,4-苯醌甲基转移酶(MPBQMTase)基因,获得1 029 bp的MPBQ-MT基因c DNA序列。通过序列比对发现10个大豆MPBQ-MT基因c DNA区内的潜在SNP位点。采用生物信息学方法分析MPBQ-MT基因编码的氨基酸序列和蛋白质结构。结果表明:MPBQ-MT基因CDS区共编码342个氨基酸,其中缬氨酸(Val)含量最多,占该基因编码氨基酸总数的8.8%;半胱氨酸(Cys)含量最少,占该基因编码氨基酸总数的1.2%;MPBQ-MT蛋白N端包含由58个氨基酸组成的叶绿体转运肽,为亲水性蛋白质。合丰25与Bayfield的MPBQ-MT蛋白质二级结构有所不同,2个品种的MPBQ-MT蛋白质中α-螺旋分别约占25.44%和27.49%,β-转角分别约占9.36%和9.06%,无规则卷曲分别约占40.35%和38.60%。2个品种的MPBQMT蛋白质中片层结构均约占24.85%。两个品种的MPBQ-MT蛋白质均有1个S-腺苷基甲硫氨酸结合位点。对MPBQ-MT蛋白三级结构进行预测,发现去掉转运肽后,MPBQ-MT蛋白质三级结构主要由11个连续的α-螺旋区域和8个连续的片层结构区域组成。结合MPBQ-MT蛋白三级结构对MPBQ-MT基因的生物学功能进一步分析,提出了较为合理的MPBQ-MT作用模型。由系统发生树可知MPBQ-MT蛋白在大豆与菜豆中的亲缘关系较近。