番木瓜病毒病分子检测技术

概述了番木瓜主要病毒病的种类、危害及检测技术,提出了番木瓜病毒病分子检测技术的重要性。     

转基因番木瓜55-1品系的环介导等温扩增检测方法的建立

根据55-1的品系特异性序列设计了5套LAMP引物,筛选扩增效率高的引物。对筛选到的LAMP引物的反应温度和反应体系进行了优化,并进行了特异性、灵敏度和稳定性的实验。结果表明,该套LAMP引物的特异性和稳定性良好,灵敏度为0.05%,最快能在30 min内得到检测结果。建立的LAMP检测方法能有效地检测转基因番木瓜55-1品系,既简化了检测步骤,又缩短了检测时间,为转基因番木瓜的快速检测提供了技术支撑。      

影响组培番木瓜产量的有关因素的研究

观察组培番木瓜植株的花性仅为雌花与两性花，植株上总叶片一般累计２５￣２６片时，在第１１￣１２个叶序始开始初花。茎围大小与产量有关。不同农艺栽植方法对产量的关系观察结果，以斜植产量较高。早期选组培健壮植株，采取相适宜的栽培和管理，可望获得较高产量。     

转基因番木瓜 55-1 转化事件定性 PCR 检测方法的建立

为了防止国外商业化生产的转基因番木瓜流入国内市场,建立转基因番木瓜 55-1 转化事件定性 PCR 检测方法,对于保护国内消费者知情权意义重大。本研究以转基因抗环斑病毒番木瓜 55-1 为研究材料,利用外源基因和番木瓜基因组序列设计了 9 对特异性检测引物,通过特异性引物筛选、熔解曲线分析、退火温度优化、特异性验证、灵敏度分析及检测限验证,建立转基因番木瓜 55-1 转化事件定性 PCR 检测方法。结果表明：本研究筛选出的检测引物,可特异的检出转基因番木瓜 55-1 转化事件,引物的检测灵敏度达到了 0.1%的标准,高于欧盟0.9%的检测要求,完全可满足转基因检测标识制度的顺利实施。     

核酶基因转化番木瓜的研究

利用酶（Ｒｉｂｏｚｙｍｅ,Ｒｉｂ．）基因转化番木瓜（Ｃｗａｒｉｃａ ｐａｐａｙａ Ｌ．）探索培育抗番木瓜环斑病毒（Ｐａｐａｙａ Ｒｉｎｇｓｐｏｔ Ｖｉｒｕｓ,ＰＲＶ）品种的新途径。用三亲交配法将切割ＰＲＶ ＲＮＡ的Ｒｉｂ,基因的表达载体（Ｐ３５ｓ／ＮＰⅡ,Ｒｉｂ）,转入农杆菌ＬＢＡ４４０４,采用农杆菌介导转化将Ｒｉｂ,,基因和ＮＰＴⅡ基因导入番木瓜细胞的核基因组中。其培养的外植体在含有Ｋａｎ．１０     

耐大豆疫霉根腐病QTL定位的研究

利用1200个RAPD随机引物和341对SSR引物对Conrad×OX760的重组自交系(RIL)F2:6群体的耐大豆疫霉根腐病基因进行QTL定位。试验设两个地点、两个年限,在MLG D1b+W和MLG M连锁群上检测到3个QTL,即QP-1(OPL18-800bp)、QP-2(OPN03-600bp)和QP-3(Satt536和Satt463)。每个QTL对病害损失率的贡献率从13.34%到22.31%不等。QP-1和QP-2经多重QTL分析(Mapmaker/QTL1.1)对两年(2000年和2001年)两点(Wood-slee和Werver)平均病害损失率的贡献率合计达44.5%,QP-3对2001年Woodslee试验点的病害损失率的贡献率为15.2%,QP-1对2000年Woodslee试验点的病害损失率的贡献率为21.55%,对2000年Wever试验点的病害损失率的贡献率16.71%,及对两年两点平均病害损失率的贡献率为22.31%。在大多数生态环境下能稳定的、再次被检测出的QTL,可以作为育种工作中的重点选择指标,用以指导耐大豆疫霉根腐病品种的分子辅助选育。     

应用PCR技术快速检测马铃薯环腐病菌

根据马铃薯环腐病菌16SrDNA基因片段核苷酸序列设计引物(引物1∶5-′TGTACTCGGCCAT-GACGTTGG-3′和引物2∶5-′TACTGGGTCATGTTGGT-3)′,进行马铃薯环腐病菌PCR特异性扩增试验。合成的引物能从马铃薯环腐病菌总基因组DNA和细菌纯培养,以及人工接种和自然发病的马铃薯块茎中特异性扩增环腐病菌16SrDNA基因片段1046bp。该试验结果为马铃薯环腐病的鉴定、检测及病害流行学研究提供了新的技术和方法。     

甜菜耐丛根病新品系NC-8的选育

甜菜耐丛根病品系ＮＣ－８是利用国外抗源,通过强化选择,不断提高含糖率,使之成为适合本地区种植的耐丛根病新品系。属标准型二倍体多粒种,根产量在甘肃河西地区平均达到５３．３１ｔ／ｈｍ＾２;产糖量平均达到８０５８ｋｇ／ｈｍ＾２;含糖率平均为１５．０％,分别较对照组提高２４８．４％、３８２．１％和３．４９个百分点。主要特点是耐丛根病性强、根产量高,在病田和无病田均能获得高产。适合于丛根病发生地区种植。     

番木瓜干旱胁迫相关CpDHN基因的克隆与原核表达

本研究基于转录组获得的CpDHN转录本序列,以番木瓜‘台农二号’组培苗叶片为材料,采用RT-PCR技术克隆了该基因包含完整ORF在内的425 bp cDNA序列。序列分析表明,CpDHN预测编码93个氨基酸,其理论分子量为10.50 kDa、等电点为6.62、总平均疏水指数为-1.984、核定位。除保守的K片段外,蛋白还含有1个S片段,可归为KS型脱水素。在拟南芥中的10个脱水素中,CpDHN与AtLEA8的亲缘关系最近,相似性为53.3%。值得注意的是,虽然CpDHN的编码区不存在内含子,但其3°UTR含有1个与AtLEA8类似的内含子。表达谱分析显示,该基因在根和叶片中均受干旱胁迫诱导。此外,还构建了CpDHN的原核表达载体,SDS-PAGE分析显示,该蛋白在大肠杆菌中可高效表达。这些结果为下一步的功能鉴定奠定了坚实的基础。     

基于RNAi抗PRSV番木瓜株系的培育及其分子特征验证

根据RNAi原理构建的抗海南番木瓜环斑病毒(PRSV)植物表达载体p CAMBIA2300-35S-CP-RNAi-OCS,通过基因枪法将载体导入番木瓜的愈伤组织中,经卡那霉素抗性筛选后再分化成为植株。描述转化植株的分子特征同时进行抗病毒试验分析其抗病性。实验结果显示:转基因株系474为单拷贝插入的杂合子,插入位点在第7号染色体supercontig_61的717 141位置;抗病毒试验中,在接种病毒后28 d内非转基因株系1280有高浓度的病毒积累并很快表现出明显的病症,而转基因株系474基本无病毒积累且无发病症状。表明转基因株系474具有较好的PRSV抗性,有待于进一步田间试验。     

水稻越冬品系的耐冷性鉴定

以4个水稻越冬品系和4个籼稻品种(对照)为材料,检测了低温胁迫条件下水稻幼苗的生理生化特性。结果显示,经低温胁迫,越冬品系的幼苗存活率极显著高于对照品种,幼苗存活率最高的是SW-2(95.31%),最低的是对照品种桂99(1.67%),4个越冬品系平均幼苗存活率比4个对照品种高出71.12个百分点。低温胁迫后越冬品系的相对电导率小于对照品种,黄化幼苗的转绿能力强于对照品种。水稻幼苗在低温胁迫后丙二醛(MDA)含量都有所增加,但越冬品系比对照品种增加的量要少;越冬品系在低温胁迫后超氧化物歧化酶(SOD)相对活性比对照品种要高。因此,越冬品系具有很强的耐低温能力。     

大豆种子发芽期耐旱性鉴定的适宜PEG-6000浓度筛选

以抗旱性不同的3个大豆品种(湘豆3号、Lee68和宁镇1号)为试材,研究了不同浓度(5%、10%、15%、20%、25%和30%)的PEG-6000模拟发芽期干旱胁迫对大豆种子发芽、子叶苗膜脂过氧化以及渗透调节物质含量的影响。结果表明:10%以下的PEG-6000能起引发作用,促进大豆种子的萌发,显著提高发芽势和发芽率;随着PEG-6000浓度的升高,大豆种子的发芽明显受抑制,当PEG-6000浓度大于25%时抑制更明显,发芽势、发芽率、发芽指数和简易活力指数显著下降;随着PEG-6000浓度的升高,大豆子叶苗中的丙二醛(MDA)、脯氨酸(Pro)、可溶蛋白和可溶性糖含量显著增加,PEG-6000浓度在15%~25%间增加幅度最大,PEG-6000浓度小于15%或大于25%时增加不明显。综合种子发芽、子叶苗的膜脂过氧化程度以及渗透调节物质含量的变化,可初步确定室内采用PEG-6000浸种法模拟干旱胁迫鉴定大豆发芽期耐旱性的适宜浓度为20%~25%。     

利用分子标记进行水稻苗期耐冷性相关性状的QTLs研究

用二九青和Yukihikari杂交后再经8代自交得到的79个重组自交系(RIL)群体为材料,构建了包含89个微卫星标记的分子连锁图谱.以低温下缺绿、枯萎死苗为指标对水稻苗期耐冷性数量性状位点(QTLs)进行了定位.在17℃,18℃和15～20℃ 3种不同低温处理情况下,以叶绿素含量为指标,共定位了11个QTLs,它们分别位于染色体1(2个),2(2个),3,5,6,7,8,9,12上;其中3个QTLs在3种环境中都能检测到,1个QTL在2种环境中检测到,而其余7个QTLs只能在1种环境中检测到;11个QTLs各自引起的表型变异为5.68%～27.42%.以枯萎死苗作为指标共定位了5个QTLs,分别位于染色体3,4,7,8,11上,各QTL控制的表型变异范围为7.65%～49.34%;其中位于染色体11上的RM224位点引起的表型变异达49.34%,是一个主效QTL.缺绿和枯萎死苗都是不耐冷品种受低温影响的表现,但从分子图谱定位的结果看,它们是由不同的基因位点控制的,没有连锁遗传关系.由此推断,水稻苗期耐冷性是一个由多基因控制的复杂遗传现象.     

猫尾射的组织培养

以猫尾射无菌播种苗(去除根部)为外殖体,对其愈伤组织诱导和分化及其不定芽增殖进行研究。结果表明,外殖体在MS＋6-BA 1.0 mg/L＋NAA 0.1 mg/L培养基上,愈伤组织诱导和分化的效果较好,愈伤诱导率为82.0%,分化率为74.5%;经不定芽增殖培养基MS＋6-BA 0.5 mg/L＋NAA 0.05 mg/L培养,不定芽增殖倍数为8.2,平均株高为4.7cm。组培苗在MS＋IBA 0.5 mg/L培养基上生根率达90%。生根苗移栽成活率达84%。     

硝酸镧处理对短穗鱼尾葵幼苗耐寒性的影响

为探明硝酸镧对短穗鱼尾葵(Caryotamitis)耐寒生理指标的影响,用4个不同浓度的硝酸镧溶液(0、100、350、500mg/L)喷施盆栽短穗鱼尾葵叶片,经变温处理后检测各项耐寒指标。结果表明,超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化物酶(POD)、丙二醛(MDA)、脯氨酸、可溶性蛋白和叶绿素的含量表现出明显的浓度效应,而且25℃恢复后幼苗叶片的各项耐寒指标的模糊隶属函数值分别为0.41、0.46、0.70、0.50,其中350mg/L硝酸镧溶液处理对提高短穗鱼尾葵幼苗的耐寒性具有显著的效应。     

甜(辣)椒胚培养与育种加代技术的研究

为了加速甜(辣)椒世代繁殖,利用植物组织培养技术将甜(辣)椒不同成熟度的幼胚进行离体培养研究。结果表明,将授粉后生长30～35 d的幼胚接种到MS基本培养基上进行培养,每代可缩短种子成熟期20～30 d,2年可繁殖5～6代。     

大豆种子抗老化鉴定的方法研究

选用遗传差异相对较大的皖豆24、皖豆25(杂交品种)及合豆3号的种子,在温度为40℃、湿度为85%的条件下老化处理4、8和12 d,研究加速老化过程中不同基因型大豆种子成苗率、发芽率、电导率及单株幼苗干重的变化规律。结果表明:随着加速老化时间的延长种子活力下降;加速老化处理8 d,3个品种的各项鉴定指标均发生改变:品种的成苗率、发芽率及单株幼苗干重显著降低,电导率明显升高,且品种间有显著差异;发芽率和成苗率的变化在品种间具有一致性,电导率、单株幼苗干重的变化和成苗率品种间一致性较差;成苗率和发芽率的相关性最高(r=0.972**)。利用国家大豆微核心种质中的91份资源对老化鉴定方法进行验证,结果在温度为40℃,湿度为85%条件下老化8 d的种子发芽率及老化指数与在自然条件下老化15个月的发芽率及老化指数极显著相关(r=0.943**,0.716**)。综合分析认为,温度为40℃,湿度为85%条件下老化处理8 d,以种子发芽率为活力鉴定指标可作为大豆种子抗老化性的鉴定方法。     

In vitro adventitious bud techniques for vegetative propagation and mutation breeding of potato (Solanum tuberosum L.). 1. Vegetative propagation in vitro through adventitious shoot formation

Summary Rachis, petiole and leaflet-blade explants of potato were either not irradiated or irradiated with different doses of X-rays. The effect of X-ray dose, explant type and explant position on adventitious shoot formation of in vitro cultured explants and on subsequent root formation of subcultured shoots was examined. The in vitro method of vegetative propagation resulted in the production of 3167 plantlets from 457 explants (with subcultured shoots), at least 4 months after incubation.

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Zusammenfassung Hauptachsen-, Blattstiel- und Fiederblatt-Gewebestückchen von Kartoffeln wurden von verschiedenen Stellen isoliert und entweder nicht bestrahlt oder mit verschiedenen Dosen von X-Strahlen bestrahlt. Die isolierten Pflanzenteile wurden auf MS-N?hrb?den erg?nzt mit 0,8 % Agar, 5 % Saccharose, BAP und IAA (1 mg/l) und GA₃ (10 mg/l), kultiviert. Die Gewebe wurden einer Tagesl?nge von 14 h, einer Temperatur von 20 °C und 70–80 % relativer Feuchtigkeit ausgesetzt. Die ersten Nebentriebe erschienen 3–6 Wochen nach der Inkubation (Abb. 6 und 7). Bei 94,7 % der nicht befallenen Kontrollgewebe wurden neue Triebe (≥1 cm) gebildet (Tabelle 1a). Bestrahlung versp?tete und reduzierte die Neubildung von Trieben; diese Reduktion schien mehr oder weniger unabh?ngig vom Typ des Gewebes und proportional zur Dosis der X-Strahlen zu sein. Die Gewebestelle beeinflusste die Nebentriebbildung nur wenig (Tabelle 1b). Die ersten Triebe (≥1 cm) wurden aus den Kontrollgeweben abgeschnitten und für die Bewurzelung auf MS-N?hrboden, erg?nzt mit 0,5 % Agar, 2 % Saccharose und 0,1 mg/l IAA, 19 Wochen nach Inkubation nachgebaut. Die Anzahl der grossen, nachgebauten Triebe pro Gewebe nahm mit steigender Dosis der X-Strahlen ab (Tabelle 2a). Die Anzahl der grossen, nachgebauten Triebe (≥1 cm) pro Kontroll-Fiederblattgewebe (13,9) war etwas h?her als die Anzahl pro Hauptachsen- und Blattstielgewebe der Kontrolle (12,5). Die Gewebestelle beeinflusste die Anzahl der grossen nachgebauten Triebe nicht deutlich (Tabelle 2b). Die ersten nachgebauten Triebe brachten nach einer Woche Wurzeln hervor, und die meisten Triebe hatten nach 2 Wochen Wurzeln entwickelt. Die bewurzelten Triebe und die kr?ftigsten unbewurzelten Triebe wurden für die sp?tere Produktion in Erde verpflanzt und nachfolgend als Pfl?nzchen ins Glashaus überführt. Es wurde kein signifikanter Einfluss von Gewebetyp und Gewebestelle in bezug auf die Anzahl der eingetopften Triebe und der übersiedelten Pfl?nzchen festgestellt. Gewebe sowohl von Hauptachse und Blattstiel als auch vom Fiederblatt brachten bei steigender Dosis von X-Strahlen eine abnehmende Anzahl von eingetopften Trieben und übersiedelten Pfl?nzchen. Schliesslich wurden 158 von 225 Trieben (70,2 %), die von Hauptachsen- und Blattstielgeweben der Kontrolle stammten, ins Glashaus überführt, und 203 von 251 Trieben (80,9 %) aus Fiederblattgewebe der Kontrolle. In den Kontrollverfahren wurden von jedem Gewebestück 8,8 Pfl?nzchen von Hauptachsenund Blattstielgeweben versetzt und 11,3 Pfl?nzchen von Fiederblattgeweben. Der Durchschnitt pro Gewebestückchen mit grossen Trieben betrug 10,0 Pfl?nzchen. Kontrollpfl?nzchen erhielt man ungef?hr fünf Monate nach dem Schneiden der Gewebestücke; bei Bestrahlung mit steigender Dosis von X-Strahlen wurden zunehmend l?ngere Zeiten ben?tigt.

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Résumé Des explants de rachis, de pétiole et de limbe foliaire prélevés en différents endroits ont été soit non irradiés, soit irradiés à différentes doses de rayons X. Les isolats ont été mis en culture sur des milieux MS, additionnés d'agar à 0,8 %, de 5 % de sucrose, de 1 mg/l de BAP et IAA et 10 mg/l de GA₃. Les explants sont soumises à une durée du jour de 14 h, une température de 20 °C et 70–80 % d'humidité relative. L'initiation des premières pousses adventives apparait 3 à 6 semaines après incubation (fig. 6 et 7). Sur 94,7 % des explants témoins et non-contaminés les pousses (≥1 cm) ont été régénérées (tableau 1a). L'irradiation a à la fois retardé et réduit la régénération des pousses; cette réduction s'est révélée plus ou moins indépendante du type d'explant, mais proportionnelle à la dose de rayons X. La position de l'explant n'a que légèrement modifié la formation de pousses adventives (tableau 1b). Les premières pousses (≥1 cm) ont été excisées des explants témoins puis mises en culture pour l'enracinement sur milieu MS, additionné de 0,5 % d'agar, 2 % de sucrose et 0,1 mg/l de IAA 19 semaines après incubation. Le nombre de grandes pousses repiquées par explant a diminué lorsque la dose de rayons X a augmenté (tableau 2a). Le nombre de grandes (≥1 cm) pousses repiquées par explant témoin de limbe (13,9) était un peu plus grand que celui par explant témoin de rachis et de pétiole (12,5). La position de l'explant n'a pas modifié nettement le nombre de grandes pousses repiquées (tableau 2b). Les premières pousses repiquées ont régénéré des racines 1 semaine après et la plupart des pousses ont eu des racines au bout de 2 semaines. Les pousses avec racines et les plus vigoureuses des pousses sans racines ont été transplantées dans le sol pour la dernière production et un transfert ultérieur des jeunes plantes en serre. Nous n'avons observé aucun effet significatif du type d'explant et de la position de l'explant sur le nombre moyen de pousses transplantées et de jeunes plantes transférées. Les explants de rachis, de pétiole aussi bien que ceux de limbe ont produit moins de pousses transplantées et de jeunes plantes transférées avec les doses croissantes de rayons X. En définitive, 158 sur 225 pousses (70,2 %) issues de rachis et de pétiole témoins, et 203 sur 251 pousses (80,9 %) issues d'explants de limbe témoin ont été transférées. Dans les traitements témoins, pour chaque explant de rachis et de pétiole 8,8 jeunes plantes ont été transférées contre 11,3 pour les explants de limbe, ce qui fait en moyenne 10 jeunes plantes par explant avec de grandes pousses. Les jeunes plantes témoin ont été obtenues environ cinq mois après l'excision des explants; avec irradiation il fallait des délais de plus en plus longs aux doses croissantes de rayons X.