感染与未感染桃拉病毒凡纳宾对虾基因差异表达文库的构建

为了寻找对虾抗桃拉病毒(TSV)相关基因信息,研究对虾抗TSV分子机理。应用抑制性差减杂交(SSH)技术,构建TSV感染后存活凡纳宾对虾与未感染凡纳宾对虾的基因差异表达文库,并通过相对定量PCR以及斑点杂交分别对SSH的效率以及文库的可靠性进行验证。结果表明,SPR凡纳宾对虾和SPF凡纳宾对虾攻毒后的死亡率分别为12%和90%;在SSH系统中,相对于未进行杂交的cDNA样品,杂交后的cDNA样品的β-肌动蛋白(β-actin)几乎没有被检测出,说明SSH操作系统是高效率的。通过文库构建则获得正负2个文库,其中正库含阳性克隆1051个,负库含阳性克隆580个;而经斑点杂交验证,共获差异表达克隆321个,其中攻毒组高表达克隆270个,未攻毒组高表达克隆51个。可见,SPR凡纳宾对虾具有较强的抗TSV能力,以之为基础构建的对虾基因差异表达文库具有高度的可靠性,由文库得到的基因信息对获取对虾抗(TSV)相关基因具有潜在的应用价值。     

抑制消减杂交技术筛选鹅产蛋期差异表达基因

[目的]鉴定筛选鹅产蛋与就巢差异表达基因。[方法]应用抑制消减杂交技术构建鹅产蛋与就巢鹅卵巢组织双向cDNA文库,获得差异表达基因。[结果]从双向文库随机挑选单菌落进行PCR验证,结果表明文库质量良好。选取654个阳性克隆进行测序分析,获得641条表达序列标签（ESTs）。对ESTs进行去除载体序列、质量检测、聚类及拼接,经Blast比对,有166条ESTs找到与之匹配的同源序列,其中92个是功能基因。[结论]比较就巢与产蛋SSH文库,发现产蛋特异性基因文库中参与物质能量代谢、细胞防御的基因较多,而在就巢SSH库中参与细胞凋亡、信号转导及细胞结构的基因出现频率较高。该结果对进一步研究鹅卵泡发育及繁殖力分子标记筛选打下了基础。     

打顶烟草根尖组织抑制性消减cDNA文库的构建及其序列分析

[目的]构建烟草打顶后根尖组织的消减文库,寻找调控烟碱生物合成的相关候选基因.[方法]以打顶株为测验子(tester)、以非打顶株为驱赶子(driver),利用抑制性消减杂交(suppression subtractivehybridization,SSH)和反向Northern杂交技术构建和筛选烟草打顶前后根尖组织消减文库,并对差异表达克隆进行生物信息学分析.[结果]构建了具有高消减效率的cDNA文库.PCR验证消减文库阳性克隆的插入片段为200-1 000 bp.经反向Northern杂交,从850个克隆中筛选到560个杂交信号差异明显的克隆,测序后得到273条有效序列.对273个已知功能基因的ESTs进行分类,生物碱合成类占4%、植物激素代谢类占3%、信号转导和转录因子类占18%、胁迫和防御类占32%、蛋白质代谢占9%,碳代谢占6%、其它代谢占15%,功能未知类占13%.RT-PCR结果显示,NTAT84和NTAT71序列在烟株打顶后转录活性均升高.[结论]应用SSH技术构建了烟草打顶前后根尖组织消减cDNA文库.     

亚麻LusiCesA1上调基因表达研究

研究通过克隆亚麻纤维素合成酶Lusi Ces A1基因,利用抑制差减杂交(SSH)技术,以DIANE Lusi Ces A1基因敲除RNA为Tester,常规RNA为Driver,构建亚麻纤维素合成酶c DNA文库,逆向斑点杂交验证阳性克隆,筛选差异表达克隆,鉴定出Lusi Ces A1上调表达增强基因122个,其中95个与已知功能基因同源,其余27个未知同源序列推断为亚麻纤维素合成途径新基因。Lusi Ces A1是亚麻纤维素合成途径关键酶基因,通过其上调表达作用机理分析,挖掘纤维合成过程上调表达基因,可改良亚麻品种。     

利用高通量测序技术分析IHHNV感染凡纳滨对虾的基因差异表达

[目的]研究传染性皮下及造血组织坏死病毒（Infectious hypodermal andhematopoietic necrosis virus,IHH-NV）感染凡纳滨对虾的基因差异表达,为进一步了解IHHNV与凡纳滨对虾的相互作用分子机制提供参考.[方法]采用454高通量测序技术对IHHNV感染和对照凡纳滨对虾进行转录组测序,测序获得的序列除去接头后用iAssembler软件进行拼接得到unigene（单一基因序列）,通过计算各unigene的转录本数目（RPKM）确定差异表达基因,并以实时荧光定量PCR验证基因的差异表达.[结果]采用454高通量测序技术对IHHNV感染和对照凡纳滨对虾进行转录组测序,共获得208690条短序列,序列拼接共得到21912条tmigenes;通过对IHHNV感染和对照凡纳滨对虾的测序数据比较分析,结果发现221个差异表达基因,包括81个上调表达基因和140个下调表达基因.经实时荧光定量PCR验证,454高通量测序数据统计的基因表达差异结果可靠.[结论]IHHNV感染显著影响凡纳滨对虾免疫相关基因的表达,而利用高通量测序技术可有效检测出这些差异表达基因.     

甘蓝型油菜种子不同发育期基因差异表达cDNA文库构建

以授粉后27 d的种子mRNA为目标群体,授粉后7 d的种子mRNA为对照,构建甘蓝型油菜种子发育期基因差异表达文库.文库包括560个克隆,经菌落PCR检测,456个菌落含有插入片段,占全部克隆的91.2 %,片段大小200～600 bp.对PCR阳性克隆进行斑点杂交,得到201个上调的阳性斑点杂交阳性克隆,对其进行测序,得到有效ESTs序列198个.BLASTN结果显示,134个ESTs序列没有同源序列,可能是新基因,另外64个ESTs序列在油菜或拟南芥核酸数据库中存在同源序列.这64个ESTs序列和已知功能(主要是能量代谢、物质代谢、基因调控、衰老及抗性等)的蛋白有高度相似性.     

乙烯诱导下柑橘果实离层SSH文库的构建及分析

为发掘柑橘果实脱落过程中的关键基因,构建了受乙烯诱导的柑橘果实离层SSH文库,经蓝、白斑筛选,菌液PCR检测和测序验证,共获得385条有效EST.经聚类拼接得到单基因簇30个,其中片段重叠群28个、单一EST序列2个.经BLASTX比对NCBI的非冗余蛋白数据库,在这些ESTs中,28个找到同源序列,2个无匹配;BLAST2GO功能注释表明:这些单一基因主要涉及衰老、抗逆防御、细胞壁水解、信号转导等功能.     

陆地棉显性无腺体近等基因系SSH文库的构建

[目的]应用抑制性消减杂交技术构建差异表达cDNA消减文库。[方法]以显性无腺体中棉所12（显无中12）和中棉所12（中12）提取棉花总RNA,以显无中12为驱动子,中12为检测子,利用SSH法建立差异表达cDNA文库进行克隆,并以NestedPcRPrimer1和2R对插入片段进行PCR扩增,分别以显无中12和中12总cDNA为探针进行反向Northern杂交,筛选差异表达克隆,进行序列相似性分析。[结果]通过建立差异表达cDNA文库共获得2280个克隆,通过反向Northern杂交共筛选363个差异表达克隆,测序后得到299个质量合格的EST序列,共56个重叠群,91个单拷贝。这些EsT所涉及的基因,主要是与代谢和次生代谢调节、生物合成、细胞凋亡、信号传导等有关联的cDNAs。[结论]SSH文库的构建和分析为显性无腺体形成相关基因的克隆和结构功能研究奠定了基础。     

Construction of full-length cDNA library and its EST sequence analysis in sugarcane root at seedling stage under drought stress

[目的]构建甘蔗根系全长cDNA文库,并进行测序,为分离克隆甘蔗抗旱候选基因奠定基础.[方法]在干旱胁迫条件下,以新台糖22号甘蔗根系为材料,采用SMART技术构建cDNA文库,并进行EST序列分析.[结果]文库构建质量鉴定结果显示,文库库容量为1.0×106 PFU/mL,重组率约95％,文库插入片段长度在500～2000 bp,平均长度约1102.1 bp.挑选526个阳性克隆进行单向测序后,共获得523个ESTs序列,去除载体、接头序列以及长度低于100 bp的序列后,进行聚类分析并组装,共得到468个Uni-ESTs,其中congtig 29个,singlets 439个,分别占总数的6.5％和93.5％.通过与NCBI非冗余蛋白库进行BLASTX比对,发现444个Uni-ESTs在GenBank有同源序列,占94.87％;获得24个未知蛋白功能基因,占5.13％.[结论]构建了干旱胁迫下甘蔗苗期根系全长cDNA文库,获得523个ESTs序列和468个Uni-ESTs,并获得一批新的未知蛋白功能基因.     

干旱胁迫下甘蔗苗期根系全长cDNA文库构建及EST序列分析

[目的]构建甘蔗根系全长cDNA文库,并进行测序,为分离克隆甘蔗抗旱候选基因奠定基础.[方法]在干旱胁迫条件下,以新台糖22号甘蔗根系为材料,采用SMART技术构建cDNA文库,并进行EST序列分析.[结果]文库构建质量鉴定结果显示,文库库容量为1.0×106 PFU/mL,重组率约95%,文库插入片段长度在500~2000 bp,平均长度约1102.1 bp.挑选526个阳性克隆进行单向测序后,共获得523个ESTs序列,去除载体、接头序列以及长度低于100 bp的序列后,进行聚类分析并组装,共得到468个Uni-ESTs,其中congtig 29个,singlets 439个,分别占总数的6.5%和93.5%.通过与NCBI非冗余蛋白库进行BLASTX比对,发现444个Uni-ESTs在GenBank有同源序列,占94.87%;获得24个未知蛋白功能基因,占5.13%.[结论]构建了干旱胁迫下甘蔗苗期根系全长cDNA文库,获得523个ESTs序列和468个Uni-ESTs,并获得一批新的未知蛋白功能基因.     

Identification and analysis of differentially expressed genes involved in dark-induced photoperiod response and senescence of soybean leaves by suppression subtractive hybridization

A cDNA subtractive library enriched for dark-induced up-regulated ESTs was constructed by suppression subtractive hybridization(SSH) from leaf tissues of soybean cultivar DongNong L13 treated with short-day(8-h light/16-h dark) and long-day(16-h light/8-h dark) conditions.A total of 148 clones were sequenced,representing 76 unique ESTs which corresponded to about 20% of 738 clones from the cDNA library and showed a significant up-regulation of at least three fold verified by dot blot hybridization.The putat...     

凡纳滨对虾肌肉组织cDNA全长文库的构建

【目的】为了在短期内获得大量凡纳滨对虾肌肉组织的功能基因表达信息,为深入了解功能基因在凡纳滨对虾肌肉组织中的表达提供分子生物学依据。【方法】通过构建凡纳滨对虾肌肉组织的全长cDNA文库,并进行EST测序分析。【结果】文库质量分析表明,初始文库库容约8．50×10^6 CFU,重组率在95％左右,插入片断大小为0．5～4．0kb,多数在1．0kb以上。随机测序72条cDNA,可得到有功能注释的37条全长cDNA和18条编码未知蛋白的基因序列。通过Gene Ontology功能分类可将有功能注释的37个基因分为蛋白质合成、细胞骨架、细胞信号传导、代谢、转运、能量、转录、抗病及防御、生殖发育和未知功能基因等10类,其中蛋白质合成类基因最多（27．03％）,与细胞骨架（13．51％）、细胞信号传导（13．51％）及代谢类基因（13．51％）共占67．56％。【结论】构建凡纳滨对虾肌肉组织的全长cDNA文库,可实现短期内获得大量凡纳滨对虾肌肉组织的功能基因表达信息.     

凡纳滨对虾类泛素折叠修饰蛋白Ufm1基因克隆、序列分析及结构预测

【目的】了解类泛素折叠修饰蛋白（Ufml）的结构特征和蛋白功能,为进一步探究Ufml基因功能提供参考。【方法】以同一生长性状分离凡纳滨对虾家系的肌肉组织为材料,构建凡纳滨对虾生长性状差减。DNA文库,通过斑点杂交筛选获得Ufml基因,经全长cDNA文库筛选获得ufml基因全长序列。【结果】Ufml基因全长cDNA序列长714bp,包含261bp的开放阅读框,推测编码的蛋白质为86个氨基酸,预测的分子量为9．3ku,等电点pI为6．55;其编码蛋白无信号肽,无跨膜区域,可能定位于细胞质中,属于亲水性蛋白,含有1个酪蛋白激酶II磷酸化位点、1个N-糖基化位点、2个蛋白激酶c磷酸化位点;序列同源性分析表明,不同进化地位物种的Ufml基因存在较高的同源性。【结论】Ufml基因在系统进化上高度保守,这为进一步探究Ufml基因功能及原核表达等奠定了基础。     

正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库构建及EST初步分析

【目的】构建猪淋巴细胞基因文库,初步绘制正常猪外周血淋巴细胞的基因表达谱,为进一步筛选免疫相关基因提供平台。【方法】以mRNA为模板,经反转录酶催化,在体外反转录成cDNA,与质粒载体连接后转化大肠杆菌,进一步扩增后,获得猪外周血淋巴细胞全部mRNA信息的cDNA克隆集合,并进行序列分析和注释。【结果】构建了正常猪外周血淋巴细胞cDNA文库,获得库容量为1．2×10^6PFU／mL、重组率为93．3％、85％插入片段处于750～2000bp的高质量文库;随机测定1100条ESTs,经拼接和聚类,获得152条高表达的基因重叠群（Contigs）和619条低表达基因——单拷贝的EST（Singletons）;经序列比对分析,发现23．3％ESTs为与任何物种都没有匹配的新基因,75．9％ESTs为与猪没有匹配的新基因。用GO数据库对获得的EST进行基因功能分类和KEGG路径图分析,发现丝裂原活化蛋白激酶途径（Mitogenn—activated protein kinase,MAPK）、钙信号通路、胰岛素信号通路、脂肪细胞因子信号通路、Toll—like受体信号通路、B细胞受体信号通路和T细胞受体信号通路的基因均有较高表达。【结论】大部分的猪外周血淋巴细胞基因尚未被分离和鉴定出来,但这些基因mRNA转录和表达丰度均较高,且在猪外周血淋巴细胞中起着非常重要的作用。     

中国野生华东葡萄抗霜霉病抑制消减文库构建及初步分析

 【目的】分离和获得中国野生华东葡萄抗霜霉病相关基因片段的EST序列。【方法】以高抗霜霉病的中国野生华东葡萄（V.pseudoreticulata）白河-35-1 株系为材料,以田间接种葡萄霜霉菌的幼嫩叶片为处理,以田间自然生长的未接种幼嫩叶片为对照,分别提取RNA,采用抑制消减杂交技术构建抗霜霉病基因的消减正交和反交两个文库,在文库中,选择3个EST序列,用半定量PT-PCR检验构建文库中EST片段的表达情况。【结果】构建的文库中EST片段的大小在150～900 bp,经筛选文库,得到正交库有效的ESTs 85条,反交库ESTs 29条,所获序列经过BLASTn和BLASTx网上序列比对,其中有78条ESTs与GenBank中其它植物相关基因序列有较高的同源性,31条为未知功能序列,已登录GenBank 114条ESTs,登录号:FG106789-FG106902。进一步利用半定量RT-PCR 对文库中3个基因的表达情况进行了分析,证明这些EST序列是可以表达的。【结论】经初步分析这些序列的功能,涉及抗病信号传导、能量代谢、蛋白质代谢、核酸代谢、光合作用及膜运输和代谢等方面,其中获得与抗病直接相关的ESTs 23条,下一步是通过对获得的EST序列进行末端快速分析（RACE）技术,获得抗霜霉病基因全长序列,并进行原核和真核表达研究验证基因全长序列功能,为研究葡萄抗霜霉病的基因提供依据。     

马铃薯块茎低温反应抑制差减文库的构建及鉴定

本研究以4℃(Tester)和20℃(Driver)处理的马铃薯野生种Solanum berthaultii的无性系CW2-1块茎为材料,构建马铃薯块茎低温反应抑制差减文库以进一步筛选差异表达基因。通过PCR鉴定后,获得了含有2 112个阳性克隆的差减杂交文库。采用反向Northern方法对差减文库进行筛选鉴定,得到274个含有显著表达差异基因（P/N>3）的阳性克隆。从274个克隆中挑选了53个克隆进行测序和同源比对分析,合并后获得29个代表不同基因的非重复序列片段,表明文库具有较高质量。并随机选取了其中4个EST进行基因表达分析,结果显示,在耐低温糖化的S. berthaultii块茎中,4℃下贮藏的块茎基因表达强度高于20℃贮藏的块茎;同在4℃贮藏条件下,S. berthaultii和易低温糖化栽培种E1的块茎中基因的表达量亦存在差异,证明所构建的差减文库富集了马铃薯块茎对低温响应的基因。     

北京鸭×番鸭杂种优势相关基因表达差异研究

用抑制性消减杂交(SSH)方法研究动物杂种相关基因表达差异。选用北京鸭、法国番鸭及其正反交F_1代,以杂种组为处理,亲本组为对照,建立肌肉组织SSH基因文库,随机选取1 000个单克隆测序,并与GenBank序列进行比对分析。结果共发现40个新ESTs,93个未知功能蛋白基因,34个已知功能蛋白基因。在34个已知功能蛋白基因中,杂种表达上调的基因有23个,杂种表达下调的有11个。研究表明杂种优势分子遗传基础复杂,涉及能量代谢、信号传导及调控、转录调控、蛋白质合成加工等基因的差异表达。     

油菜矮化突变体茎段伸长初期茎尖差异表达基因的初步分析

采用抑制性消减杂交技术,以甘蓝型油菜矮化突变体"NDF-1" 及野生型"3529"为材料构建与植株高矮性状关系最为密切的茎尖差异表达抑制消减cDNA文库.所建cDNA文库插入片段大小主要集中在100～500 bp之间.斑点杂交筛选得到30个阳性克隆,序列测定和同源性对比分析表明,所得克隆功能涉及到第二信使、转录因子、激素代谢、蛋白质降解及转运等多个方面.并对其中几个差异表达基因的功能进行了初步分析,为进一步认识油菜植株矮化机理奠定了基础.     

鸡卵巢组织SSH cDNA文库构建及差异表达基因筛选与初步鉴定

为分离与鸡产蛋性能密切相关的重要基因或调控因子，利用抑制性消减杂交技术，以高产蛋鸡品种海兰褐商品代蛋鸡和产蛋量相对较低的地方鸡品种大骨鸡20周龄时的卵巢组织为试验材料，构建消减cDNA文库。文库的插入片段集中在500bp左右，挑取720个克隆进行PCR筛选，获得657个阳性克隆，经过点杂交筛选后选择了536个阳性克隆，...