鸡传染性支气管炎病毒S1基因在昆虫细胞中的高效表达

将鸡传染性支气管炎病毒（ Ｉ Ｂ Ｖ） Ｓ１ 基因 ｃ Ｄ Ｎ Ａ 克隆至含有起始密码 Ａ Ｔ Ｇ 的转移载体 ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３／４,构建成重组转移质粒 ｐ Ｓ Ｘ Ｉ Ｖ Ｖ Ｉ＋ Ｘ３／４ Ｓ１． Ｈｏｌｔｅ,再与粉纹夜蛾核型多角体病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ Ｓ Ｖ Ｉ－ Ｇ Ｄ Ｎ Ａ（ Ｏ Ｃ Ｃ－ , ｇａｌ＋ ）共转染 草地夜蛾（ Ｓｆ９） 细胞, 经空斑纯化得 到已插入 Ｓ１ 基 因并能形成多角体 的重组病毒 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 。以重组毒株感染 Ｔｎ５ Ｂ１ 细胞,在不同时间收取感染了病毒的细胞进行 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ 与 Ｗ ｅｓｔｅｒｎ 印迹检测。 Ｔｎ Ｎ Ｐ Ｖ（ Ｘ３／４） Ｓ１． Ｈｏｌｔｅ Ｏ Ｃ Ｃ＋ 在感染的细胞中高效表达了 Ｓ１ 基因,表达产物为约 １００ ０００ 的融合蛋白,与预计的表达修饰后的产物大小相符,推测此蛋白已糖基化。 Ｓ Ｄ Ｓ Ｐ Ａ Ｇ Ｅ凝胶薄层色谱分析结果显示,感染病毒后 ４８、７２、９６ ｈ, Ｓ１ 蛋白分别占细胞内总蛋白量的 ２８７％ 、３５８％ 、３７１％ 。     

鸡传染性支气管炎病毒S1基因在昆虫细胞中的表达

将含有传染性支气管炎病毒（ＩＢＶ）广东地方分离株Ｄ４１的Ｓ１基因ｃＤＮＡ（从ＡＴＧ到Ｓ前体蛋白裂解位点）的片段克隆到具有多角体启动子（ＰＸＩＶ）和人工合成启动子（Ｐｓｙｎ）的杆状病毒转移载体质粒ｐＳＸ－ＩＶＶＩ＋Ｘ３中，构建了重组转基因载体质粒ｐＳＸＩＶＶＩ＋Ｘ３－Ｓ１．Ｄ４１。用该重组转移质粒与无包涵体的粉纹夜蛾核型多角体病毒ＴｎＮＰＶ－ＳＶＩ－ＧＤＮＡ（ｏｃｃ－，ｇａｌ＋）共转染草地夜蛾（Ｓｆ９）细胞，筛选并纯化出既能表达Ｓ１基因又能形成多角体的重组病毒ＴｎＮＰＶ－ＩＢＶＳ１－ｏｃｃ＋（ｏｃｃ＋，ｇａｌ－）。通过间接ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｓｔｅｒｎ－ｂｌｏｔ等方法在感染了重组病毒的Ｓｆ９细胞中成功地检测到分子量约６２０００的Ｓ１基因表达产物。虽然该重组Ｓ１糖蛋白可能由于Ｎ－糖基化不完全而分子量小于天然蛋白，但它可以像正常病毒粒子一样，被鸡抗ＩＢＶＤ４１株血清特异识别。     

禽传染性支气管炎病毒S1基因在毕赤酵母中的表达

根据GenBank已公布的传染性支气管炎病毒(Infectious bronchitis virus,IBV)株S1基因序列及pPIC9K表达载体序列,设计1对IBV S1基因表达片段的PCR引物,用RT-PCR方法扩增出长度为1 566 bp IBV S1基因表达片段,5′端不含信号肽序列,3′端添加了终止密码子。用限制性内切酶SnaB和Not将S1基因和载体pPIC9K酶切回收后连接,构建了重组表达载体pPIC9K-S1。用限制性内切酶Bgl将表达质粒pPIC9K-S1线性化,然后用电转化的方法导入毕赤酵母GS115,在MD平板上生长的转化子经过PCR鉴定和表型筛选后,获得了整合型阳性重组菌株GS115/pPIC9K-S1 His Muts。将重组菌株在1%甲醇中进行诱导分泌表达,并对表达产物进行SDS-PAGE、Western blot分析。结果显示,IBV S1基因在毕赤酵母中成功获得了表达,表达蛋白的分子量约为76 000,能与IBV阳性血清特异性结合,表达的蛋白占上清中总蛋白量的12.5%。     

表达鸡传染性支气管炎病毒S1基因重组腺病毒的构建

为构建表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)主要免疫原S1蛋白的重组腺病毒,本研究以复制缺陷型人5型腺病毒为载体,以IBVCK/CH/LHLJ/04V株S1基因为外源插入靶基因,通过细菌内同源重组法构建了一株稳定表达IBVS1蛋白(90ku)的重组腺病毒,命名为rAdV-S1。通过PCR鉴定、间接免疫荧光及western blot检测证实S1蛋白在重组腺病毒中获得表达。对构建的重组腺病毒和亲本腺病毒的生长动力学分析表明,该重组病毒的毒价为108.25TCID50/mL,并且两者在生长动力学方面无显著差异。本研究为动物试验和该重组腺病毒免疫特性的研究奠定基础。     

鸡传染性支气管炎病毒Holte株S1基因在昆虫杆状病毒系统的表达及其抗原性分析

为真核表达鸡传染性支气管炎病毒(IBV)S1蛋白并鉴定其抗原性,本研究采用RT-PCR方法扩增出IBV Holte株S1基因,并将其克隆于昆虫杆状病毒转移载体pFastBacHT中,通过大肠杆茵中同源重组构建重组杆粒Bacmid-S1,将重组杆粒转染至Sf9细胞中,获得含S1基因的重组杆状病毒.将该重组杆状病毒感染Sf9细胞进行表达,经间接免疫荧光、SDS-PAGE和western blot鉴定结果表明:IBV Holte株的S1蛋白能够在Sf9中以可溶形式表达,蛋白大小约为64 ku,该蛋白具有天然蛋白的抗原性.本研究为生产检测IB的诊断试剂和研制新型IB重组亚单位疫苗奠定基础.     

禽传染性支气管炎病毒S1基因玉米表达载体的构建

禽传染性支气管炎病毒主要编码3种结构蛋白,其中S蛋白的S1蛋白是宿主的主要保护性抗原,能诱导机体产生中和抗体和血凝抑制抗体,并与病毒的组织嗜有关.本研究选取具有代表性的禽传染性支气管炎病毒分离株SAIB14和SAIB4,以其S1基因克隆质粒pUCSAIB14和pUCSAIB4为模板,用具有高保真度的pfu酶分别扩增,得到含先导序列的S1基因片段.把扩增产物分别通过ClaⅠ和BamHⅠ酶切纯化,替换中间载体pUGFPocs的GFPm1基因,构建中间表达载本pUSAIB14和pUSAIB4.用KpnⅠ和HindⅢ双酶切重组质粒pUSAIB14和pUSAIB4,回收Ubi-S1-Tocs片段,定向插入到pCAMBIA 300载体的多克隆位点.经酶切和PCR鉴定,证明获得了S1基因的玉米表达载体pCUSAIB14和pCUSAIB4.外源基因导入受体植物能否有效表达,表达载体构建是关键因素,构建时选用表达载体的类型、启动子和终止子、目的基因插入位点等都有影响.本研究用BarHⅠ和ClaⅠ双酶切载体pUGFPocs,用S1基因扩增片段替换GFPm1基因,将S1基因置于Ubi启动子和T-ocs终止子的控制之下,有助于S1蛋白的高效表达,最后将Ubi-S1-Tocs单元HindⅢ和KpnⅠ双酶切下来,插入到pCAMBIA1300的多克隆位点,得到可用于农杆菌介导的转化或直接转化的植物表达载体pCUSAIB4和pCUSAIB14. Ubi启动子来自玉米,属组成型启动子,内含有一个内含子和外显子,是已知的最强的单子叶植物启动子,外源基因在Ubi启动子的控制下,在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达.pCAMBIA1300是中国农业科学院作物遗传育种中心构建的植物表达载体,可用于农杆菌介导的转化或直接转化,载体中T-DNA左右边界内带有多克隆位点和筛选标记Hyg基因,Hyg基因是玉米和水稻转化试验中广泛使用的标记基因,编码潮霉素磷酸转移酶,适于玉米和水稻转化后用化学试剂潮霉素进行筛选转化体.多克隆位点处可插入外源基因,在农杆菌介导的转化中,由于卸甲载体的作用,植物表达载体T-DNA左右边界内的序列,包括外源基因和筛选标记基因部分,发生转移并进入植物细胞内,用筛选试剂潮霉素可有效筛选出整合有外源基因的转化体.转基因植物疫苗生产技术是利用分子生物学技术把重组的疫苗基因导入植物,并使植物能够大量表达重组蛋白的一类生物技术.与常规疫苗及其它新技术疫苗相比,转基因植物疫苗具有生产简单、安全、廉价及保存和运输方便等优点,由于其应用前景可观,已引起免疫学家、分子生物学家和植物学家的极大兴趣与关注.利用该技术国外至今已获得成功的有乙型肝炎表面抗原、不耐热的肠毒素B亚单位(LT-B)、诺沃克病毒外壳蛋白、流感病毒血凝素和艾滋病病毒抗原、口蹄疫病毒抗原和鼻病毒抗原、痢疾抗原等10多种疫苗,国内在利用转基因植物生产疫苗的研究方面还远远滞后于其他国家.本研究利用含先导序列的禽传染性支气管炎病毒S1基因,构建了玉米表达载体系统,为进一步在玉米中表达IBV S1基因提供了基础材料.     

传染性支气管炎病毒S1基因遗传变异研究

本文利用计算机互联网分析了传染性支气管炎病毒（IBV）Buead株（呼吸型）和Z株（肾病型）S1基因的遗传变异规律。经与Genbank中50余个传染性支气管炎病毒的S1基因序列比较研究表明：Beaud株和Z株均存在着高度变异和相对保守区，两株病毒S1基因含有5－6个插入变异区。本文同时分析了两株病毒S1蛋白氨基酸序列的变异规律，研究表明：各株传染性支气管病毒之间S1蛋白的氨基酸序列有局部变异，其中105－106个氨基酸保持恒定不变。功能位点分析表明：Z株与Buead株抗原位点的位置和组成已发生变异，糖基化位点除Z株出现两个新位点外，其位置没有发生变化，但其组成已发生较多变异。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因在昆虫细胞中的表达

为获得具有天然活性的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)重组S蛋白,制备针对猪传染性胃肠炎S蛋白A、D抗原位点的单克隆抗体及建立快速抗体检测方法,本研究将TGEV S基因A、D抗原位点经PCR扩增并克隆入p Fast Bac HBM-TOPO载体,经转座、转染后获得重组杆状病毒,并对重组杆状病毒进行间接免疫荧光(IFA)及Western blot分析,结果显示,TGEV S基因A、D抗原位点在杆状病毒中成功表达,其表达产物为TGE诊断试剂的制备、基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

J亚群禽白血病病毒SU基因与兔IgG Fc基因在Sf9细胞中的融合表达

为获得J亚群禽白血病病毒(ALV-J)SU和兔IgG Fc的融合蛋白,采用PCR方法扩增出SUJ-IgG Fc基因,并克隆至pFastBac1质粒,构建转移载体pFastBac1-SUJ-IgG Fc;再将其转化DH10BacTM感受态细胞,获得重组杆状病毒穿梭质粒rBacmid-SUJ-IgG Fc;最后转染Sf9细胞,获得重组病毒rBac-SUJ-IgG Fc。免疫荧光试验结果显示,重组杆状病毒表达的融合蛋白可被ALV-J单抗JE9以及羊抗兔IgG所识别。Western blot结果显示:表达的融合蛋白与ALV-J单抗JE9以及羊抗兔IgG都有很好的反应性,其分子量大小约为95 ku。该融合蛋白的表达为鸡细胞表面ALV-J受体的研究提供了有力工具。     

表达传染性支气管炎病毒S1基因重组鸡痘病毒的构建

将鸡传染性支气管炎病毒S1基因插入到鸡痘病毒转移载体pSY681中，获得重组转移载体pSY681。将pSY681-IBVS1转染已感染亲本鸡痘病毒S-FPV-017株的鸡胚成纤维细胞，使其在鸡胚成纤维细胞内与鸡痘病毒基因组发生同源重组，产生表达鸡IBVS1蛋白的重组鸡痘病毒rFPV-IBVS1。在含有X-gal的营养琼脂培养基上进行蓝斑筛选且进一步纯化14代。S1基因的PCR检测表明，获得的含传染性支气管炎病毒S1基因的重组鸡痘病毒能够稳定遗传，间接免疫荧光和Western blot等试验证实该重组病毒在CEF内真实地表达了分子量约为90Ku的具有免疫学活性的IBV S1糖蛋白。     

鸡传染性支气管炎病毒核蛋白基因重组真核表达载体的构建

将已经序列测定的鸡传染性支气管炎病毒（IBV）HB株的核蛋白基因亚克隆到表达载体pcDNA3的KpnⅠ酶切位点，快速筛选鉴定出含有HB核蛋白基因的重组质粒，经酶切、PCR及Southern鉴定为正向插入了HB核蛋白基因，将其命名为pcDNA-N。对重组质粒进行大量扩增，应用聚乙二醇纯化后，对SPF雏鸡进行了免疫攻毒试验，结果表明，IBV核蛋白在抗感染和抗致死方面具有一定的作用。     

鸡传染性支气管炎病毒分离株核衣壳基因克隆、序列分析和真核表达

根据GenBank公开序列自行设计一对引物，采用RT—PCR扩增出鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus，IBV）W和C9001分离株完整的核衣壳（N）基因，并将其克隆至pMD18-T载体进行核苷酸序列测定和分析。结果表明，扩增的2个IBV分离株核衣壳基因片段长度均为1230bp，编码409个氨基酸，彼此间核苷酸和氨基酸同源性分别为88．0％和89．5％，与GenBank中有代表性的参考毒株相应基因核苷酸和氨基酸序列比较显示，w株核苷酸序列与GenBank中的广东分离株（AY646283）同源性最高，为94．1％，氨基酸序列同源性为94．6％；与国内部分毒株核苷酸序列同源性在86．1％～88．0％之间，氨基酸序列同源性在88．0％～90．7％之间；C9001株与国内部分毒株核苷酸序列同源性在86．4％～99．8％之间，氨基酸序列同源性在88．0％～99．8％之间。从核衣壳基因编码的氨基酸序列的系统进化树可见，W株与C9001株处于不同的进化分枝，亲缘关系较远。同时将核衣壳基因构建于真核表达质粒pVAX1中，用脂质体法将重组质粒转染入COS-7细胞中，间接免疫荧光检测出核衣壳蛋白的体外表达。研究结果为进一步研究IBV核衣壳蛋白的结构与功能以及基因工程疫苗的研制奠定了基础。     

传染性支气管炎病毒纤突蛋白S1基因的T/A载体克隆策略

参考Genbank收录的IBV纤突蛋白 (S1)基因序列 ,自行设计合成一对引物 ,对传染性支气管炎病毒 (IBV)江苏省地方分离毒株 (JS/95/0 3)RNA进行RT PCR扩增 ,产物经琼脂糖凝胶电泳分析 ,呈现一条 1716bp的条带 ,将其克隆入T/A质粒pMD18 T载体中 ,转化大肠杆菌JM10 9,挑选阳性克隆 ,用质粒少量提取法提取重组质粒 ,用EcoRⅠ和HindⅢ双酶切对重组克隆质粒进行鉴定 ,然后进行序列测定 ,证实为S1基因。将此重组质粒命名为pMDJS950 3S。     

Identification of a mimotope of an infectious bronchitis virus S1 protein

The S1 protein of the infectious bronchitis virus (IBV) is a major structural protein that induces the production of the virus-neutralization antibodies. The monoclonal antibody against the IBV M41 S1 protein was used as a target for biopanning. After three rounds of biopanning, randomly selected phages bound to the monoclonal antibody. Sequence analysis showed that the dominant sequence was SFYDFEMQGFFI. Indirect competitive enzyme-linked immunosorbent assay showed that SFYDFEMQGFFI is a mimotope of the S1 protein that was predicted by PepSurf. The mimotope may provide information for further structural and functional analyses of the S1 protein.     

鸡传染性支气管炎病毒HH06分离株的鉴定及其S1基因的分子特征

从黑龙江省哈尔滨市某鸡场疑似鸡传染性支气管炎的发病蛋鸡肾组织病料中分离到1株病毒，命名为HH06。该分离毒株经SPF鸡胚传代、血凝试验、负染电镜检查以及动物回归试验，证实为IBV。用RT-PCR扩增得到了HH06株S1基因片段，经测序，并与国内外IBV参考毒株的相应基因进行序列比较分析。结果表明，HH06株S1基因由1620个核苷酸组成，推导的多肽由540个氨基酸残基组成，推导的氨基酸裂解位点序列为5个连续碱性氨基酸HRRRR。HH06株S1基因序列与除LX4外的其他参考株相应基因的核苷酸及氨基酸序列同源性均较低，亲缘关系均较远。初步证实HH06株为不同于IBV疫苗株的一个新毒株。     

鸡传染性支气管炎山东A株病毒S1高可变区基因的克隆

参照国外已发表的M41高可变区Sl序列设计-对引物，跨度为1．7kb左右。采用差速离心法浓缩病毒，提取病毒RNA，经RT-PCR扩增，得到与设计同样大小的PCR DNA片段，将PCR产物纯化，与质粒载体(pGEM-T EasyVecTOR)连接，并转入大肠杆菌JMl09，获取阳性克隆。增菌培养后用小量碱提取法提取质粒，利用PCR扩增法与EooRI酶切分析进行鉴定。对阳性质粒DNA进行测序，利用0migaa2．0、Dnasis等分子生物学软件进行分析，并与标准M4l株、T株等进行序列比较，结果表明：山东传支A株与标准M41株同源性较高，最大同源率为99％；与标准T株同源性较差，最大同源率为80％。理论酶切图谱与M41相同，为同一基因型。     

鸡传染性支气管炎病毒分离鉴定及S1基因遗传演化分析

为调查辽宁地区鸡传染性支气管炎病毒(IBV)的流行及遗传演化情况,从辽宁某鸡场疑似鸡传染性支气管炎病料中分离得到1株病毒,经分子生物学检测、鸡胚矮小化试验、新城疫病毒血凝特性干扰试验和动物回归试验,确定该毒株为IBV,并命名为CH/LN/2019.扩增该毒株S1基因并进行序列分析发现,分离株S1基因全长1 620 nt...     

IBV D41株主要结构基因及3′端非编码区序列分析

采用反转录及聚合酶链式反应 ( RT-PCR) ,成功地扩增出鸡传染性支气管炎病毒 ( IBV)人工致弱毒D41株 S1基因、M基因、N基因和基因组 3′端非编码区 ( U TR)的 c DNA。序列测定结果表明 :D41株的 S1基因全长 1611bp(从 ATG到 S前体蛋白裂解位点 ) ,编码一条由 53 7个氨基酸组成的多肽 ;M基因全长 678bp,编码一条由 2 2 6个氨基酸组成的多肽 ;N基因全长 12 3 0 bp,编码一条由 410个氨基酸残基组成的多肽 ,3′端 UTR长度为52 5bp,其中高变区 ( HVR)长度为 2 2 5bp。与国内外已报道的一些 IBV标准毒株的相应基因序列进行核苷酸序列同源性分析后发现 :D41株与麻省血清型的毒株同源性最高 ,尤其与国际常用的标准疫苗株 H52和 H12 0的亲缘关系最接近。但它与国内“腺胃型”毒株 QXIBV在系统发生进化树上却相隔较远