猪传染性胃肠炎病毒S基因抗原位点片段的真核表达

为探讨利用转基因动物乳腺生物反应器生产基因疫苗的可行性,构建了以奶牛β-酪蛋白启动子为调控序列,增强型绿色荧光蛋白为报告基因的猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S基因抗原位点区乳腺表达载体pEGBS。通过脂质体介导方法将其转染小鼠乳腺癌细胞EMT6,在倒置荧光显微镜下可观察到明亮的绿色荧光分布于阳性细胞,并且RT-PCR检测结果显示,RT-PCR扩增产物与目的基因片段大小相符,证明其确实源于重组质粒转录后的mRNA。     

猪传染性胃肠炎病毒陕西株的分离鉴定

从陕西省某猪场临床上表现为腹泻症状的病死仔猪肠道内容物及粪便材料中分离获得1株病毒,采用PK-15细胞培养、理化试验及中和试验鉴定后,证实该分离株为猪传染性胃肠炎病毒(TGEV).克隆分离株N基因,并将该基因核苷酸序列和推导的氨基酸序列与其他不同来源的TGEV毒株进行比较分析.结果表明,分离株N基因与其他毒株核苷酸的同源性为94,3％～98.3％,氨基酸同源性为95.6％～99.4％.系统进化树结果表明,分离株与TGEV HN2002株(河南株)亲缘关系最近.     

毕赤酵母分泌表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白抗原位点的高密度发酵

本研究首先通过摇瓶培养方法,确定了表达猪传染性胃肠炎病毒S蛋白B和C抗原位点片段的毕赤酵母在BSM培养基中生长所需的最佳配方为甘油45 g/L、氨水单次补加量0.12%、甲醇流加量1.00%。然后采用分批补料培养方法对毕赤酵母GS115/pPIC9-TY进行高密度发酵,发酵液上清中蛋白的表达量为60.18 mg/L。本发酵工艺可实现酵母工程菌的高密度表达发酵,为下一步大规模化制备重组蛋白奠定了基础。     

猪传染性胃肠炎病毒spike蛋白C抗原位点的原核表达研究

为猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)的血清学检测方法的建立提供必要的诊断抗原,通过基因重组的方法,在大肠杆菌表达系统中表达了猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)spike蛋白C抗原位点。Western blot试验表明:表达的重组蛋白具有良好的抗原性。研究为TGEV血清学检测方法的建立提供了必要的物质基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S蛋白C和D抗原位点在大肠杆菌中的串联表达

使用大肠杆菌偏好性密码子人工合成了猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白C和D抗原位点多肽基因序列。依次将C和D抗原位点多肽基因序列克隆至表达载体p ET-32a中。将重组质粒转化大肠杆菌Rosetta(DE3),经IPTG诱导表达,收集诱导的菌液进行SDS-PAGE电泳和Western Blot分析。结果显示,在分子量25 k Da处有1条明显的蛋白表达条带,且能被TGEV阳性血清识别。本研究为TGEV的血清学检测方法的建立提供了必要的物质基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因A抗原位点序列的克隆与原核表达

将RT-PCR扩增的猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）S基因A抗原位点目的片段克隆、双酶切后连接于表达载体,经酶切、PCR和测序鉴定的阳性重组质粒转化BL21（DE3）,用IPTG诱导,进行SDS-PAGE和Western-blotting分析,确定目的蛋白的原核表达情况和免疫特异性。结果显示,目的片段的大小为534bp,序列分析表明,该基因与其他TGEV相应基因具有很高的同源性;Western-blotting检测可见分子质量约43 ku的融合蛋白条带,表明,该蛋白具有良好的反应原性。     

猪传染性胃肠炎病毒四川株M蛋白基因克隆分析及真核表达载体构建

猪传染性胃肠炎病毒(Porcine Transm issible Gas-troenteritis virus,TGEV)主要引起2周龄以内仔猪发生以严重急性腹泻、脱水及高死亡率为特征的猪传染性胃肠炎(TGE)。研究从猪传染性胃肠炎病毒四川株(SC-Y)中扩增克隆获得M蛋白基因,并成功构建了其真核表达载体,这为进一步深入     

猪传染性胃肠炎病毒S蛋白抗原表位C的串联表达研究

为比较含有猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白抗原表位C不同表位密度的重组蛋白的抗原性,本研究将抗原表位C的编码核酸序列进行串联,构建了重组表达质粒pET-(C_1C_2)_2~p ET-(C_1C_2)_6,并在原核表达系统中表达了重组蛋白。Western blot分析表明,表达的6种重组蛋白r-C_1C_2~r-(C_1C_2)_6均具有良好的抗原性。采用Dot-ELISA方法对各重组蛋白进行了抗原性比较分析。结果表明,含有12个表位肽的重组蛋白r-(C_1C_2)_6的抗原性强于其它重组蛋白。本研究制备的串联重组蛋白为建立TGE血清学诊断方法奠定了物质基础。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段在杆状病毒中的表达

应用RT-PCR方法扩增了猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)TH-98株S基因5′端含有B、C抗原位点的片段。将该片段亚克隆至杆状病毒转移载体pMelBac B中。重组质粒经纯化,与线性化的杆状病毒共转染Sf9昆虫细胞,经4轮蚀斑筛选,获得了纯化的重组病毒,最终实现了在昆虫细胞内的蛋白表达。经Dot-ELISA进行抗原性分析,结果表明重组蛋白具有抗原性。本研究猪传染性胃肠炎血清学诊断方法的建立提供了必要的物质基础。     

蚀斑克隆技术纯化猪传染性胃肠炎病毒分离株

为了研究猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus,TGEV)体外分离纯化方法,试验采用蚀斑技术对TGEV进行克隆纯化,建立了TGEV蚀斑形成方法,并利用该方法对含有TGEV的混合感染病毒进行3次克隆筛选,并对纯化后的病毒进行了一系列检测试验。结果表明:纯化后的病毒产生的蚀斑大小一致且RT-PCR检测TGEV阳性率为100%;对不同代次细胞毒进行RT-PCR检测结果均为阳性;间接免疫荧光试验中,病毒组有特异性荧光产生;直接负染法可看到典型的病毒结构,证明该克隆毒株在ST细胞上能够稳定增殖;纯化后的病毒效价有所提高。说明试验初步建立的TGEV蚀斑形成方法可用于分离毒基础生物学特性及病毒相关应用研究。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因A位点蛋白单克隆抗体的制备及鉴定

猪传染性胃肠炎(TGE)是由传染性胃肠炎病毒(TGEV)引起的高度接触传染性疾病,以仔猪呕吐、严重腹泻、脱水和高死亡率为临床特征.该病毒主要编码纤突蛋白(S)、膜结合蛋白(M)、核蛋白(N)和小膜蛋白(sM)4种结构蛋白[1-2].其中S蛋白是惟一能诱导机体产生中和抗体的结构蛋白[3].在S基因的近N端包含了4个主要的抗原决定位点A、B、C、D,其中诱导中和抗体产生的主要是A位点[4].此位点缺失可导致S蛋白不能产生中和抗体[3].本试验利用原核表达的TGEV S基因A位点重组蛋白免疫小鼠制备单抗,旨在为建立TGEV准确快速的病原诊断,以及探索相关药物治疗效果研究奠定技术平台.     

猪传染性胃肠炎病毒SC-H株的分离与鉴定

猪传染性胃肠炎(TGE)是由猪传染性胃肠炎病毒(Transmissible gastroenteritis virus of swine,TGEV)引起的猪的一种急性、高度接触性肠道传染病,临床症状主要表现为严重腹泻、呕吐和脱水.我国从20世纪60年代起就有TGE的报道,近些年来有进一步流行的趋势,尤其是冬季和早春寒冷季节常呈地方性流行,给养猪业造成了巨大的损失.     

猪传染性胃肠炎病毒国内分离株S基因克隆及与国外分离株的同源性比较

用猪睾丸细胞增殖并扩增猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）国内分离株TH－98，根据基因库中已发表的TGEV S基因cDNA序列，利用Oligo软件设计并合成2对引物，进行逆转录聚合酶合酶链反应（RT－PCR），扩增出2.3kb和2.1kb2个片段，即Sa与Sb。将Sa与Sb先后插入到pUC18质粒载体上的EcoRⅠ和PstⅠ多克隆位点上，构建了重组质粒pUC-S，根据TGEV S基因位点和pUC18的物理图谱，用相应的限制性内切酶进行酶进行酶切及套式PCR方法鉴定，分析，证明克隆的pUC-S为TGEV S基因，同时对pUC-S进行序列测定分析，并与来自美国，英国和日本的5个毒株进行核苷酸及编码氨基酸同源性比较，证明了S基因的高度保守性。     

猪传染性胃肠炎病毒S基因B和C抗原位点片段克隆序列分析及原核表达

猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)S蛋白可诱导中和抗体，是主要保护性抗原，N端抗原位点B和C在猪呼吸道冠状病毒(PRCV)中缺失。体外扩增TGEVS基因B、C抗原位点357bp片段(TS)。核苷酸序列与氨基酸同源性分析表明该片段较为保守。将TS克隆到原核表达载体pGEX-6P-1中，转化大肠杆菌中。经IPTG诱导后，SDS—PAGE分析目的蛋白与谷胱苷肽硫转移酶(GST，大小约为26ku)融合后大小约为40ku，目的蛋白分子量约为13．2ku，优化表达条件后表达量达37．9％。     

猪传染性胃肠炎病毒流行株的分离鉴定及其S基因序列分析

为了研究仔猪腹泻的病原,试验采用了猪髋动脉内皮细胞(PIEC)对流行病学调查中检测到的3份猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)阳性病料进行了培养、连续传代、PCR扩增、测序以及序列分析。结果表明:经过5代以后可以分离到1株出现典型细胞病变的病毒,其TCID50可达1×10-5.33/0.1 m L,经过多种病原PCR检测证实该病毒为TGEV,并命名为T04株;对其S基因进行测序和分析,可知T04与TGEV其他毒株的核苷酸同源性为96.7%~99.8%,氨基酸的同源性为96.0%~99.5%。说明该分离毒株为典型的TGEV毒株,且从进化树可以看出T04与FJ株的同源性最高。     

重组乳酸杆菌表达猪传染性胃肠炎病毒抗原表位

将猪传染性胃肠炎病毒S蛋白的抗原表位B、C片段插入到乳酸菌表面表达载体pLA上,通过多聚谷氨酸合成酶A蛋白(pgsA)锚定到细胞表面进行展示表达.经SDS-PAGE、免疫荧光技术和流式细胞术检测表明蛋白成功表达于菌体表面.Western-blot检测所表达的TGEV S蛋白具有与TGE病毒一样的抗原特异性.同时将重组菌株口服免疫BALB/c小鼠,间接ELISA分析结果表明,口服免疫能诱导机体产生明显的抗TGEV IgG和sIgA抗体,可诱导小鼠产生特异性黏膜免疫和体液免疫应答,且偏向Th1型细胞免疫反应.     

猪传染性胃肠炎S基因A D抗原位点在昆虫杆状病毒系统中的表达

猪传染性胃肠炎（Transmissible gastroenteritis，TGE）是猪传染性胃肠炎病毒（TGEV）引起猪的一种以严重腹泻、呕吐和脱水为主要临床症状的高度接触性传染病。该病对2周龄以内的仔猪具有高度致病性，致死率高达100％，是威胁养猪业发展的重要传染病。     

猪传染性胃肠炎病毒的分离试验

猪传染性胃肠炎(简称TGE)是由一种病毒引起的猪的急性传染病。1956年Fee和Efo等报导该病毒可在猪肾细胞培养物上传代,1963年Harada首次报导了TGE病毒在猪肾细胞培养物上能出现细胞病变(CPE)(1)。也有报导(2)TGE病毒可在鸡胚、猪肾细胞、猪脾细胞和狗肾细胞培养物内传代增殖。     

猪传染性胃肠炎病毒山东分离株SD-LY6的N蛋白基因序列分析及其表达纯化

为了获得能够用于猪传染性胃肠炎(TGE)鉴别诊断的抗原蛋白,本研究以猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)山东分离株SD-LY6核衣壳蛋白(N)基因为研究对象,对其进行引物设计并进行RT-PCR扩增,经克隆测序后对N蛋白基因序列进行分析;同时对N蛋白基因进行克隆,构建重组质粒pET-15b-TGEV-N,并进行IPTG诱导表达及纯化,利用SDS-PAGE和Western-blot进行检测。研究表明,TGEV SD-LY6株N蛋白基因序列高度保守,核苷酸以及氨基酸序列同源性均在97. 0%以上;获得了大小约为47 ku的纯化重组N蛋白,该重组N蛋白可以与猪传染性胃肠炎阳性血清发生特异性反应,具有较好的反应原性,与无关血清样本无交叉反应,可以作为TGE的诊断抗原,为下一步高效快速诊断方法的研究提供坚实的基础。     

猪传染性胃肠炎病毒LJ-12株的分离与鉴定

对黑龙江省某猪场腹泻仔猪的粪便进行病毒分离,获得1株疑似猪传染性胃肠炎病毒(TGEV),命名为LJ-12株。在原代猪肾细胞上盲传8代后细胞出现病变,用TGEV S基因的1段特异性引物进行RT-PCR方法检测,扩增出与预期结果相一致的约480 bp的目的基因片段;核酸序列测定结果表明该段基因与TGEV TH-98株的核苷酸同源性为98.5%,氨基酸同源性为98.8%;并通过间接免疫荧光试验,超薄切片电镜观察等方法确定该分离毒株为猪传染性胃肠炎病毒。