环介导等温扩增技术快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的研究

[目的]采用环介导等温扩增技术,快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌。[方法]以单核细胞增生性李斯特氏菌（CMCC54001）的hlyA基因作为靶基因,设计引物,观察检测结果。[结果]确定了环介导等温扩增技术检测单核细胞增生性李斯特氏菌的最适反应条件。采用该方法检测单核细胞增生性李斯特氏菌的灵敏度为4.2CFU/ml。[结论]该研究建立了环介导等温扩增技术单核细胞增生性李斯特氏菌的检测方法。     

单核细胞增生李斯特氏菌生物膜形成特性

[目的]研究单增李斯特氏菌生物膜的形成特性。[方法]采用24孔板法培养生物膜,分别采用结晶紫染色法和光学显微镜进行生物膜的定量和定性研究,观察在不同培养时间(8、16、24、32、40、48 h)单增李斯特氏菌生物膜的形成状况。[结果]随着培养时间的增加,单增李斯特氏菌生物膜生物量逐渐增加,生物膜经历了黏附、微菌落形成、大菌落形成到成熟的全部过程。[结论]试验结果为单增李斯特氏菌生物膜相关研究提供了理论依据。     

单核细胞增生性李斯特氏菌快速检测技术研究进展

单核细胞增生性李斯特氏菌(Listeria monocytogenes,IM)是主要食源性致病菌之一,可以引起严重的李斯特菌病.日益受到人们的重视,各种快速检测技术也迅速发展.综述了在单增李斯特菌检测时基于常规培养、分子生物学、免疫学和传感器的快速检测技术,并进行了探讨.     

食品中单核细胞增生李斯特氏菌快速检测方法的建立

建立了食品中单核细胞增生李斯特氏菌快速、敏感、特异的PCR快速检测方法。选取hlyA基因作为靶序列设计1对引物,在单核细胞增生李斯特氏菌中能扩增出356 bp的预期片段,大肠杆菌、沙门氏菌、葡萄球菌的扩增结果均为阴性,表现出极好的单增李斯特菌种特异性。纯培养的检测极限为46个细菌。用该方法对36份食品样品进行检测,检测结果与分离鉴定方法完全相符,表明该方法可适用于食品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测。     

畜禽产品中单核细胞增生李斯特氏菌的快速检测

单核细胞增生李斯特氏菌是重要的食源性致病菌,其检测周期经典方法至少要8～12 d,难以满足对外贸易的要求.作者介绍了快速检测方法的主要步骤,全部检测鉴定工作在2～5 d完成.并探讨了保证其结果可靠性的关键控制点.     

鸡肉中单核细胞增生李斯特氏菌的分离与鉴定

对从长春地区某一肉鸡屠宰加工厂扦取的１５２个东鸡肉样品进行的单核细胞增生李斯特氏菌分析,对分离菌株用ＡＰＩ Ｌｉｓｔｅｒｉａ试剂盒及其他方法进行了鉴定。经检验,１５２个样品中有１６个样品（１０．５％）为单核细胞增生李斯特氏菌阳性,另有８７个（５７．２％）为Ｌ．ｉｎｏｃｕａ,Ｌ．ｗｅｌｓｃｈｉｍｅｒｉ和Ｌ．ｇｒａｙ阳性。为了比较ＯＸＡ和ＰＡＬＣＡＭ这２种选择培养基的单核细胞增生李斯特氏菌的分离效果,     

荧光定量PCR检测单核细胞增生性李斯特氏菌

[目的]建立一种快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的实时荧光定量PCR方法。[方法]针对单核细胞增生性李斯特氏菌的特异基因hlyA,结合锁定寡核苷酸（LNA）,设计引物和探针,利用阳性质粒和模拟标本建立单核细胞增生性李斯特氏菌实时定量荧光PCR检测方法。[结果]以单核细胞增生性李斯特氏菌为模板克隆了hlyA基因,得到阳性质粒,并进一步建立了荧光定量PCR方法,得到标准曲线Y=-3.273 X＋37.640,相关系数R2=1.000;该方法的灵敏度可以达到1.2×10 CFU/ml;人工污染猪肉检出限可以达到3.2×102 CFU/ml。[结论]建立了快速检测单核细胞增生性李斯特氏菌的实时荧光定量PCR方法,为实现食品中单核细胞增生性李斯特氏菌的快速检测构建了一个技术平台。     

单核细胞增生性李斯特氏菌virR和mprF基因分布

为了研究virR和mprF基因在单核细胞增生性李斯特氏菌中的分布状况,为单核细胞增生性李斯特氏菌的防治及追踪污染源提供依据,本试验以分离自石家庄、保定地区的生鲜肉、水产品、速冻食品等6类不同来源共189株单核细胞增生性李斯特氏菌菌株为研究对象,利用热启动PCR技术对virR和mprF基因的分布进行了检测。结果表明:virR基因的总检出率为92.1%,mprF基因的总检出率为96.3%,且同时含有这2个基因的概率为91.5%;食品来源不同,单核细胞增生性李斯特氏菌virR、mprF基因的检出率稍有差异,且同一来源的菌株其mprF的检出率都稍高于virR,这表明不同的基因在单核细胞增生性李斯特氏菌中的分布存在差异。     

食品中单核细胞增生李斯特氏菌的检测方法研究进展

单核细胞增生李斯特氏菌是一种重要的食源性致病菌,广泛分布于自然界。针对目前单核细胞增生李斯特氏菌的检测现状,总结了4种现行有效的常用检测方法,并对各种检测方法的优缺点进行了分析比较。实时荧光定量PCR检测技术,可精确定量、反应迅速、信号重复性好、灵敏度和特异性高,不需要凝胶电泳过程,避免了扩增产物对环境造成的污染问题,将是未来分析检测发展的一个主要趋势。     

苜蓿根腐病菌(Fusarium solani)的LAMP快速检测方法

通过比较茄镰刀菌(Fusarium solani)与其近缘种之间的TEF-1α(translation elongation factor-1 alpha)基因序列差异,设计并筛选出一套对茄镰刀菌具有种特异性的LAMP引物,建立了检测苜蓿根腐病菌的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术体系,并进行了特异性和灵敏度验证。该方法在64℃等温条件下进行核酸扩增反应60 min,即可肉眼根据反应液颜色变化判定扩增产物。在特异性实验中,仅茄镰刀菌的DNA在检测后呈绿色的阳性反应,而其它供试菌株的DNA均呈橙色的阴性反应。该方法对目标病菌DNA的最低检测限为10 fg/μL,同时还可检测出苜蓿发病组织中的目标菌,因此,该方法具有快速、准确和灵敏的优点。     

苜蓿根腐病菌(Fusarium solani)的LAMP快速检测方法

通过比较茄镰刀菌(Fusarium solani)与其近缘种之间的TEF-1α(translation elongation factor-1 alpha)基因序列差异,设计并筛选出一套对茄镰刀菌具有种特异性的LAMP引物,建立了检测苜蓿根腐病菌的环介导等温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术体系,并进行了特异性和灵敏度验证。该方法在64℃等温条件下进行核酸扩增反应60 min,即可肉眼根据反应液颜色变化判定扩增产物。在特异性实验中,仅茄镰刀菌的DNA在检测后呈绿色的阳性反应,而其它供试菌株的DNA均呈橙色的阴性反应。该方法对目标病菌DNA的最低检测限为10 fg/μL,同时还可检测出苜蓿发病组织中的目标菌,因此,该方法具有快速、准确和灵敏的优点。     

LAMP检测沙门氏菌方法的建立

环介导等温扩增(LAMP)是利用设计的4条特殊引物和具有链置换活性的DNA聚合酶,在恒温条件下特异、高效、快速地扩增DNA的新技术。研究选取沙门氏菌编码DNA解旋酶B亚单位的gyrB基因设计了1套引物,总反应体系25μL,63℃恒温1 h,用LAMP对9株沙门氏菌属扩增的结果均为阳性,而大肠杆菌O216等7株致病菌株扩增的结果均为阴性;LAMP的灵敏度为6.8×101cfu/mL。LAMP检测方法更快速、灵敏,有着较为广泛的发展前景。     

番茄黑环病毒RT-LAMP检测方法的建立

为了快速有效地检测出植物样品中的番茄黑环病毒(tomato black ring virus,TBRV),根据TBRV的保守序列设计RT-LAMP反应的特异引物,通过试验成功建立了TBRV的RT-LAMP特异性检测方法。该方法检测快速,约27 min即可检测到扩增曲线;特异性强,可有效区分同样侵染马铃薯的马铃薯A病毒(PVA)、马铃薯Y病毒(PVY)、番茄斑萎病毒(TSWV)及番茄环斑病毒(ToRSV);灵敏度高,比普通RT-PCR灵敏度至少高10倍;并可通过肉眼观察反应颜色的变化直接进行结果判断。该方法适用于TBRV的快速检测。     

嗜水气单胞菌LAMP的快速检测方法研究

利用环介导等温扩增技术(LAMP)建立了一种对嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)进行快速检测的方法。基于嗜水气单胞菌tbp A基因,设计了一套引物,并优化了反应体系的温度、时间和Mg2+浓度,分析了该方法的特异性与灵敏度。结果表明,在59℃条件下,LAMP的最适扩增时间为40 min,能有效检测到1 pg/μL核酸浓度,且检测出嗜水气单胞菌为阳性,其他菌株为阴性,该方法耗时短,灵敏度高,特异性好,适合嗜水气单胞菌的快速检测。     

反转录-环介导等温扩增技术(LAMP)快速检测马铃薯病毒

为寻求低成本快速准确灵敏度高的马铃薯病毒检测方法,根据马铃薯X病毒(Potato virus X,PVX)、马铃薯Y病毒(Potato virus Y,PVY)和马铃薯卷叶病毒(Potato leafroll virus,PLRV)的外壳蛋白基因序列设计4条特异引物,建立LAMP检测技术。结果表明:LAMP检测方法灵敏度下限是10个拷贝的病毒量,该方法检测PVX、PVY和PLRV特异性好,灵敏度高,1h可完成检测,且检测成本低。     

环介导等温扩增技术检测沙门氏菌反应体系的优化

[目的]建立快速检测沙门氏菌的环介导等温扩增（LAMP）技术。[方法]以沙门氏菌的特异性基因（invA）序列为靶序列设计引物,并对该序列进行等温扩增;对Mg2＋浓度、反应温度和反应时间扩增条件进行优化,并对沙门氏菌进行检测和鉴定。[结果]在Mg2＋浓度为2.0mmol/L时,62℃反应40min,扩增可达最佳效果,LAMP法检测的灵敏度为7.8cfu/ml。[结论]建立了快速检测沙门氏菌的LAMP技术,该方法灵敏度高、耗时短、方法简便,便于在基层推广,为检测食源性致病菌构建了一个技术平台。