肌肉生长抑制素(MSTN)对肌肉调控的分子作用机制

肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)是肌肉生长的负调控因子,抑制成肌细胞的增殖和分化.MSTN作为胞外信号分子可与成肌细胞膜上的受体结合引起受体自身的磷酸化,启动细胞内一系列信号传导过程,作用于生肌决定因子(MyoD)靶基因的调控区,调节肌肉组成蛋白和蛋白基因的表达.     

干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞增殖分化的影响

为研究肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）对牛骨骼肌卫星细胞增殖与成肌分化的影响,本试验以牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型为对象,以前期设计合成3个干扰RNA（si-MSTN-1、si-MSTN-2、si-MSTN-3）并对其进行干扰效果筛选为基础,将干扰效果极显著的si-MSTN-2（si-MSTN）转染牛骨骼肌卫星细胞,通过EdU染色法检测干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞增殖的影响;进一步对干扰MSTN的牛骨骼肌卫星细胞进行体外成肌诱导分化,通过肌管形成状态和分化标志因子综合分析干扰MSTN对牛骨骼肌卫星细胞分化的影响：首先通过显微镜观察牛骨骼肌卫星细胞分化时期的肌管形成状态,然后利用实时荧光定量PCR和Western blotting技术检测牛骨骼肌卫星细胞分化标志因子MyoG和MyHC在mRNA和蛋白水平的表达情况。结果显示,干扰MSTN后,牛骨骼肌卫星细胞中EdU阳性细胞率极显著增加（P < 0.01）,说明下调MSTN表达极显著促进了牛骨骼肌卫星细胞的增殖;牛骨骼肌卫星细胞诱导分化后形成的肌管数量和直径均呈现增大趋势,牛骨骼肌卫星细胞成肌分化标志因子MyHC在mRNA和蛋白水平的表达均极显著高于对照组（P < 0.01）,说明下调MSTN表达能够促进牛骨骼肌卫星细胞的成肌分化过程。本研究结果表明,干扰MSTN可以显著促进牛骨骼肌卫星细胞的增殖及成肌分化过程。本试验结果为进一步开展MSTN对牛骨骼肌卫星细胞成肌分化的调控机制研究提供了参考。     

Myostatin通过ERK1/2-PPAR-γ通路抑制猪皮下脂肪前体细胞成脂分化的研究

旨在探讨细胞外信号调节激酶1/2-过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(ERK1/2-PPAR-γ)信号通路在肌肉生长抑制素(MSTN)抑制猪皮下脂肪前体细胞(PSPAs)成脂分化中的作用。PSPAs在诱导分化培养液(DIM)处理同时,随机分3组：对照组(0 ng/mL MSTN)、100 ng/mL MSTN组(100 ng/mL MSTN)以及ERK1/2特异性抑制剂PD98059和100 ng/mL MSTN联合组(PD98059+100 ng/mL MSTN)。采用细胞计数试剂盒-8 (CCK-8)检测细胞增殖活力,油红O染色法及甘油三酯(TG)定量分析成脂分化,使用荧光定量PCR(RT-qPCR)和Western blot法检测过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPAR-γ)、CCAAT/增强子结合蛋白-α(C/EBP-α)、脂肪酸合成酶(FAS)、乙酰辅酶A羧化酶(ACC)、细胞外信号调节激酶(ERK)及其磷酸化ERK(p-ERK)表达。结果表明：细胞增殖活力在3组间无显著性差异(P>0.05)。与对照组相比,100 ng/mL MSTN处理48 h后细胞内脂滴沉积量、油红O阳...     

肌肉生长抑制素对骨骼肌作用研究进展

肌肉生长抑制素(MSTN)是转化生长因子β超家族的成员之一,又称生长分化因子8。MSTN主要在骨骼肌中广泛表达,并可在心肌、脂肪、乳腺等多个组织中表达,其作用主要体现在抑制骨骼肌生长发育、诱发肌萎缩等方面。MSTN可以通过多种途径协同作用于骨骼肌,即通过激活TGF-β、p38MAPK、ERK1/2、JNK等信号途径以及抑制IGF-AKT、Wnt信号途径来抑制肌细胞增殖分化;通过调控AKT途径、泛素-蛋白水解酶系统、自噬溶酶体系统来影响骨骼肌蛋白的合成与分解;MSTN还参与了与骨骼肌生成相关的脂肪代谢及骨形成等生理活动。论文重点阐述MSTN在肌细胞增殖分化、肌蛋白合成与分解、脂肪代谢、骨骼发育等方面的作用机制,并对其应用前景进行展望,为相关科学研究提供参考。     

牛畸胎瘤衍化生长因子TDGF1基因过表达对成肌细胞增殖的影响

为明确牛畸胎瘤衍化生长因子(TDGF1)对成肌细胞(C2C12)增殖的影响,利用定向克隆和细胞转染技术获得可稳定过表达牛TDGF1基因的C2C12细胞系,Western blot(WB)和荧光定量PCR技术检测TDGF1在C2C12细胞系中的表达量,MTT法检测C2C12细胞的增殖。结果表明,成功构建了pIRES2-EGFP-TDGF1真核表达载体,牛TDGF1基因在C2C12细胞中的表达量显著上调,并成功表达出TDGF1蛋白,且过表达牛TDGF1基因可抑制C2C12细胞增殖,在转染30h时抑制作用最显著。     

肌肉生成抑制素基因的研究

动物肌肉生成抑制素(Myostatin,MSTN)是Mcpherron等研究小鼠转化生长因子-β(TGF-β)超家族时发现的一种新的生长因子。当时命名为生长分化因子-β(GDF-β),后经研究发现,其对骨骼肌的生长具有负调控作用,因此改名为肌肉生成抑制素[1-3]。该基因编码的蛋白质对骨骼肌有负调控作用,动物缺乏MSTN时出现肌肉增大,骨骼肌肌群分布广,而且不增生脂肪等现象。MSTN主要在胚胎期的骨骼肌中表达,它的缺失使一些动物表现双肌性状[4-7]。1MSTN基因的发现及组织分布Mcpherron等(1997)根据TGF-β超家族的保守区设计一对简并引物,通过PCR扩增…     

干扰MSTN对绵羊成肌细胞增殖分化及相关基因表达的影响

旨在探讨MSTN基因对绵羊成肌细胞增殖和分化的作用及相关机制,进一步揭示MSTN在绵羊成肌细胞中的生物学功能。本研究利用重组腺病毒介导shRNA干扰绵羊成肌细胞内源性MSTN基因表达,通过CCK-8法检测成肌细胞增殖能力,流式细胞仪检测细胞周期变化,qRT-PCR检测p21基因表达。成肌细胞诱导分化后利用免疫细胞化学技术检测肌管的形成情况,统计细胞融合率,qRT-PCR检测诱导48、72、96h后MyoD、MyoG、Myf5、Myf6和HACD1基因的表达量变化。结果发现,干扰MSTN后成肌细胞的增殖受到抑制,细胞周期停滞在G0/G1期,并且p21的表达呈上升趋势。在对成肌细胞分化作用的研究中,发现干扰组与阴性对照组相比,诱导48h4个生肌调节因子的表达量均呈下降趋势,MyoG基因表达显著下调(P0.05);诱导72h干扰组成肌细胞融合率极显著高于阴性对照组(P0.01),Myf5和Myf6基因表达量极显著降低(P0.01),MyoD基因表达量升高不显著(P0.05),MyoG基因表达量极显著增加(P0.01),诱导96h,Myf5基因表达量显著降低(P0.05),MyoD基因表达量降低不显著(P0.05),MyoG基因表达量极显著降低(P0.01),Myf6基因表达量升高不显著(P0.05)。另外诱导72h,HACD1基因的表达量在干扰组中显著高于阴性对照组(P0.05),诱导48和96h无显著变化。研究表明,干扰MSTN表达对成肌细胞的增殖有抑制作用,对分化有促进作用,HACD1基因与成肌细胞融合相关。     

肌肉生长抑制素在动物生产中的应用

肌肉生长抑制素(MSTN)属于TGF-β超家族成员,是骨骼肌生长发育的负调节因子。MSTN作为胞外信号分子可与成肌细胞膜上的受体结合引起受体自身的磷酸化,启动细胞内一系列信号传导途径,作用于生肌决定因子(MyoD)靶基因的调控区,调节肌肉组成蛋白基因的表达,从而对骨骼肌的生长发育进行调控。     

肌抑素对PK15细胞MMP-2/7/9表达的影响

本研究旨在揭示肌抑素(MSTN)与基质金属蛋白酶(MMPs)的调控关系,探明MSTN对PK15细胞MMP-2/7/9表达的影响。对MSTN单等位基因敲除猪背膘组织进行转录组测序分析,复苏前期制备的MSTN基因敲除PK15细胞系:单等位基因敲除的PK3108细胞系和双等位基因敲除的L18细胞系,通过实时荧光定量PCR和Wesrern blotting分别检测PK15、PK3108和L18细胞系中MSTN、MMP-2/7/9基因的mRNA和蛋白表达水平。结果发现,与野生型猪相比,MSTN单等位基因敲除猪背膘组织转录因子C/EBPδ、MMP-2/7基因mRNA表达量均极显著下调(P0.01);细胞外基质中纤连蛋白(FN)和层连接蛋白(LN)含量均极显著增加(P0.01)。复苏的PK3108和L18细胞呈现绿色荧光。实时荧光定量PCR结果显示,PK3108和L18细胞中MSTN、MMP-2/7/9的mRNA表达量均极显著低于PK15细胞(P0.01);Western blotting结果显示,PK3108和L18细胞中MSTN、MMP-2/7/9的蛋白表达量均明显低于PK15细胞。本研究结果表明,在MSTN基因敲除的PK15细胞中,MSTN功能缺失能显著降低MMP-2/7/9的表达,且MMP-2/7/9蛋白表达降低的趋势与MSTN蛋白表达的趋势相一致。     

MSTN基因对牛肌动蛋白细胞骨架调节通路的影响

为探究肌肉生长抑制素（myostatin,MSTN）对牛骨骼肌生长发育的作用机制,本研究前期利用定量蛋白质组学与磷酸化蛋白质组学分析野生型蒙古牛（MG.WT）和MSTN^+/-蒙古牛（MG.MSTN^+/-）腿臀肌肌肉组织中蛋白质水平和磷酸化修饰水平的差异变化,使用已建立的牛骨骼肌卫星细胞体外诱导成肌分化模型,检测设计合成的MSTN siRNA （si-MSTN）干扰效果;采用实时荧光定量PCR和Western blotting方法检测转染si-MSTN的增殖期（GM）和分化第3天（DM3）牛骨骼肌卫星细胞中肌动蛋白细胞骨架调节通路相关基因的mRNA和蛋白水平的表达变化,研究敲低MSTN表达对肌动蛋白细胞骨架调节通路的影响。结果显示,在MSTN^+/-蒙古牛肌肉组织中共鉴定到16个肌动蛋白细胞骨架调节通路相关基因表达丰度上调;转染si-MSTN细胞中的MSTN表达水平极显著降低（P<0.01）;在转染si-MSTN的GM期牛骨骼肌卫星细胞中,肌动蛋白细胞骨架调节通路相关基因ENAH、ACTN4和Cdc42的mRNA水平均显著升高（P<0.05）,PFN1、RhoA和ACTN4的蛋白水平均显著或极显著升高（P<0.05;P<0.01）;在转染si-MSTN的DM3牛骨骼肌卫星细胞中,ENAH、CFL1、SCIN和Cdc42基因mRNA水平均显著升高（P<0.05）,RhoA基因mRNA水平极显著升高（P<0.01）,PFN1和ACTN4的蛋白水平均显著升高（P<0.05）。结果表明,干扰MSTN可以促进肌动蛋白细胞骨架调节通路相关基因的表达,探明了MSTN可能通过介导肌动蛋白细胞骨架调节通路影响牛骨骼肌卫星细胞增殖和成肌分化的分子机制,为进一步研究MSTN对牛成肌分化的调控机制提供参考。     

肌肉生长抑制素(MSTN)对猪前体脂肪细胞增殖和成脂分化的影响

为探讨肌肉生长抑制素(MSTN)对猪前体脂肪细胞增殖和成脂分化的影响,本研究以原代培养的断奶猪前体脂肪细胞为研究对象,分别以0 ng/mL(对照组)、25、50和100 ng/mL的MSTN重组蛋白处理细胞,采用油红O染色和提取法定量分析细胞内脂肪生成和成脂分化程度,使用荧光定量PCR和Western blot分析脂肪细胞分化标志基因过氧化物酶体增殖物激活受体-γ(PPAR-γ)、脂肪合成关键酶脂肪酸合成酶(FAS)和乙酰辅酶A羧化酶(ACC)的表达,探讨MSTN调控猪前体脂肪细胞成脂分化可能的分子机制。结果显示,处理48 h后,与对照组细胞相比,25和50 ng/mL MSTN处理对细胞增殖活力无显著影响,而100 ng/mL MSTN可显著提高猪前体脂肪细胞增殖活力。油红O染色及提取结果表明,MSTN呈剂量依赖性抑制猪前体脂肪细胞的成脂分化。进一步研究表明,与0 ng/mL MSTN组细胞相比,100 ng/mL MSTN处理组细胞中MSTN表达量显著升高,而PPAR-γ、FAS和ACC的mRNA和蛋白表达均显著降低。研究表明,MSTN抑制猪前体脂肪细胞的成脂分化,效果呈剂量依赖性,此抑制作用可能是通过抑制PPAR-γ的表达,进而抑制脂肪的合成来实现的。     

绵羊胚胎发育中后期骨骼肌BTG2/3的表达动态及其与Myostatin的关系

旨在探究绵羊胚胎中后期骨骼肌BTG2/3(B cell translocation gene 2/3)的动态表达情况,探索肌肉生长抑制素(Myostatin,MSTN)基因对其表达的影响。以特克赛尔(Texel)和乌珠穆沁(Ujimqin)绵羊85、100、120和135d4个不同发育阶段的胎儿背最长肌为研究对象,利用Real-time PCR技术分别检测MSTN及BTG2/3的表达差异;选取100d各胚胎半膜肌、背最长肌、半腱肌和股四头肌检测不同组织BTG2/3的表达差异;构建稳定慢病毒干扰载体pFU-GW-myostatin,分别感染处于增殖和分化阶段的绵羊成肌细胞,检测BTG2/3表达水平变化。结果显示,随着胚胎生长,特克赛尔羊胎儿MSTN表达量持续下降,而乌珠穆沁羊胎儿先下降后上升,特克赛尔羊胎儿BTG2表达量呈先升高后降低趋势,而乌珠穆沁羊表现出先降低后升高再降低的趋势;BTG3的表达量在特克赛尔羊与BTG2表达趋势相同,而乌珠穆沁羊则与BTG2相反;100d胎儿4种不同骨骼肌组织中,特克赛尔羊与乌珠穆沁羊相比,背最长肌和半腱肌中BTG2表达量极显著偏高(P0.01),而半膜肌和背最长肌中BTG3表达量极显著偏低(P0.01);慢病毒干扰载体对成肌细胞具有较高的感染和干扰效率,增殖和分化阶段的成肌细胞被MSTN干扰后,BTG2和BTG3表达量极显著降低(P0.01)。综上表明,BTG2和BTG3对绵羊胎儿中后期骨骼肌发育有重要作用,可能参与myostatin调节通路。本研究对绵羊胚胎发育过程的分子机制研究具有重要意义。     

LiCl激活经典Wnt信号通路诱导猪骨骼肌卫星细胞向慢肌分化

Wnt/β-catenin信号通路参与调控细胞的增殖及分化,决定细胞的命运。LiCl通过抑制GSK-3β(glycogen synthetase kinase-3β)稳定细胞内β-catenin的表达。为研究Wnt/β-catenin信号通路在哺乳动物骨骼肌卫星细胞成肌分化过程中的作用。以原代培养猪骨骼肌卫星细胞为实验材料,将其培养在含有1%CEE和20%胎牛血清的GMEM培养液中,再用15 mmol/L LiCl诱导分化,并采用免疫荧光染色和Western blotting等方法检测经典Wnt信号通路中相关因子及成肌分化过程中细胞的蛋白表达。结果表明:LiCl处理猪骨骼肌卫星细胞后促进分化,p-GSK-3β、β-catenin、myosin及慢肌蛋白增加,p-β-catenin、GSK-3β及快肌蛋白减少,并且核内源性β-catenin增多。结果提示,激活Wnt/β-catenin信号通路促进骨骼肌卫星细胞成肌分化,并且诱导其向慢肌分化。     

吐鲁番黑羊MSTN/Smad信号通路基因表达的发育性变化

为探讨MSTN/Smad信号通路基因对吐鲁番黑羊肌肉生长发育的影响,采用实时定量PCR法,分别对1～6月龄吐鲁番黑羊的腿肌和尾脂MSTN/Smad信号通路基因进行检测.结果表明：MSTN/Smad信号通路基因在腿肌和尾脂组织中均有表达,MSTN/Smad信号通路基因在吐鲁番黑羊不同生长阶段的腿肌和尾脂中的表达没有出现随月龄的增加而一直增加或下降的趋势.     

辽育白牛MSTN基因分子克隆及序列分析

肌肉生长抑制素(简称MSTN)是肌肉发育负调控因子,为了实现将来对辽育白牛的分子育种,本试验对MSTN分子特征及其靶MicroRNA进行了分析。以辽育白牛为研究对象,利用分子生物学技术,设计特定引物对辽育白牛MSTN基因的编码区和调控区分段PCR扩增,并进行克隆和测序。借助生物信息学分析软件,寻找各个区域的单核苷酸多态性(SNP)并分析了MSTN基因分子特征、组织表达谱以及3'非翻译区靶标rniRNA。试验表明,MSTN基因5'调控区SNPs使启动子位置和转录因子结合情况发生变化,但编码区的突变未造成氨基酸改变。辽育白牛MSTN编码区序列全长为1 128 bp,编码375个氨基酸,该蛋白存在信号肽序列,为分泌性蛋白,疏水性较弱且不稳定。辽育白牛MSTN基因在不同组织中具有表达差异性,且肌肉中表达量最高。3'UTR存在肌肉生长发育功能miRNA,且比较保守。为开展辽育白牛分子育种研究奠定理论基础。     

干扰MSTN的牛骨骼肌卫星细胞实时荧光定量PCR内参基因的筛选

为了筛选在牛骨骼肌卫星细胞(MSCs)分化前后稳定表达以及不受MSTN基因表达影响的内参基因,试验以野生组(WT)、转染干扰MSTN组(si-MSTN)和对照组(NC-MSTN)的牛MSCs作为样品,选取HMBS、B2M、GAPDH、TUBB、SDHA、18S rRNA、ACTB、RPL4、PPIA、HPRT1和YWHAZ作为候选内参基因,采用实时荧光定量PCR技术Ct值分析法对各候选内参基因的相对表达进行测定,首先利用3个独立评价软件geNorm、NormFinder和BestKeeper分别对各候选内参基因在野生组牛MSCs增殖期(GM)和分化第3天(DM3)细胞中的表达稳定性进行评价,筛选出前5个表达相对稳定的候选内参基因;然后以此为基础,利用相同的方法分析MSTN干扰组和对照组增殖期和分化第3天的细胞中上述5个内参基因的表达水平和稳定性。geNorm、NormFinder分析结果均显示,HMBS、B2M、TUBB、GAPDH和ACTB在牛MSCs分化前后表达较稳定,BestKeeper分析显示ACTB和TUBB相关系数(r)排序靠前,GAPDH、HMBS和B2M排序不是很高,但是GAPDH的SD值最小,因此选择这5个候选内参基因做后续试验;在牛MSCs MSTN干扰组和对照组增殖期和分化第3天,geNorm、NormFinder软件分析结果显示,上述5个候选内参基因中GAPDH、TUBB和B2M表达最稳定,BestKeeper分析显示TUBB相关系数排名不是最高,但其SD值最小,综合以上分析,选择TUBB作为牛MSCs干扰组和对照组增殖期和分化第3天最适内参基因。研究结果可为以后进行牛MSCs在不同生长时期以及MSTN表达被调控后基因的表达分析提供参考。     

猪肌源性前体脂肪细胞的分离培养和成脂诱导分化研究

本研究旨在建立猪肌源性前体脂肪细胞的体外培养体系,并探究成脂诱导分化过程中相关基因的表达,为进一步研究调控猪肌内脂肪沉积的分子机制提供试验材料。采集15日龄仔猪的背最长肌组织,使用Ⅱ型胶原酶进行消化,分离获得前体脂肪细胞,进行原代、传代培养以及成脂诱导,观察细胞形态、测定生长曲线、油红O染色鉴定以及检测成脂关键基因PPARγ、FABP4、C/EBPα、C/EBPβ、ZFP423、SREBP1、PRDM16和HSL在诱导分化过程中的表达量。结果表明,分离的猪肌源性前体脂肪细胞在6～7 h,发现少量细胞开始贴壁,贴壁的细胞呈似圆型、小梭型以及其它不规则形状,经传代后细胞形态均一,呈典型的成纤维细胞样,细胞的生长曲线呈S型。添加分化培养基进行诱导后,所有基因在细胞分化的早期均有表达,FABP4、C/EBPα、SREBP1与PPARγ基因在分化早期表达量极显著升高(P 0. 01),在后期表达量极显著下降(P 0. 01),C/EBPβ、ZFP423和PRMD16基因的表达量在分化过程中未见显著变化,HSL的表达量随着分化进行极显著降低(P 0. 01)。在诱导分化12 d左右,油红O染色呈现红色。综上表明,本研究成功建立了猪肌源性前体脂肪细胞的分离与培养体系,进行成脂诱导分化,揭示分化过程中关键基因的表达规律,为进一步研究猪肌内脂肪沉积的分子机制和改善肉质品质奠定基础。     

动物肌生成抑制素基因的研究进展

肌生成抑制素(MSTN)基因是一种生长分化因子,表达产物主要调控骨骼肌生长发育。笔者介绍了该基因的特点、表达调控机理及其研究进展,并提出今后动物MSTN基因重要研究方向及意义。     

MSTN基因在贵州地方黄牛不同组织中mRNA表达量的研究

为了研究贵州地方黄牛不同组织中肌肉生长抑制素(myostatin,MSTN)基因mRNA的表达差异和表达规律,以4个品种贵州地方黄牛(关岭牛、思南牛、威宁牛和黎平牛)为试验动物,分别提取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脂肪和背最长肌的总RNA,设计MSTN实时荧光定量引物,以牛GAPDH基因作为内参,应用实时定量PCR技术检测MSTN基因在4个品种黄牛不同组织中mRNA的相对表达量,同时利用MAS3. 0在线软件分析MSTN基因功能。结果显示:MSTN基因在4个贵州地方黄牛的心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、脂肪和背最长肌中均有表达,在背最长肌中的表达量显著高于其他组织(P0. 05),不同品种之间MSTN基因在部分组织中的表达存在差异,且所分析的通路与机体生长发育和转录调控存在关联。研究表明MSTN基因在背最长肌中的表达量最高,品种对于MSTN基因的表达影响不大,而在不同组织中的表达量存在差异。     

肌生成抑制素基因研究进展

肌生成抑制素是 1 997年发现的骨骼肌生长发育负调控因子 ,肌生成抑制素不仅在骨骼肌中表达 ,还可在心肌和浦肯野纤维等多种组织中表达。研究表明 ,大鼠骨骼肌在体内的再生 ,对 MSTN m RNA的表达表现出明显的时间依赖性 ,并且 m RNA的表达不必由功能性神经支配。通过对不同品种双肌表型牛 MSTN基因的研究 ,发现其骨胳肌增大的共同特点是肌生成抑制素基因发生了突变 ,如布鲁牛 MSTN基因在编码区外显子 3发生 1 1 bp的缺失 ,导致MSTN此位点后的阅读框架改变 ,并在此点后的 1 4个密码子处终止了阅读框架 ,从而使MSTN被截短 ,MSTN蛋白活性区域消失 ,活性丧失 ,结果肌肉大量增加。目前 ,已分别对人、牛和猪的 MSTN基因进行了定位研究 ,猪肌生成抑制素基因定位研究表明 ,猪 MSTN基因位于1 5号染色体上。