小鼠对温和气单胞菌口服缓释微球疫苗的免疫应答

采用中华鳖温和气单胞菌(Aeromonas sobria,As)Z-1株灭活全菌液,以生物降解性高分子材料为载体,制成微球疫苗,口服免疫ICR小鼠,测定了血清中凝集抗体效价、血液中单核-巨噬细胞的吞噬活性以及对活菌攻击的免疫保护力.结果显示小鼠微球疫苗口服免疫后第4周,血清中凝集抗体效价和血液中单核-巨噬细胞的吞噬指数均可达到与灭活菌液注射组相当的水平(P＞0.05),明显高于灭活菌液口服组(P＜0.01);免疫后第7～12周,微球疫苗口服组血清凝集抗体效价显著高于灭活菌液注射组(P＜0.05);微球疫苗口服组和灭活菌液注射组的免疫保护力均为87.5%,而灭活菌液口服组不能提供有效的保护,与对照组死亡率相同(100%).结论认为,中华鳖气单胞菌口服微球疫苗具有缓释作用;以可生物降解的微球作为中华鳖气单胞菌口服疫苗的载体系统具有潜在的优势.     

2种益生菌菌体OMP对新城疫病毒免疫增强作用

为研究乳酸杆菌、地衣芽孢杆菌菌体OMP的免疫增强作用,本试验利用超声波细胞粉碎器破碎、TritonX-100处理技术提取了乳酸杆菌与地衣芽孢杆菌OMP,通过考马斯亮蓝G-250法测得两者菌体OMP含量,进行了SDS-PAGE电泳检测,然后将提取的菌体OMP以不同的方式、含量作为免疫增强剂与新城疫病毒尿囊液混合后再与油佐剂以1:3比例制备成免疫原,免疫7日龄雏鸡,通过持续10周的抗体检测、外周淋巴细胞比例(A)及白细胞吞噬指数(B)检测,判断菌体OMP对新城疫病毒具有免疫增强作用.结果,乳酸杆菌与地衣芽孢杆菌菌体OMP含量分别为2 323.5、867.6 mg/L;SDS-PAGE电泳试验得出分子量分别为6.4×104、8.6×104的乳酸杆菌、地衣芽孢杆菌菌体OMP蛋白含量多,带的颜色较深,为起主要作用的蛋白;各试验组HI抗体效价免疫保护期远远高于单独使用新城疫LaSota株灭活油苗的对照组及空白组,差异显著(P<0.01或P<0.05);各试验组外周淋巴细胞比例(A)及白细胞吞噬指数(B)均高于单独使用新城疫LaSota株灭活油苗的对照组及空白组,差异显著(P<0.01或P<0.05);同时还可以得出菌体OMP含量越高则HI抗体效价、淋巴细胞比例(A)、白细胞吞噬指数(B)均增高;不同菌体OMP混合免疫增强作用高于单独使用一种菌体OMP.由此表明乳酸杆菌、地衣芽孢杆菌菌体OMP能显著增强ND疫苗的免疫效果,为今后研制免疫效果更好地ND疫提供了技术支持.     

铜绿假单胞菌OprL基因DNA疫苗的免疫效果

为研究铜绿假单胞菌OprL基因DNA疫苗在小鼠体内的免疫效果,本研究利用PCR技术扩增得到铜绿假单胞菌的OprL基因,将其克隆于真核表达载体pcDNA3.1(+)中构建重组质粒pOPRL。将BALB/c小鼠分为5组,分别免疫pOPRL、油乳剂灭活疫苗、OMP疫苗、pcDNA3.1(+)空载体和PBS。每两周免疫一次,共免疫3次。间接ELISA检测免疫后血清特异性抗体水平,MTT法检测免疫小鼠脾淋巴细胞增殖情况,双抗夹心ELISA检测IFN-γ分泌情况,计算强毒攻击后各组小鼠的存活数及保护率。结果表明,随着免疫次数的增加,pOPRL、灭活疫苗和OMP疫苗免疫组小鼠产生的抗体水平逐渐升高,与两对照组相比差异极显著(p0.01),且灭活疫苗组和OMP疫苗组小鼠血清抗体水平高于pOPRL组(p0.05);灭活疫苗组和OMP疫苗组小鼠脾淋巴细胞的刺激值(SI值)和IFN-γ水平也高于pOPRL组(p0.05);pOPRL组、灭活疫苗组和OMP疫苗组对小鼠的保护率分别为53.3%、86.7%和73.3%,表明pOPRL疫苗虽可为小鼠提供一定的保护,但效果不如传统的灭活疫苗,还需采取措施进一步增强其免疫原性。     

嗜水气单胞菌重庆WL3-X2分离株灭活疫苗对大鲵的免疫保护效果的研究

为评估重庆地区分离的嗜气单胞菌WL3-X2分离株对大鲵的免疫原性,本研究将嗜水气单胞菌WL3-X2分离株经福尔马林灭活,作为免疫原,通过腹腔注射途径间隔2周两次免疫健康大鲵,并检测其体内血清抗体、溶菌酶、补体C3及其免疫保护效应。结果显示,免疫嗜水气单胞菌灭活菌能够显著提高大鲵血清抗体滴度、溶菌酶活性和补体C3含量,首免35 d后这3项指标均达到峰值。此外,对初免4周后的大鲵经肌肉注射0.2 m L浓度为1.0×10~8 cfu/m L剂量的嗜水气单胞菌WL3-X2分离株,进行攻毒保护试验。结果表明,免疫组的相对免疫保护率为66.7%。本研究结果表明,嗜水气单胞菌地方分离株灭活菌对大鲵具有显著免疫保护效力,可以作为大鲵预防嗜水气单胞菌感染的候选疫苗。     

团头鲂对3种致病菌外膜蛋白(OMP)的免疫应答

利用从柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)和温和气单胞菌(Aeromonas sobria)中提取的外膜蛋白(outer membrane protein,OMP)作为免疫原,注射接种团头鲂(Megalobrama amblycephala)后,通过测定受免鱼的交叉凝集抗体效价、肾脏和血液中吞噬细胞的吞噬活性和采用A.hydrophila活菌攻毒方法,比较了3种致病菌OMP对团头鲂的免疫原性。试验结果表明,从3种致病菌中提取的OMP对团头鲂均具有较强的免疫原性,受免鱼的血清中存在对3种致病菌的交叉凝集抗体,与对照鱼相比,肾脏和血液中吞噬细胞对吞噬原的吞噬活性和对A.hy-drophila活菌攻毒的相对免疫保护率(relative percent survival,RPS)明显上升。说明在3种致病菌的OMP上不同程度地存在共同保护性抗原。     

A3α肽聚糖对受免彭泽鲫免疫应答影响的研究

给彭泽鲫注射接种灭活嗜水气单胞菌苗，然后投喂含有肽聚糖的饲料，测定鲫鱼白细胞吞噬活性、血清和体表粘液溶菌酶活性、抗体效价以及活菌攻毒后的免疫保护率等免疫指标。结果：各项免疫指标显著提高，表明A3α肽聚糖可增强受免彭泽鲫的免疫应答效果。     

中华鳖对温和气单胞菌口服微球缓释疫苗的免疫应答

以中华鳖温和气单胞菌 (Aeromonas sobria,As) Z- 1株灭活全菌液 ,采用生物降解性高分子材料制成缓释微球疫苗 ,口服免疫中华鳖 ,测定血清中凝集抗体、血液中白细胞杀菌率以及对活菌攻击的免疫保护率。结果表明 ,中华鳖口服微球疫苗 ,其血清中凝集抗体效价和血液中白细胞杀菌百分率均可达到灭活菌液注射组相当的水平 (P>0 .0 5 ) ,显著高于对照组 (P<0 .0 1) ;微球疫苗口服组和灭活菌液注射组的免疫保护率分别为 94 .7%和 89.5 % ,两者差异不显著 (P>0 .0 5 ) ,而对照组小鼠 95 %死亡。采用可生物降解微球作为中华鳖气单胞菌口服疫苗的载体系统是可行的。     

蛋鸡首免乙型脑炎病毒后卵黄抗体变化规律的研究

本试验旨在研究疫苗、免疫剂量和注射方式对卵黄抗体效价规律的影响,探讨制备抗猪乙型脑炎病毒卵黄抗体蛋鸡的最佳免疫程序。选用无免疫褐羽蛋鸡180只,随机分成18组,每组10只。1、2组均为对照组,注射无菌生理盐水;3~10组采用皮下和肌肉两种注射方式,并依次注射灭活苗0.2、0.5、1.0和1.5 mL;11~18组同样采取两种注射方式,依次免疫相同剂量弱毒苗。各试验组分别于免疫前1 d、免疫后第3、7、10、14、18、21和28天采集当日鸡蛋6枚,提取卵黄抗体,测定效价。试验结果显示,1~6、11、12组卵黄抗体效价均为0,未产生明显免疫应答;7~10组注射灭活苗后7 d,平均卵黄抗体效价达到峰值,抗体持续时间为14 d;13~18组注射弱毒苗后14 d达到最高值,抗体持续时间为21 d;注射剂量相同但注射方式不同的两组之间比较,卵黄抗体效价差异不显著（P>0.05）;相同注射方式,相同疫苗的各试验组间,随着免疫剂量的增加卵黄抗体效价逐渐加强,且差异显著（P<0.05）。以上结果表明,肌肉或皮下两种注射方式,蛋鸡产生明显免疫应答至少需要免疫灭活苗1.0 mL或弱毒苗0.5 mL。比较弱毒苗与灭活苗,灭活苗刺激机体产生的抗体速度较快,但维持时间较短;较少剂量弱毒苗就可刺激机体产生抗体,但速度慢、维持时间长。     

佐剂对嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫效果的作用

制备嗜水气单胞菌J—1株福尔马林灭活疫苗，用浸浴法免疫银鲫。设疫苗加IMS1312佐剂免疫组、不加佐剂疫苗免疫组及未免疫对照组，每组20尾。18～20℃水温饲养35d，检测银鲫血清嗜水气单胞菌凝集抗体。佐剂组抗体效价达1：64，相对保护率为67％。不加佐剂免疫组抗体效价为1：32，相对保护率达56％。对照组抗体效价为1：4，相对保护率为10％。试验结果表明浸浴免疫对银鲫具有较好的保护力，佐剂IMS1312可增强鱼体的免疫应答。     

牛源空肠弯曲杆菌及其HSP43重组蛋白免疫原性研究

为评价牛源空肠弯曲杆菌(C.jejuni)及其HSP43重组蛋白(rHSP43)的免疫原性,本研究采用常规方法分别制备白油、铝胶佐剂和不加佐剂的全菌体免疫原和rHSP43免疫原,分别以不同剂量经皮下接种途径免疫6周龄小鼠,应用间接ELISA方法检测两种免疫原免疫小鼠后抗体消长情况,并通过攻毒实验评价其保护效果。结果显示,其产生的抗体水平白油佐剂组要高于铝胶佐剂组,两者明显高于未加佐剂组(p0.05)。在全菌体免疫原组中,5×109cfu/mL组免疫保护率高于5×107cfu/mL组,前者与5×105cfu/mL组相比较差异极显著(p0.01)。在小鼠免疫后21d以1×1010剂量的C.jejuni攻菌,全菌体免疫原能够提供完全保护,而以白油佐剂乳化的rHSP43仅能提供75%的保护。本研究结果为C.jejuni的疫苗研制提供了实验依据。     

肽聚糖对鲫鱼嗜水气单胞菌灭活疫苗免疫增强效果的研究

为了探讨肽聚糖在鱼类抗嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila，AH）感染中的免疫佐剂作用，用添加A3a肽聚糖的饲料投喂接种F-AH疫苗的彭泽鲫（Carassius auratus var．pengze）；通过测定鲫白细胞吞噬活性、血清和体表黏液溶菌酶活性、抗体效价以及活菌攻毒后的免疫保护率，证明肽聚糖与F-AH疫苗联合使用，鲫体表黏液和血清溶菌酶活性、白细胞吞噬活性、抗体效价以及活菌攻毒后的免疫保护率均显著提高，表明A3a肽聚糖是F-AH疫苗的良好佐剂，能增强鱼类F-AH疫苗免疫应答。     

聚γ谷氨酸生物合成与DegR关系及其免疫佐剂效果研究

为探讨调节因子DegR对聚γ谷氨酸(γ-PGA)生物合成产量的影响,比较聚γ谷氨酸佐剂和传统铝佐剂的辅助免疫效果,利用P43启动子构建了穿梭表达载体pHY-degR,通过电转化地衣芽胞杆菌WX-02获得重组菌株WX-02/pHYdegR。同时以福尔马林灭活的金黄色葡萄球菌蛋白疫苗作为免疫原,分别以不同分子质量聚γ谷氨酸佐剂和铝佐剂制备相关疫苗并免疫小鼠,7d后注射金黄色葡萄球菌,根据小鼠死亡数,计算其相对免疫保护率。结果显示,过表达degR后,聚γ谷氨酸生物合成产量提高至28.5g/L,相比对照菌株WX-02/pHY300提高22.6%。分子质量2×10~3 ku聚γ谷氨酸作为佐剂的相对免疫保护率效果最好(78.9%),优于铝佐剂免疫保护率(52.6%)和未添加佐剂免疫保护率(42.1%)。结果表明,过表达degR基因能提高聚γ谷氨酸生物合成量,且聚γ谷氨酸作为疫苗佐剂能增强疫苗免疫效果,可作为理想的疫苗佐剂。     

鸡新城疫基因Ⅶ型灭活标记疫苗（MG7株）最小有效免疫剂量的研究

为科学指导鸡新城疫基因Ⅶ型灭活标记疫苗（MG7株）的临床免疫剂量,通过测定免疫鸡HI抗体滴度和攻毒保护试验,进行了10日龄和30日龄SPF鸡最小有效免疫剂量的研究。动物实验使用10 μL、20 μL和40 μL三种不同免疫剂量,免疫疫苗后21 d检测HI抗体效价,10日龄SPF鸡001批次疫苗HI抗体平均效价依次为：4.8、6.2和6.5,攻毒保护率依次为80%、100%和100%,30日龄SPF鸡HI抗体平均效价依次为：5.0、6.3和6.5,攻毒保护率依次为70%、100%和100%,结果表明,新城疫灭活标记疫苗（MG7株）HI 抗体效价和保护效力呈正相关, 免疫剂量与HI 抗体效价和保护效力也呈正相关。用NDV基因Ⅶ型强毒G7株进行攻毒保护试验,两种日龄鸡在20 μL的免疫剂量下,疫苗仍能达到良好的免疫保护效果。     

奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌TH-16S 733330株荚膜多糖免疫原性研究

从新疆分离的奶牛乳腺炎金黄色葡萄球菌,经TH-16S系统鉴定,选取鉴定结果为733330的优势生化株。毒力测定试验表明,1×108CFU/只的接种量会使小白鼠在24 h内死亡。菌株接种Columbia Broth Modified 37℃摇床100 r/m in培养24 h后,用0.05%戊二醛灭活。灭活培养物经4℃30 m in 17 000 g离心去除细胞碎片,上清用PBS(pH 7.2)4℃透析48 h,PEG20000浓缩10倍,透析,加入终浓度为10 mg/mL的蜂胶-乙醇浸液,作为荚膜多糖免疫原。先分别用荚膜多糖免疫原0.1、0.2、0.4 mL免疫小白鼠,再用组合免疫原(荚膜多糖+109CFU/mL菌体)0.1、0.2、0.4 mL免疫小白鼠。6组小鼠于免疫后14 d连同对照小鼠2组攻击金黄色葡萄球菌2×108CFU/(0.2 mL.只)。结果表明,荚膜多糖免疫原组保护率分别为0、25%和50%,(荚膜多糖+菌体)组保护率分别为25%、75%和100%。     

增强猪传染性胸膜肺炎灭活苗对小鼠保护力的研究

为了提高猪传染性胸膜肺炎灭活苗的保护力,本研究利用基因重组技术表达了猪传染性胸膜肺炎放线杆菌6种主要致病因子蛋白:rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢ、rApxⅣ、rApfa和rOMP。设立试验Ⅰ组(灭活苗),试验Ⅱ组(灭活苗、rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢ和rOMP),试验Ⅲ组(灭活苗、rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢ和rApxⅣ),试验Ⅳ组(灭活苗、rApxⅠ、rApxⅡ、rApxⅢ和rApfa)和空白对照组(PBS),每组26只BALB/c小鼠,分3次免疫,每次间隔2周,每周检测血清抗体水平,在免疫后第2周、第4周和第5周,MTT法检测脾脏T细胞增殖水平及ELISA法测定IFN-γ分泌水平。在第3次免疫后的第7 d,将每组剩余20只小鼠平均分成2组,分别以APP1型菌(5×10~9 CFU)和APP7型菌(1×10~(11) CFU)进行攻毒保护试验。结果表明,向灭活苗中添加重组亚单位成份可以提高机体的细胞免疫和体液免疫水平,并能提高灭活苗的交叉保护率;试验Ⅱ组的ApxⅠ和OMP抗体水平以及细胞免疫水平均显著高于其它各组(p<0.05),对于APP1和APP7型菌的攻毒也提供了明显优于其它各组的保护结果,试验Ⅲ、Ⅳ组的细胞、体液免疫水平及保护率较试验Ⅰ组也有所提高。结果显示出ApxⅠ、OMP抗体水平和细胞免疫水平与攻毒保护率之间存在着正相关性,向灭活苗中加入重组蛋白成份可以提高疫苗的交叉保护,试验Ⅱ组通过激活体液免疫和细胞免疫,对两个血清型APP的攻击提供了很好的保护作用,从而为猪传染性胸膜肺炎新型疫苗的研制提供参考。     

泰山松花粉多糖和乳酸杆菌对禽波氏杆菌OMP亚单位疫苗免疫增强的协同作用

采用改进的水提醇沉法提取泰山松花粉粗多糖,并制备禽波氏杆菌OMP亚单位疫苗。取1日龄SPF雏鸡300只,随机分为6组,I～V组分别免疫含有松花粉多糖100g／I。的禽波氏杆菌OMP亚单位疫苗,Ⅵ组只免疫禽波氏杆菌OMP亚单位疫苗,I、Ⅱ组在前2周分别口服高、低剂量的乳酸杆菌活菌菌液1mL,HI、IV分别口服高、低剂量的乳酸杆菌热灭活菌菌液1mL。在首免后,每周采取血液和小肠,用间接ELISA法检测血清抗体水平、MTT法检测外周血淋巴细胞转化率、全自动血细胞分析仪测定外周血淋巴细胞比率、ELISA法检测小肠sIgA含量和IL-2水平。结果表明,I～Ⅳ组抗体水平、IL一2含量、淋巴细胞比率、淋巴细胞转化率、sIgA含量显著高于V组、Ⅵ组（P％0．05）;V组各检测指标显著高于Ⅵ组（P〈O．05）;乳酸杆菌活菌组各检测指标比灭活菌组略高,高剂量组略高于低剂量组。因此,泰山松花粉多糖作为免疫佐剂能显著提高疫苗的免疫效果,同时1：3服乳酸杆菌能进一步增强动物对疫苗的免疫应答能力,口服乳酸杆菌活菌与口服热灭活菌效果差异不显著,泰山松花粉多糖和乳酸杆菌对增强禽波氏杆菌OMP疫苗的免疫力有协同作用。     

H9N2亚型禽流感病毒细胞灭活疫苗的免疫效果评价

由于经济和技术因素的制约,尚未有成功的禽流感细胞疫苗产品上市.为此,本研究在细胞扩增而来的含有H9亚型禽流感病毒(AIV)HA和NA基因的SH441HANAPR8(NS mutant)重组病毒里加入终浓度为0.1％的甲醛进行灭活.结果显示,37℃条件下灭活24 h的效果最佳.灭活好的H9 AIV SH441HANAPR8(NS mutant)与佐剂Montanide ISA 70VG乳化制备成灭活苗,以0.05、0.1、0.2、0.3 mL/只的剂量,分别胸部肌肉注射免疫3周龄的SPF鸡,并于免疫后21d静脉感染A/Chicken/Shanghai/441/2009 (H9N2) AIV.结果显示,该疫苗的最小免疫剂量为0.2 mL.此外,研究还发现,当HI抗体效价≥25时,疫苗对鸡只的攻毒保护率达到100％.     

2型和11型鸭疫里默氏菌二价灭活苗的研制

为研制血清2型和11型鸭疫里默氏菌(Riemerella anatipestifer,RA)二价灭活疫苗,以RA1325株(2型)和RA1229株(11型)为菌种,经培养、灭活、浓缩,混合后制成二价灭活油乳剂疫苗。将疫苗皮下接种7日龄番鸭,免疫后7、14、21、56、63、70、77 d进行攻菌试验,测定疫苗的免疫原性。免疫后每隔7 d用ELISA方法测定血清中的抗体。结果表明,疫苗免疫后14 d产生良好保护,保护率超过80%,免疫持续期可达60 d。免疫后14~63 d抗体效价处于较高水平,说明研制的二价灭活疫苗能对血清2型和11型RA引起的鸭疫里默氏菌病产生良好的预防效果。     

鸡新城疫灭活疫苗免疫攻毒试验与血清学(HI)试验的平行关系研究

对19批鸡新城疫(ND)灭活疫苗进行了效力检验,在测定PD50的同时,进行了HI抗体效价的测定,以寻找血清学与抗攻毒保护的平行关系.结果表明,免疫剂量与GMHI抗体效价和攻毒保护率呈正相关:免疫1/12.5剂量组共保护54/60(90%),GMHI抗体效价为5.6 log2;免疫1/25剂量组共保护152/191(79.6%),GMHI抗体效价为4.9 log2;免疫1/50剂量组共保护123/183(67.2%),GMHI抗体效价为4.0 log2;免疫1/100剂量组共保护46/139(33%),GMHI抗体效价为3.0 log2;对照组保护0/89(0),GMHI抗体效价≤2.0 log2.采用PD50测定的18批疫苗中,有15批合格,3批不合格;按照我国现有质量标准,即免疫1/25剂量攻毒的方法进行检验,19批疫苗中有16批合格,3批不合格;血清学方法检验19批疫苗中有17批合格,2批不合格.其中免疫攻毒效检方法与PD50测定方法的不合格疫苗批次完全相同,其中2批为免疫胚制造的疫苗,1批为进口的灭活疫苗,血清学检验不合格的2批疫苗包含在其中,三种检验方法结果基本一致.试验还发现,HI抗体效价和抗攻毒保护呈正相关:未免疫对照组鸡血清HI抗体效价≤2.0 log2,攻毒保护率为0(0/89);免疫ND灭活疫苗后如果血清HI抗体效价＜3.0 log2,攻毒保护率为3.5%(4/113);HI为3.0 log2,攻毒保护率为16.1%(14/87);HI为4.0 log2,攻毒保护率为86.7%(86/99);HI达到5.0 log2,攻毒保护率为97.2%(103/106),HI≥6.0 log2,攻毒保护率为100%(168/168).     

维氏气单胞菌灭活疫苗的制备及对锦鲤免疫效果评价

为证明维氏气单胞菌灭活疫苗对锦鲤机体的免疫效果,应用福尔马林灭活法制备了维氏气单胞菌灭活疫苗对免疫后的锦鲤进行酸性磷酸酶活力检测、超氧化物歧化酶活力检测、吞噬活力等各项免疫指标的检测,并于试验第5周进行免疫保护力试验。结果显示,酸性磷酸酶活力在试验开始后有所上升,在第2周达到最高;超氧化物歧化酶活力上升,并在第2周达到最高;经观察,第3周开始白细胞的数量增多,吞噬活性同时增大;抗体效价于第3周达到最大值,并持续一段时间;免疫4周后攻菌检测免疫保护力,测得试验组的相对免疫保护率RPS为86.4%。上述结果表明,维氏气单胞菌灭活疫苗能够诱导锦鲤机体产生免疫应答反应,并能形成一定保护力。