五倍子、乌梅等45种中草药提取物对锯缘青蟹致病弧菌的抑菌作用研究

取五倍子、乌梅等45种中草药,分别采用水提取法和醇提取法制备提取液,除菌后滴加至中6mm空白药敏滤纸片上,制成试验用药敏纸片。测试了提取物对拟态弧菌SM060818、梅氏弧菌SM060813、霍利斯弧菌SM060913等3种分离自锯缘青蟹体外抑菌的效果。结果表明：所试验的45种中药提取物中,有28种中药提取物对试验弧菌表现有抑菌作用;其中五倍子、乌梅、秦皮、艾叶中药提取物抑菌作用较好,对3种菌株均有较好抑菌效果;天冬、白头翁、赤芍、金银花、黄精、黄柏、青蒿等11种中草药提取物仅对2种菌株有较好抑制作用,千里光、穿心莲等17种中药提取物对弧菌无抑制作用;大部分中药抑菌活性成份均为水溶性提取物,青蒿存在明显的醇溶性抑菌物质。测定了五倍子等9种中药提取物对致病弧菌的最低抑菌浓度（MIC）,五倍子、乌梅和天冬3种药物对拟态弧菌和梅氏弧菌的MIC分别为0．172mg／mL、0．461mg／mL、1．042mg／mL,对霍利斯弧菌的MIC分别为0．086mg／mL、0．922mg／mL和1．042mg／mL,有较好的抑菌作用。     

几种中草药对海水养殖中常见病原菌的抗菌作用

采用水煎煮法、微波乙醇提取法和微波水提取法对补骨脂、肉桂、黄连、五倍子、石榴皮、大黄、黄芩、苦参、乌梅、白头翁10种中草药进行提取,并用其提取液对海水养殖中7种常见致病菌（灿烂弧菌Vibriosplendidus、黄海希瓦氏菌Shewanella marisflavi、哈维氏弧菌Vibrio harveryi、副溶血弧菌Vibrio parahaemolytic-us、迟钝爱德华氏菌Edwardsiellosis tarda、海豚链球菌Streptococcus iniae、杀鲑气单胞菌Aeromonas salmonici-da）的最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）进行了测定,同时进行联合药敏试验,研究了几种中草药对海水养殖中常见病原菌的抗菌作用。结果表明：五倍子和石榴皮的抑菌杀菌效果最好,五倍子的MIC分别为0.78～1.56 mg/mL（水煎煮法、微波水提取法）、0.39～1.56 mg/mL（微波乙醇提取法）,石榴皮的MIC分别为1.56～3.13 mg/mL（水煎煮法）、0.78～1.56 mg/mL（微波乙醇提取法）、0.78～3.13mg/mL（微波水提取法）;五倍子的MBC分别为3.13～6.25 mg/mL（水煎煮法）、1.56～3.13 mg/mL（微波乙醇提取法、微波水提取法）,石榴皮的MBC分别为6.25～25 mg/mL（水煎煮法）、3.13～6.25 mg/mL（微波乙醇提取法、微波水提取法）。其次是黄连、黄芩和乌梅,而大黄、补骨脂、肉桂、苦参、白头翁的抑菌、杀菌效果一般或者较弱。用3种方法提取的中草药对7种病原菌的抗菌作用依次为：微波乙醇提取法提取液≥微波水提取法提取液≥水煎煮法提取液。联合药敏试验结果表明,复方五倍子与乌梅、五倍子与甘草对灿烂弧菌,黄芩与甘草对迟钝爱德华氏菌,石榴皮与乌梅对海豚链球菌,五倍子与石榴皮、五倍子与黄芩对黄海希瓦氏菌的抑制分别有协同作用,该结果可为水产养殖临床用药提供参考资料。     

半滑舌鳎体表溃疡症细菌性病原的分离鉴定及组织病理学研究

为了探究引起某养殖场半滑舌鳎体表溃疡并大量死亡的原因，从发病鱼体的肝脏、脾脏、肾脏等组织分离细菌，分别从脾脏和肾脏中分离出优势菌株8-0634和8-0635。对这2株菌分别进行人工感染试验，结果显示，只有菌株8-0635能够引起半滑舌鳎的死亡，死亡鱼体表现为鳞片脱落、腹水、肠道充血向外翻出，脾脏、肾脏等器官萎缩充血。病理组织切片HE染色观察显示，发病鱼体内脏组织间隙出现大量炎细胞浸润。革兰氏染色及生理生化试验结果显示菌株8-0635为哈维氏弧菌，利用管家基因及16S rRNA构建系统发育树进行序列分析，进一步鉴定该致病菌为哈维氏弧菌。药敏试验结果显示，菌株8-0635对头孢哌酮、氟苯尼考、氯霉素、氨苄西林等多种药物高度敏感。研究结果为半滑舌鳎体表溃疡症的防治提供了重要参考。     

摩氏摩根菌中药的筛选及联合用药效果观察

本试验采用水煎法提取黄芪、大黄、金银花、乌梅、黄柏等15种中药药液,使用牛津杯法和试管二倍稀释法测定中药对摩氏摩根菌的抑菌效果,在此基础上选择抑菌效果最佳的5种中药进一步观察其联合用药的抗菌作用。结果显示,所用中药中,乌梅对摩氏摩根菌抗菌效果最强,其平均抑菌圈大小达22mm,其次为五倍子、黄芪、金银花、黄芩,平均抑菌圈分别为21mm、18mm、17mm、16mm。上述中药的联合用药对摩氏摩根菌抑菌效果与单独用药相比,没有显示出明显累加或协同作用。表明,乌梅、五倍子、黄芪、金银花和黄芩对摩氏摩根菌有较强的抗菌功效,在所用的浓度下这些中药联合用药对摩氏摩根菌抑菌效果无协同作用。     

罗非鱼腐皮病病原菌分离鉴定及其对中草药敏感性试验

为了研究罗非鱼腐皮病的防治方法,通过形态学观察、生化特性等鉴定方法,从患腐皮病的罗非鱼体内分离到1株温和气单胞菌,并进行致病性试验和中草药药敏试验。致病性试验结果显示,分离细菌对罗非鱼有较强的致病作用。中草药药敏试验结果显示:五倍子、乌梅、沙棘、苏木4种单味中草药对分离细菌有较强的抑菌作用,石榴皮次之,陈皮、石菖蒲、鱼腥草、马齿苋、穿心莲、桉树叶、薄荷等无抑菌作用,且五倍子+乌梅的组方抑菌效果最强。     

基于转录组测序的半滑舌鳎长链非编码RNA的初步鉴定与分析

以抗病家系与易感家系半滑舌鳎为材料,进行哈维弧菌感染实验,并对易感家系感染前(CsSU)、易感家系感染后(CsSC)、抗病家系感染前(CsRU)、抗病家系感染后(CsRC)4组进行转录组测序,根据RNA-seq数据挖掘半滑舌鳎长链非编码RNA信息;通过生物信息学分析,筛选出与抗哈维弧菌病相关的差异长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)。结果显示,共识别出4 584个lncRNA座位,包含5 714个转录本;其基本特征与编码基因的比较分析,lncRNA的GC含量低于编码基因,单外显子基因数多于编码基因,转录本的平均长度长于编码基因,基因表达量低于编码基因。对4组样品进行两两比较(CsRU vs CsSU、CsRC vs CsSC、CsRC vs CsRU、CsSC vs CsSU)分别筛选出818、813、261、140个差异表达lncRNA,其中CsRU与CsSU之间、CsRC与CsSC之间lncRNA数目差异最多,通过聚类分析确定了各实验组的表达模式之间的联系,CsRU与CsSU之间的表达模式最为相近。通过共表达分析,预测出lncRNA和274个编码基因可能存在14 539种相互关系,并进行了功能注释,进而筛选出7个关键lncRNA。qRT-PCR结果显示,差异表达lncRNAs的表达模式和转录组数据得到的基本一致。研究结果为揭示lncRNA在半滑舌鳎抗哈维弧菌免疫调控反应中的作用提供重要的参考数据。     

哈维氏弧菌的主要致病因子及其特性分析

从大黄鱼致病菌哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)GYC1108-1株提取外膜蛋白(OMP)、脂多糖(LPS)和胞外产物(ECP),并进行毒性实验,以研究哈维氏弧菌的主要致病因子及其特征.结果表明:OMP、LPS致病性较弱,而ECP可导致鱼死亡,初步得出哈维氏弧菌GYC1108-1株的主要致病因子为胞外产物,其对鱼的半数致死量(LD50)为3.5 μg·g-1;该蛋白酶与底物偶氮酪蛋白(azocasein)作用的最适pH为8.0,最适温度28℃,对热敏感,分子质量为55 ku;该酶活性被碘乙酸抑制,也被SDS和HgCl2完全抑制,PMSF和ZnCl2能部分抑制该蛋白酶活性,而CuCl2、CaCl2、MgCl2对该酶活性影响不大,2-巯基乙醇、DTT、L-半胱氨酸、EDTA和EGTA对该酶活性有促进作用,表明其为半胱氨酸蛋白酶;研究发现ECP具有酪蛋白酶、明胶蛋白酶、淀粉酶、卵磷脂酶和脂肪酶活性,无脲酶活性;免疫印迹结果发现GYC1108-1的ECP能与大黄鱼抗GYC1108-1血清发生免疫发应,分子质量为55 ku的半胱氨酸蛋白酶是具有免疫原性的物质.     

利用LAMP法快速检测致病性哈维氏弧菌

从浙江宁波的发病鲈鱼(Lateolabrax japonicus)分离到1株致病性哈维氏弧菌(Vibrio harveyi) LY-1。从该菌的DNA样本中成功扩增出大小为873 bp的ToxR基因片段。DNA序列分析表明:该序列与已登录哈维氏弧菌(Vibrio harveyi) ToxR基因同源性为96.57%,与副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)、鳗弧菌(V.anguilarum)、创伤弧菌(V.vulnificus)、费氏弧菌(V.fisheri)、溶藻胶弧菌(V.alginolyticus)、霍利斯弧菌(V.hollisae)、拟态弧菌(V.mimicus)、河弧菌(V.fluvialis)的ToxR基因相似性为27.62%~72.49%。选择哈维氏弧菌ToxR基因种内保守区段,设计1套环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术的特异引物,对扩增条件进行优化实验,在65℃孵育45 min的条件下即可完成哈维氏弧菌特异性扩增,成功建立了海水致病菌-哈维氏弧菌的LAMP快速检测方法。结果分析表明:该方法对哈维氏弧菌DNA的最小检出量为1 fg,比PCR法灵敏度高3个数量级。利用LAMP方法快速检测哈维氏弧菌,目前在国内外还未见报道。     

海藻希瓦氏菌感染对半滑舌鳎肠道菌群结构及相关功能基因表达的影响

[目的]明确海藻希瓦氏菌(Shewanella algae)感染对半滑舌鳎(Cynoglossus semilaevis)肠道菌群结构及相关功能基因表达的影响,揭示肠道菌群和肠道组织相关功能基因在疾病发生及免疫应答过程中的作用机制.[方法]以致病性海藻希瓦氏菌人工感染半滑舌鳎后,采用16S rDNA高通量测序技术探究其肠道菌群组成结构的变化情况,并利用实时荧光定量PCR检测分析半滑舌鳎肠道组织中参与疾病发生和免疫应答相关功能基因的表达规律.[结果]共测序获得118657条有效序列,按97%的序列相似度聚类后得到6732个OTUs.Alpha多样性分析结果显示,Shannon指数和Chao1指数以感染前(CG)的健康半滑舌鳎最高,在感染后12 h(12hpi)最低;感染海藻希瓦氏菌前后半滑舌鳎肠道优势菌门无明显变化,但不同类群的相对丰度发生变化.在属水平上,Elizabethkingia、曼噬甲壳菌属(Chitin-ophaga)、Brevinema、苯基杆菌属(Phenylobacterium)、假单胞菌属(Pseudomonas)、乳杆菌属(Lactobacillus)、Marivita和雷尔氏菌属(Ralstonia)的相对丰度在CG半滑舌鳎肠道菌群组成中占比最高,希瓦氏菌属(Shewanella)、Petrimo-nas、Proteiniphilum和Aminobacterium的相对丰度在12hpi的占比最高,食酸菌属(Acidovorax)、芽孢杆菌属(Bacillus)和弧菌属(Vibrio)的相对丰度在感染后24 h(24hpi)的占比最高.半滑舌鳎肠道组织相关功能基因的表达变化表现为:果糖二磷酸醛缩酶A基因(ALDOA)的相对表达量在24hpi时显著高于CG(P<0.05,下同);磷脂酶B1基因(PLB1)、热休克蛋白70 kD蛋白1A基因(HSPA1A)、组氨酸三聚体核苷结合蛋白1基因(HINT1)和γ谷氨酰转移酶1基因(GGT1)的相对表达量显著高于CG和24hpi;海藻糖酶基因(TREH)的相对表达量在12hpi时显著低于CG和24hpi.[结论]半滑舌鳎感染海藻希瓦氏菌后其肠道菌群多样性降低、菌群结构发生变化,肠道组织中免疫功能相关基因(HSPA1A和HINT1)及代谢功能相关酶类基因(ALDOA、PLB1、GGT1和TREH)呈差异表达,说明海藻希瓦氏菌感染引起半滑舌鳎肠道微生态紊乱,且肠道组织中免疫功能相关基因和代谢功能相关酶类基因分别参与机体的免疫应答及疾病发生过程.     

乌鳢体表粘液的抑菌作用

分析了乌鳢体表粘液对爱德华氏菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌3种海洋致病菌的抑菌效果及影响因素。结果表明,同浓度的提取物对不同致病菌的抑菌活性不同,对爱德华氏菌抑制活性最大,其次是溶藻弧菌,最差的是哈维氏弧菌。此外,温度、紫外线和pH对提取物抑制活性都有不同程度的影响。     

4株海洋放线菌对半滑舌鳎病原弧菌的拮抗作用

从山东日照海域潮间带选择出对半滑舌鳎鳗弧菌(Vibrio anguillarum)和副溶血弧菌(Vibrio parahaemolytic-us)同时具有较强拮抗作用的4株放线菌.采用琼脂块法测定4株放线菌的抗菌谱,并检测4株放线菌分别在固体和液体培养液中的拮抗作用.结果表明:4株放线菌的抗菌谱均较窄,在固体和液体培养基中对2种病原弧菌都有较强的拮抗作用.     

豹纹鳃棘鲈致病性哈维氏弧菌的分离鉴定与系统发育分析

为探明养殖豹纹鳃棘鲈体表溃疡症的病因,从患病豹纹鳃棘鲈血液及内脏、体表溃疡处分离到2株优势菌,其中编号为1031的菌株经人工感染证实能够引起被感染鱼的死亡,为引起该豹纹鳃棘鲈溃疡病的病原菌。采用形态学、生理生化特性鉴定,结果表明菌株1031与弧菌属的基本特征相符,分别基于16SrDNA序列及热激蛋白60基因(hsp60)序列构建的系统发育树将菌株1031与哈维氏弧菌聚为一支,置信度均为97%,以1031为模板特异性扩增哈维氏弧菌toxR基因,也得到了预期382bp的核酸片段。综合以上结果,最终确定此次豹纹鳃棘鲈体表溃疡症的病原为哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)。药敏结果显示,该菌株仅对氟苯尼考、庆大霉素(120μg)、菌必治敏感,对诺氟沙星、恩诺沙星、阿奇霉素、强力霉素等均不敏感。     

养殖不同海水鱼的同种循环水系统中除磷细菌组成及特性

以点带石斑鱼(W池)、大菱鲆(D池)、红鳍东方鲀(H池)及半滑舌鳎(B池)4个鱼种循环水养殖系统净化池中采集水样为对象,采用平板分离法及液体培养法定量研究具有除磷能力的细菌及其特性。结果表明,4个系统中共培养16株除磷细菌;其中皮特不动杆菌、哈夫尼希瓦氏菌、创伤弧菌、副溶血弧菌具有较强的除磷能力和效果(皮特不动杆菌创伤弧菌哈夫尼希瓦氏菌副溶血弧菌);总除磷能力与细菌总浓度呈正相关;4种细菌去除NH4+-N效果为哈夫尼希瓦氏菌副溶血弧菌皮特不动杆菌创伤弧菌;其中皮特不动杆菌、哈夫尼希瓦氏菌、创伤弧菌具有除TN能力,去除TN的效果为皮特不动杆菌哈夫尼希瓦氏菌=创伤弧菌。     

中药与庆大霉素联合对16S rRNA甲基化酶耐药重组菌的作用研究

为分析中药与庆大霉素联合对16S rRNA甲基化酶Rm B耐药重组菌的作用,采用棋盘稀释法测定庆大霉素与黄连、五倍子、连翘、黄芩、乌梅的联合抑菌指数(frictional inhibitory concentration index,FICI)。试验结果表明,黄连、五倍子、连翘、黄芩、乌梅与庆大霉素的联合抑菌指数(FICI)分别为0. 75、0. 25、1. 50、2. 00、0. 75。提示中药五倍子与庆大霉素联合有协同作用,黄连、乌梅与庆大霉素联合有相加作用,连翘、黄芩与庆大霉素联合呈现无关作用。     

25 种中草药及其联合用药配伍对 5 种水产养殖常见致病菌的抑菌作用

为探究25种中草药及其联合用药配伍对水产养殖中常见5种细菌致病菌的抑制作用,采用琼脂扩散法(纸片法)测定了夏枯草、石榴皮、黄连、白头翁、乌梅等25种中草药对嗜水气单胞菌Aeromonas hydrophila、副溶血弧菌Vibrio parahemolyticus、蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus、荧光假单胞菌Pseudomonas fluorescens和弗氏柠檬酸杆菌Citrobacter freundii的抑制作用,用二倍稀释法测定了抑菌效果较强的4种中草药对5种致病菌的最小抑菌(MIC)和最小杀菌浓度(MBC),采用正交试验法对这5种致病菌具有较强抑制作用的中草药配伍进行了研究。结果表明:25种中草药对这5种致病菌均有抑制作用,乌梅、石榴皮、黄连、白头翁的抑菌作用最强,其抑菌圈直径达10～30 mm,MIC62.5 mg/mL,MBC125 mg/mL,其中对嗜水气单胞菌、荧光假单胞菌、弗氏柠檬酸杆菌抑菌作用最明显的是乌梅,MIC均为15.63 mg/mL,对副溶血弧菌抑菌作用最明显的是黄连,MIC为15.63 mg/mL,对蜡样芽孢杆菌抑菌作用最明显的是乌梅,MIC为7.81 mg/mL;正交试验结果表明,对嗜水气单胞菌、副溶血弧菌具有最佳抑菌作用的组合为乌梅+石榴皮,对蜡样芽孢杆菌具有最佳抑菌作用的组合为乌梅+白头翁、石榴皮+白头翁,对荧光假单胞菌具有最佳抑菌作用的组合为乌梅+白头翁,对弗氏柠檬酸杆菌具有最佳抑菌作用的组合为乌梅+石榴皮、乌梅+白头翁。研究表明,针对水产养殖中常见的5种致病菌,乌梅+石榴皮、乌梅+白头翁为最佳抑菌中药配伍组合,中草药配伍效果好于单一用药。     

哈维氏弧菌溶血素的包涵体纯化、多抗制备及活性验证

为进一步研究哈维氏弧菌溶血素(Vibrio harveyi hemolysin, VHH)的生物学功能,构建了vhh原核表达载体,并利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体,采用DOT-ELISA和Western-blot方法检测抗体的效价及特异性,并通过溶血试验评估抗体对哈维氏弧菌培养物上清溶血活性的影响。结果表明:在构建得到的表达菌株pET28a-vhh-BL21(DE3)中,重组蛋白以包涵体形式大量表达;对该重组蛋白进行纯化并复性后,利用纯化的蛋白免疫小鼠制备的多克隆抗体效价为1∶163 840,可特异性识别VHH蛋白,且稀释倍数小于1000时,可显著抑制哈维氏弧菌培养物上清的溶血活性。本研究结果对VHH单抗的制备、哈维氏弧菌检测手段的完善及哈维氏弧菌的疫苗研发具有一定参考作用。     

哈维氏弧菌和白斑综合症病毒对墨吉明对虾仔虾的致病性

研究了不同浓度哈维氏弧菌与白斑综合症病毒单独、合并浸泡感染,以及不同温度和盐度条件下单独、合并浸泡感染对墨吉明对虾仔虾死亡情况和WSSV携带量的影响。结果表明:高浓度哈维氏弧菌浸泡感染仔虾,48 h死亡率可达100%,高浓度WSSV浸泡感染仔虾,96 h死亡率可达97%;盐度突变可以降低弧菌与病毒浸泡感染对仔虾的致病性;高温条件下(32℃)弧菌对仔虾的致病性较强,低温条件下(26℃)病毒对仔虾的致病性较强;盐度26、水温26℃条件下,合并感染组死亡率较WSSV单独感染组低;哈维氏弧菌感染可以抑制WSSV在对虾体内的复制。     

舟山海域海泥细菌的分离及抗水产病原弧菌的筛选

采集中国东海舟山海域海底不同层次9个海泥样品,通过稀释培养分离纯化得到海洋细菌78株。采用滤纸片琼脂扩散法测定上述分离所得海洋细菌对鳗弧菌、溶藻弧菌、哈维氏弧菌、创伤弧菌、费氏弧菌等5种水产病害常见病原弧菌的抑制作用,获得具有抑弧菌作用的海洋细菌17株,占21.8%。其中6株菌株对费氏弧菌有明显的抑菌作用,占7.7%。7株菌株对哈维氏弧菌的抑菌作用较显著,占9.0%。2株菌株对创伤弧菌有明显的抑菌作用,占2.6%。2株菌株对溶藻弧菌和鳗弧菌显示一定的抑制作用,各占1.3%。研究结果表明：通过稀释培养法能分离到一定数量和种类的海洋细菌;来自海底泥的海洋细菌中存在较多的具有水产病原弧菌拮抗活性的菌株。     

一株虾源假交替单胞菌(Pseudoalteromonas sp.)的分离鉴定及口服后对对虾体内弧菌的影响

为探讨对虾细菌性病原的微生物防控技术,采用牛津杯打孔法对分离自对虾育苗池的一株编号为2021041402-14的细菌(简称“02HN”)进行了抗菌测试,分析其对欧文氏弧菌(Vibrio owensii)、哈维氏弧菌(V.harveyi)、坎贝氏弧菌(V.campbellii)、溶藻弧菌(V.alginolyticus)、副溶血弧菌(V.parahaemolyticus)和美人鱼发光杆菌(Photobacterium damselae)等6株虾病原菌的抑菌效果及最低抑菌浓度,通过浸泡感染测试了菌株02HN对凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)的生物毒性,采用16S rRNA、gyrB-rpoD串联基因序列比对法及生理生化方法对该菌进行了鉴定,并将该菌添加到饲料中投喂对虾,评价该菌对对虾体内弧菌数量的影响。结果表明：菌株02HN对欧文氏弧菌、哈维氏弧菌、坎贝氏弧菌、溶藻弧菌、副溶血弧菌和美人鱼发光杆菌均具有抑菌效果,其最低抑菌浓度分别为2.32×10⁴、2.32×10³、2.32×10⁶、2.32×10     

2种海洋弧菌的鉴定及人工感染大黄鱼病理分析

从形态学、生化特性、分子生物学水平对2种海洋弧菌进行菌种鉴定,将这2株菌制作成混合菌液,对大黄鱼进行攻毒试验。对2菌株16S r DNA进行PCR扩增,产物长度分别为1 389、1 477 bp。利用BLAST进行比对,结果显示菌株090625的序列与哈维氏弧菌的同源性高达99%;而菌株070925的序列与副溶血弧菌同源性高达99%。攻毒试验发现,大黄鱼体亲鱼表皮下出血和肝脏、脾脏等组织都出现了典型的弧菌感染病症,大黄鱼幼鱼则未出现感染现象。菌株090625为哈维氏弧菌,菌株070925为副溶血弧菌。大黄鱼亲鱼比幼鱼更容易感染细菌。