基因佐剂CpGDNA对生长抑素DNA疫苗pES/2SS的作用

 【目的】探讨CpGDNA对生长抑素DNA疫苗免疫小鼠免疫效果的影响。【方法】生长抑素质粒pES/2SS分别与CpG-ODN、pE-CpG、细菌DNA、脂质体配合免疫小鼠，疫苗剂量为20μg/只，佐剂等量混合，2周后加强免疫。【结果】雌性小鼠免疫后4、6周，疫苗组平均增重显著高于对照组(P<0.05)。CpGDNA和DNA疫苗联合免疫后SS抗体P/N值、IgG2a/IgG1、脾细胞活性、GH和IGF-I均比单一使用DNA疫苗的高(P<0.05)。免疫后4周，P/N值以pES/2SS + CpGODN组最高，SI值以pES/2SS+ CpG-ODN组最高。CpGDNA佐剂组GH从第2周开始升高，至第6周达高峰，显著高于pES/2SS组（P<0.01），CpG-ODN组GH高水平持续时间最长，至免疫后8周，仍显著高于pES/2SS组（P<0.01）。CpGDNA组IGF-I值显著高于pES/2SS疫苗组（P<0.05）。【结论】生长抑素基因免疫小鼠可以产生SS抗体，而含CpGDNA序列的核酸佐剂及脂质体粗品，可以增强生长抑素基因疫苗的效果。     

GM-CSF与生长抑素共表达基因疫苗的构建和鉴定

以基因疫苗pVGS/2SS-asd为模板,采用分子生物学方法,分别获得目的片段粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（ GM-CSF）和含有乙肝表面抗原S基因的生长抑素基因（ SS）。以共表达质粒pIRES为载体,采用基因工程方法,将GM-CSF和SS基因片段分别克隆到载体的多克隆位点A和多克隆位点B上,构建共表达基因疫苗pIRES-GM-CSF/2SS,旨在同时表达GM-CSF和SS两种蛋白。获得表达质粒后,酶切和测序鉴定该共表达基因疫苗,结果显示,该共表达基因疫苗pIRES-GM-CSF/2SS构建成功,为该共表达基因疫苗的后续研究奠定了良好的基础。     

生长抑素基因疫苗pES/2SS的构建与表达

为了获得安全性较好的生长抑素(SS)基因疫苗,采用PCR扩增pcS/SS中的SS基因,将其融合到pUSS/S质粒S基因后,构建pUS/2SS质粒;然后将S/2SS融合基因亚克隆到pEGFP-N_1中,得到S/2SS融合表达质粒pES/2SS。酶切和测序鉴定表明:重组质粒pES/2SS构建成功。将pES/2SS转染HeLa细胞,用ELISA检测表达的融合蛋白可与SS抗体特异性结合;将pES/2SS免疫10只大鼠(每只100μg)后,5只大鼠产生抗SS抗体,而对照组未检出SS抗体。结果证明,所构建的质粒pES/2SS可在真核细胞中表达生长抑素,用于免疫可产生抗SS特异性抗体。     

生长抑素主动和被动免疫及基因免疫研究进展

生长抑素(somatostatin,SS)是下丘脑释放的14肽激素,在动物体内具有广泛的抑制作用,特别是对生长及免疫反应具有明显的影响,通过耗竭或免疫中和体内的SS水平相应提高生长激素(GH)等水平促进动物生长。文中简要介绍了生长抑素主动和被动免疫的研究进展及基因免疫的作用机理、特点及增强基因免疫的途径;阐述了生长抑素基因疫苗的研究和应用发展前景。     

生长抑素DNA疫苗pEGS/2SS在大鼠体内的表达与分布

给SD大鼠股四头肌注射带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的质粒pEGS／2SS,每只100μg。注射后不同时间剖杀,取注射部位肌肉、心、脑、垂体、肝、脾、肾、小肠、胃、子宫、卵巢作冰冻切片,于荧光显微镜下检查。发现pEGS／2SS仅在注射部位肌肉表达,72h表达最强,10d后明显减弱,2周后消失。其他组织及对照组未检测到绿色荧光。表明pEGS／2SS在体内表达、分布方面具有较好的安全性。     

生长抑素DNA疫苗pEGS/2SS在大鼠体内的表达与分布

给SD大鼠股四头肌注射带有增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因的质粒pEGS/2SS,每只100 μg.注射后不同时间剖杀,取注射部位肌肉、心、脑、垂体、肝、脾、肾、小肠、胃、子宫、卵巢作冰冻切片,于荧光显微镜下检查.发现pEGS/2SS仅在注射部位肌肉表达,72 h表达最强,10 d后明显减弱,2周后消失.其他组织及对照组未检测到绿色荧光.表明pEGS/2SS在体内表达、分布方面具有较好的安全性.     

生长抑素基因疫苗对肉用鸡生产性能、屠宰性能及肌肉品质的影响

将28日龄150只肉用鸡随机分为5个组,每组30只,A、B、C组口服生长抑素基因疫苗,剂量分别为8×109、4×109、1×109 cfu·只-1,D组口服生理盐水,E组口服减毒沙门氏菌CS022,作为对照组,2周后加强免疫1次,分析以减毒沙门氏菌为载体的生长抑素基因疫苗对肉用鸡生长性能、屠宰性能及肌肉品质的影响.结果...     

猪瘟基因疫苗免疫小鼠外周血细胞免疫动态变化研究

应用ＦＡＣＳ、ＭＴＴ法对猪瘟基因疫苗ｐｃＤＳＴ、ｐｃＤＳＷ免疫鼠外围血中ＣＤ４＾＋和ＣＤ８＾＋淋巴细胞数、淋巴细胞的转化功能等动态变化进行了观察。结果：ｐｃＤＳＴ、ｐｃＤＳＷ猪瘟基因疫苗免疫小鼠后,小鼠的外周血淋巴细胞对ＬＰＳ有强烈的反应性,ＣＤ４＾＋细胞数量增加,外周血淋巴细胞ＣＤ８＾＋细胞数量在一段时间内增加。ＣＤ４＾＋和ＣＤ８＾＋细胞数量在免疫后３２天达到高峰后开始下降。表明ｐｃＤＳＴ、ｐｃＤＳＷ质粒免疫小鼠后诱发免疫反应。     

生长抑素基因疫苗对肉用鸡血浆生化指标和免疫器官指数的影响

研究以减毒沙门氏菌为载体的生长抑素基因疫苗对肉鸡的血浆生化指标和免疫器官指数的影响。将28日龄的150只肉鸡随机分为5个组,每组30只,A、B、C组口服生长抑素基因疫苗,剂量分别为8×109CFU/只、4×109CFU/只、1×109CFU/只,D组口服生理盐水,作为对照组,E组口服减毒沙门氏菌CS022,2周后加强免疫1次。结果表明:口服pcS/2SS基因疫苗后,C组(1×109CFU/只)肉鸡的白蛋白含量较D组明显增加(P<0.05),8周龄时和10周龄时尿素氮含量较D组明显降低(P<0.05)。pcS/2SS基因疫苗对血浆总蛋白、葡萄糖、游离脂肪酸的含量影响不明显。免疫器官指数方面,各组差异不显著(P>0.05),但1×109CFU/只剂量组较对照组(D组)有升高趋势。由以上结果可以看出,口服生长抑素基因疫苗可以提高肉鸡血浆白蛋白的含量,降低肉鸡血浆尿素氮含量,对血浆总蛋白、葡萄糖、游离脂肪酸的含量影响不明显,免疫器官指数有升高趋势,1×109CFU/只为较适宜剂量。     

小鼠GM-CSF基因的扩增及在HEK293T细胞中的分泌表达

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)是机体免疫系统的重要细胞因子,具有生物佐剂作用,为研究GM-CSF的生物佐剂作用,本试验通过RT-PCR方法从小鼠脾脏细胞中扩增小鼠GM-CSF的cDNA,并将其插入到pcDNA3.1质粒中,构建成GM-CSF真核表达载体pcDNA3.1-GMCSF,并在真核细胞进行了瞬时表达。结果表明,本研究扩增的小鼠GM-CSF基因序列与GenBank序列完全一致,表达载体经脂质体介导转染HEK293T细胞,表达产物经western-blot检测,证明GM-CSF能够在HEK293T细胞中进行分泌表达。这为今后研究GM-CSF在动物疫苗,特别是DNA疫苗中的生物佐剂作用创造了必要的条件。     

Enhancement Effect of CpG DNA on the Somatostatin DNA Vaccine in Mice

To study the immune effect of CpGDNA on somatostatin （SS） DNA vaccine, the 20-day-old experimental mice were immunized with 20 lag SS eukaryotic expression plasmid pES/2SS with different adjuvants in equal dose, such as the synthetic CpG-ODN, the pE-CpG plasmid, E. coli DNA and the crude liposome. A booster was given two weeks later. The results showed that the body weight gain of female mice in the SS immunized group was higher than that of the control （P 〈0.05）. The levels of antibodies against SS, IgG2a/IgG1, spleen lymphocyte proliferation activity and the concentrations of GH and IGF-Ⅰ in the DNA vaccine groups combined with CpGDNA were significantly increased compared to that of the group immunized with DNA vaccine alone. All these suggested the recombinant SS expression plasmid can stimulate animals to produce antibodies against SS, and CpGDNA adjuvant can enhance the immune effect of DNA vaccine against SS and influence the concentration of GH and IGF-Ⅰ .     

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子与生长抑素融合表达基因疫苗的免疫对断奶仔猪某些代谢物浓度的影响

选择40头断奶的长×大二元杂交仔猪,随机分为4组,每组10头,公母各半,其中1组为对照组,2～4组分别口服以减毒沙门氏菌为载体的基因疫苗pcS/2SS、pGM-CSF/SS和pGM-CSF pcS/2SS,研究这些基因疫苗对断奶仔猪血浆代谢物浓度的影响.结果显示,对照组和pcS/2SS基因疫苗免疫组仔猪血浆葡萄糖浓度没有明显变化,pGM-CSF pcS/2SS免疫组呈现下降的趋势,融合表达质粒pGM-CSF/SS的免疫则可提高血浆葡萄糖的浓度;血浆游离脂肪酸的分泌水平各免疫组间无明显差异;血浆尿素氮的浓度pGM-CSF/SS免疫组有上升的趋势,在第2周、4周和6周血浆尿素氮的浓度高于其它3个组(P＞0.05),pcS/2SS免疫组则随免疫时间的延长而逐渐下降.对照组和pGM-CSF pcS/2SS免疫组一直保持比较平稳的态势.结果表明,GM-CSF提高了SS基因疫苗的免疫效果,pGM-CSF/SS要优于pGM-CSF pcS/2SS共同免疫.     

小鹅瘟病毒VP3真核表达质粒与弱毒疫苗诱导鹅体免疫应答的比较

 【目的】比较小鹅瘟病毒（GPV）VP3基因疫苗（pcDNA-GPV-VP3）和弱毒疫苗免疫鹅体内的免疫应答,以期为进一步研究和阐明pcDNA-GPV-VP3免疫发生机理、免疫持续期等提供基础数据。【方法】将pcDNA-GPV-VP3和小鹅瘟弱毒疫苗分别免疫30日龄四川白鹅,用免疫组织化学方法检测免疫鹅体内GPV抗原的分布,用淋巴细胞增殖实验和间接ELISA分别检测免疫鹅的细胞免疫水平和血清抗体滴度,比较GPV基因疫苗与弱毒疫苗诱导鹅体免疫应答的能力。【结果】①弱毒疫苗组于免疫鹅的心、肝、脾、肺、肾、法氏囊、胸腺、哈氏腺、十二指肠、空肠、回肠、直肠、盲肠、胰腺、大脑及注射部位肌肉均中检测到GPV抗原;基因疫苗组于免疫鹅的心、十二指肠、空肠、回肠、直肠、盲肠及注射部位肌肉中检测到GPV抗原。②弱毒疫苗免疫雏鹅外周血T淋巴细胞14 d后对ConA的反应开始增强,35 d达到最高值后下降;基因疫苗免疫雏鹅外周血T淋巴细胞OD值先下降,14 d后开始上升并高于空白质粒对照鹅和PBS对照鹅,35 d时达最大值,以后又逐渐下降,第21-63天极显著（P＜0.01）高于PBS对照鹅和空白质粒对照鹅,第21-63 天时极显著（P＜0.01）高于弱毒疫苗免疫鹅。③弱毒疫苗免疫鹅血清抗体第3天开始高于PBS对照鹅,第28天达到最大值后逐渐下降;基因疫苗免疫鹅血清体从第14天开始高于PBS对照组,第28天达最大值,第21-217天显著（P＜0.05）或极显著（P＜0.01）高于PBS和空白质粒对照鹅;基因疫苗免疫鹅血清抗体除第28天极显著(P＜0.01)高于GPV弱毒疫苗免疫鹅外,其余时间与弱毒疫苗免疫鹅差异不显著。【结论】pcDNA-GPV-VP3免疫雏鹅后能在免疫部位皮肤、心肌和各肠段中表达并能够诱导鹅体产生良好的细胞免疫和体液免疫,基因疫苗诱导鹅体产生免疫应答的能力优于弱毒疫苗,结果为阐述pcDNA-GPV-VP3的免疫机制和临床应用提供了数据资料。     

结核分枝杆菌三价DNA疫苗在奶牛体内诱导的免疫应答

[目的]研究结核分枝杆菌Ag85B、MPB64和MPT83抗原DNA疫苗在奶牛体内诱导的免疫应答.[方法]以PJW4303为载体,构建上述3种抗原基因的三价DNA疫苗,免疫6月龄荷斯坦奶牛3次.ELISA法检测免疫奶牛的特异性抗体滴度.利用双抗夹心ELISA定量测定免疫奶牛各月IFN-γ浓度.[结果]免疫前奶牛体内特异性抗体为阴性,1免、2免后抗体效价上升较缓,3免后抗体效价上升快.MPT83特异性抗体上升最快,抗体效价1:3200持续6个月;Ag85B特异性抗体效价1:3200持续2个月;MPT64特异性抗体效价较低.免疫奶牛中MPT83、Ag85B、MPT64三种蛋白诱导产生IFN-γ在3免后6个月到达最高,浓度分别为(1 098.95±16.5.03)、(711.45士110.43)、(355.06±72.76) pg/mL,阴性对照组PBS刺激IFN -γ浓度为(114.5±27.46)pg/mL.阴性对照与三种抗原相比,差异均极显著(P＜0.01).[结论]多价核酸疫苗能同时诱导机体产生细胞免疫应答和体液免疫应答,可能有利于增强疫苗对抗结核病的抗性.     

减毒沙门氏菌介导H9亚型禽流感DNA疫苗与灭活疫苗联合应用研究

构建获得含有H9亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因的重组真核表达质粒pCAGGS-HA。重组质粒电转化减毒鼠伤寒沙门氏菌SL7207,获得重组沙门氏菌SL7207(pCAGGS-HA)。重组菌SL7207(pCAGGS-HA)以5×109cfu的剂量2次口服免疫1日龄商品代伊莎褐蛋鸡后,再以油乳剂灭活疫苗加强免疫1次,并设立重组菌单独免疫组、灭活苗免疫组、空载体免疫组及空白对照组。联合免疫组和重组菌单独免疫组的小肠黏膜抗体效价与其他组之间存在显著差异(P<0.05),且两组的攻毒免疫保护水平与空载体组之间差异显著(P<0.05),其中联合免疫组的免疫保护率最高,达100%,而灭活苗免疫组保护率为80%,表明减毒沙门氏菌介导的H9亚型禽流感DNA疫苗与灭活疫苗联合应用具有良好的免疫协同作用。     

猪链球菌病单价与多价灭活苗的免疫效果

分别用猪链球菌C、D、E血清群菌株制成两种单价灭活苗S1(C群菌株苗)、S2(D群菌株苗);一种二价灭活苗S3(C、D群菌株苗)和一种三价灭活苗S4(C、D、E群菌株苗)。四种灭活苗经免疫家兔和断奶仔猪后,比较血清抗体水平,四种疫苗的各群抗体水平均能规律性地转阳,其抗体水平间无明显差异。四种疫苗分别免疫小鼠2周后采用强毒进行攻击,它们对相应的血清群强毒株的攻击均能保护,且保护数无明显差异,结果显示多价灭活苗能够保护相应的致病血清群强毒株的攻击,其保护效果与单价灭活苗无差异。     

基因疫苗的免疫学分子机制

文中对病原体诱导宿主的免疫学过程以及基因疫苗作用的免疫学分子机制进行了综述,并对其未来发展进行了展望。