副猪嗜血杆菌外膜蛋白pilA基因的克隆与表达（摘要）

[目的]克隆和表达副猪嗜血杆菌外膜蛋白pilA基因。[方法]对已发表的HPS的pilA序列进行序列分析,合成引物,并以HPS血清5型基因组为模板,通过PCR扩增HPS的pilA编码基因,获得目的基因片段;构建重组表达质粒,经IPTG诱导表达至大肠杆菌BI21（DE3）中,进行SDS-PAGE与Westernblot检测。[结果]表达的重组蛋白分子质量与预期的43kD一致。[结论]为制备亚单位疫苗和诊断试剂奠定了基础。     

副猪嗜血杆菌sodA基因的表达及其理化性质

为探究副猪嗜血杆菌(Haemophilus parasuis)sodA基因编码的超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)的活性及理化性质,设计特异性引物从HPS中扩增得到目的基因sodA,利用原核表达系统对HPS SOD蛋白进行表达,通过硫酸铵分级沉淀、Sephacryl S-300凝胶过滤层析以及DEAE Sepharose Fast Flow阴离子交换层析等方法对表达蛋白进行了分离纯化,利用邻苯三酚自氧化法对纯化产物进行SOD酶活性检测,通过HPSEC法、火焰原子吸收分光光度法对其理化性质进行了初步探究。结果表明,表达的重组HPS SOD蛋白质为可溶性蛋白质,单亚基分子质量为26 ku,纯化后目的蛋白质纯度为95%,纯化后的重组HPS SOD蛋白质比活性为215.9 U/mg,经HPSEC法检测分析,重组HPS SOD呈多聚体,通过火焰原子吸收分光光度法检测纯化的重组HPS SOD中锰元素含量为0.71 mg/L。     

牛整合素β5亚基基因的构建与原核表达

[目的]构建牛整合素β5亚基（ITGB5）基因,并进行原核表达。[方法]扩增目的基因,将其重组到pET-32a（＋）质粒中,将经鉴定为阳性的重组克隆,转化大肠杆菌感受态细胞表达蛋白后纯化。[结果]从牛甲状腺、扁桃体扩增到目的基因ITGB5;ITGB5基因表达产物的SDS-PAGE结果显示,在88 KD处出现表达产物及纯化后的蛋白;W estern-blot分析表明,抗血清可与原核表达的蛋白特异性结合。[结论]表达、并纯化了ITGB5蛋白。     

小鼠Klf4基因的原核表达研究

[目的]对小鼠Klf4基因重组蛋白进行原核表达分析。[方法]利用双酶切从重组质粒p MXs-Klf4上回收小鼠Klf4基因片段,克隆入p ET-41a(+)载体后转化BL21大肠杆菌,用IPTG诱导表达,探讨诱导表达最佳浓度和时间,最后采用SDS-PAGE对重组蛋白进行鉴定及分析。[结果]重组质粒Klf4-p ET-41a(+)在IPTG诱导下可表达与预期相符的约为51 ku的KLF4蛋白;经IPTG刺激后重组蛋白表达增多,以0.8 mmol/L IPTG诱导6 h为佳;重组蛋白以包涵体形式存在于大肠杆菌BL21中。[结论]小鼠Klf4基因可在原核细胞中表达。     

PIWIL1基因启动子调控的特异表达Cre重组酶的转基因猪的构建

[目的]建立PIWIL1基因启动子调控的特异性表达Cre重组酶的转基因猪,为研究piRNA及其相关基因的功能和机制奠定基础。[方法]通过PCR扩增,从猪的全基因组上扩增出PIWIL1基因的启动子。切除猪源Cre重组酶的表达载体pET28a-MHC-Cre-BGHpo1yA-FRT2neor的启动子MHC,将其与PIWIL1基因启动子连接,构建成特异性表达Cre重组酶的pPIWIL1-Cre载体。将该载体转染小型猪胎儿成纤维细胞,通过G418筛选,获得阳性克隆进行核移植。[结果]获得2头PIWIL1基因启动子调控的特异表达Cre酶的转基因猪。[结论]成功构建了PIWIL1基因启动子调控的特异表达Cre重组酶的转基因猪,为研究piRNA及其相关基因的功能和机制提供了工具猪。     

盐生植物盐穗木HcPS_H基因大肠杆菌表达载体的构建

[目的]构建盐穗木HcPS_H基因的大肠杆菌表达载体。[方法]以质粒pGEM-T-HcPS_H为模板,HcPS_H-pET28a-F、HcPS_H-pET28a-R为引物进行PCR扩增,获得两端含酶切位点的HcPS_H基因目的片段。将该目的片段与大肠杆菌表达载体pET-28a通过T4DNA连接酶连接,并转化大肠杆菌(Escherichia coli)DH5α,得到重组子克隆,抽质粒进行测序鉴定。[结果]扩增出HcPS_H基因片段长度为441 bp,将其连接到大肠杆菌表达载体pET-28a上后,得到重组子质粒,经PCR检测、双酶切验证及测序鉴定,表明成功构建原核表达载体。[结论]该研究成功构建了盐穗木HcPS_H基因的大肠杆菌表达载体,为进一步进行该基因功能的研究奠定了基础。     

高产纤维素酶绿色木霉基因工程菌的构建

[目的]构建CBHⅡ基因过量表达的绿色木霉工程菌。[方法]根据绿色木霉cDNA序列设计合成引物,PCR扩增CBHⅡ基因序列,将完整的目的基因与表达载体pCAMBIA1302连接,转入大肠杆菌DH5α中,获得重组质粒pCAMBIA1302-CBHⅠ。再将pCAM-BIA1302-CBHⅠ重组质粒与瑞氏木霉外切葡聚糖纤维二糖水解酶Ⅱ（CBHⅡ）PcbhⅡ启动子片段连接,将潮霉素磷酸转移酶（hyg）基因片段插入PcbhⅡ启动子下游,转入大肠杆菌DH5α中,获得重组表达质粒pCAMBIA1302-CBHⅡ。[结果]构建的重组表达质粒电转化后经SDS-PAGE电泳检测,绿色木霉纤维素酶CBHII基因在原宿主菌中成功过量表达,证实CBHⅡ基因在PcbhⅡ启动子控制下进行高效表达。[结论]为高产纤维素酶系的工业化菌株构建奠定基础。     

南方菜豆花叶病毒外壳蛋白基因的克隆与原核表达

[目的]克隆南方菜豆花叶病毒(SBMV)外壳蛋白(CP)基因,并对其进行原核表达。[方法]利用RT-PCR方法克隆SBMV CP基因,将CP基因定向插入表达载体pET28a中,构建其表达载体,并转化大肠杆菌BL-21表达重组蛋白。[结果]试验成功克隆到大小为799 bp的SBMV CP基因,测序分析发现与NCBI中目标基因的相似度达99%以上;成功构建了该基因的原核表达载体pET28a-SBMVCP,并确定重组蛋白在37℃、1.0 mmol/L IPTG、4 h条件下表达量最大。[结论]该研究为SBMV抗体的制备奠定了基础。     

苏云金芽孢杆菌普鲁兰酶编码基因amyX的鉴定与重组酶性质研究

[目的]研究苏云金芽孢杆菌konkukian亚种amyX基因在大肠杆菌中的表达及表达产物的性质。[方法]以苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)染色体DNA为模板,PCR扩增得到amyX普鲁兰酶结构基因,再与大肠杆菌表达载体pET28a连接,构建能表达普鲁兰酶的重组大肠杆菌。重组菌经IPTG诱导,表达有活性的普鲁兰酶,初步分析重组普鲁兰酶的酶学性质。[结果]结果表明,苏云金芽孢杆菌基因组序列有两条基因(pulA和amyX)可能编码普鲁兰酶。温度为50℃,pH为6.0时,重组酶不能水解淀粉,属于I型普鲁兰酶。[结论]amyX基因能在大肠杆菌细胞内成功表达,表达产物具有典型的I型普鲁兰酶的特性。     

牛轮状病毒结构蛋白VP4基因的真核表达

[目的]克隆获得牛轮状病毒VP4全基因,并进行真核表达。[方法]采用RT-PCR技术,从牛轮状病毒总RNA中扩增出VP4基因,将其重组到含有Flag标签的pcDNA3.1(+)载体中,经PCR、酶切和测序鉴定正确后,通过Lipofect2000TM转染293T细胞,细胞增殖后经RT-PCR和Western Blot检测VP4基因的表达。[结果]获得了VP4基因的阳性重组真核表达载体pcDNA3.1(+)-VP4;转染293T细胞后经RT-PCR和Western Blot检测表明,该基因的重组表达载体构建正确,可在293T细胞内瞬时表达。[结论]VP4基因的重组真核表达载体构建成功并可在真核表达细胞内表达,该研究为VP4基因的DNA疫苗的研发及应用奠定了基础。     

临床常用几种抗菌药物对HPS抗菌活性研究

[目的]研究抗菌药物恩诺沙星、环丙沙星、加替沙星对27株副猪嗜血杆菌临床分离株体外抗菌活性,从而观察副猪嗜血杆菌对喹诺酮类抗菌药物的敏感性。[方法]采用微量肉汤稀释法测定MIC,参考标准为美国临床和实验室标准协会(CLSI)。[结果]恩诺沙星(MIC50,MIC90,0.25μg/mL,2μg/mL)、环丙沙星(MIC50,MIC90,0.125μg/mL,2μg/mL)、加替沙星(MIC50,MIC90,0.125μg/mL,1μg/mL)均表现出一定的抑菌活性,且加替沙星的抑菌活性最明显。在耐药性方面,副猪嗜血杆菌对恩诺沙星的耐药性最强(22.2%),环丙沙星(3.8%)和加替沙星(7.4%)具有轻微的耐药性。[结论]抗菌药物恩诺沙星、加替沙星以及环丙沙星对副猪嗜血杆菌临床分离株具有一定的抗菌活性,在耐药性方面,HPS已经对恩诺沙星表现出一定的耐药性,因此,今后在临床上遇到副猪嗜血杆菌引起的相关疾病,可以采用合理的给药方案进行疾病的治疗,对于预防耐药菌株产生至关重要。     

副猪嗜血杆菌实时荧光PCR快速检测方法的建立和应用

[目的]建立一种快速准确定量检测副猪嗜血杆菌（HPS）的检测方法。[方法]根据GenBank公布的副猪嗜血杆菌16 S rRNA基因序列,选择其保守区域设计1对特异性引物。通过优化引物浓度和退火温度,建立快速定量检测副猪嗜血杆菌的实时荧光PCR方法,并评价了其特异性和稳定性。[结果]建立的实时荧光PCR方法最低检测限是50拷贝/μl,重复性好,变异系数均小于2%。该方法特异性强,只能检测副猪嗜血杆菌,不能检测到猪链球菌2型、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌DH5α和猪伤寒沙门氏菌。采用该方法对10份临床疑似HPS感染样本进行检测,其结果与细菌分离培养和常规PCR的结果一致。[结论]建立的实时荧光PCR方法快速、灵敏、特异、重复性高,可用于HPS感染的临床快速检测。     

副猪嗜血杆菌EZ-Tn5转座子插入突变体库的构建及减毒株的筛选（摘要）

[目的]获得副猪嗜血杆菌减毒株.[方法]应用转座子技术构建转座子插入突变体库,卡那抗性筛选阳性菌株,PCR扩增卡那特异片段去除假阳性,小鼠感染试验检测突变株毒力,并对获得的减毒株进行生物学特性检测。[结果]所获得减毒突变菌株具有与野毒株相似的增殖能力,传代后毒力稳定,遗传学特性稳定。[结论]该研究结果为进一步探讨HPS毒力因子、致病机制奠定了基础。     

红芪多糖的提取分离和含量测定

[目的]对红芪中的多糖进行提取分离和含量测定.[方法]采用水提醇沉法提取红芪多糖,并采用苯酚-硫酸法进行含量测定.[结果]线性回归方程为：y=0.007X-0.013,R=0.999 6,表明在0～30 mg/L范围内,葡萄糖浓度与吸光度的线性关系良好.红芪药材和红芪精制多糖HPS中的多糖含量分别为4.94％（RSD=1.06％）和45.30％（RSD=1.40％）,平均回收率为99.12％（RSD=0.65％）.[结论]该方法简便、快速、准确、灵敏度好,可用于红芪多糖的提取分离和含量测定.     

鸭源致病性大肠杆菌Ⅰ型菌毛pilA基因序列测定及生物信息学分析

据GenBank中人源大肠杆菌pilA基因序列,由Oligo 6.0设计一对引物,以提取的鸭源致病性大肠杆菌基因组为模板,进行PCR扩增,获得了5株鸭源致病性大肠杆菌的pilA基因,序列测定和生物信息学分析表明:鸭源致病性大肠杆菌pilA基因核苷酸序列长度为549 bp,编码182aa,与人源、鸡源及猪源大肠杆菌pilA基因之间核苷酸同源性为87.3%~100.0%,氨基酸同源性为87.5%~100.0%。对不同宿主来源大肠杆菌pilA基因所编码蛋白的二级结构、亲水性、抗原性、抗原表位进行预测分析比较,结果显示Ⅰ型菌毛间具有一定的结构相似性,并存在一定的共同抗原位点;系统进化分析表明,各菌株之间的pilA基因遗传相关性与其宿主来源及血清型之间没有严格的相关性。     

家蚕TPR基因的克隆

[目的]克隆家蚕TPR基因,为研究该基因功能提供依据。[方法]利用Trizol法提取家蚕蛹期总RNA,再用RT-PCR的方法对家蚕TPR基因进行克隆。[结果]成功得到家蚕TPR基因全cDNA序列,并用PCR扩增得到了TPR基因的ORF,全长858bp。[结论]首次对家蚕TPR家族基因进行了克隆,为今后对该基因功能研究奠定了坚实的基础。     

家蚕TPR基因的克隆

[目的]克隆家蚕TPR基因,为研究该基因功能提供依据。[方法]利用Trizol法提取家蚕蛹期总RNA,再用RT-PCR方法对家蚕TPR基因进行克隆。[结果]成功得到家蚕TPR基因全cDNA序列,并用PCR扩增得到了TPR基因的ORF,全长858 bp。[结论]首次对家蚕TPR家族基因进行了克隆,为今后对该基因功能研究奠定了坚实的基础。     

水稻强分蘖基因MT1的分子定位及候选基因的预测

[目的]定位水稻强分蘖基因MT1并预测候选基因。[方法]通过图位克隆的方法精细定位MT1基因,进而克隆该基因。[结果]克隆出水稻强分蘖基因MT1。[结论]为MT1的功能分析奠定了基础。     

花粉育性基因MS2的克隆与RNAi载体构建

［目的］研究MS2基因的功能。［方法］采用RT-PCR克隆棉花花粉育性（MS2）基因cDNA片段,将MS2反义基因、与陆地棉chinase基因第一个内含子和MS2正义基因3个片段串联在一起,经鉴定后,插入到植物表达载体中PBI121中。［结果］成功构建了MS2基因的RNAi载体p35S12MSIn。［结论］该载体的构建为棉花不育材料的遗传转化创造了条件。