太平洋鳕神经坏死病毒衣壳蛋白(CP)的原核表达及条件优化

为深入研究太平洋鳕Gadus macrocephalus神经坏死病毒(Pacific cod nervous necrosis virus,PCNNV)衣壳蛋白(capsid protein,CP)的功能,将PCNNV cp基因连接到p ET-32a原核表达载体中,构建原核表达重组载体p EVCP,将其转化至大肠杆菌E.coli BL21(DE3)表达系统中进行融合表达,对诱导剂IPTG浓度、诱导时间和温度等诱导表达条件进行优化,采用SDS-PAGE及质谱技术鉴定表达产物。结果表明:本研究中成功构建了重组载体p EVCP,表达的目的蛋白相对分子质量约为55 000;目的蛋白经质谱鉴定,有6个肽段的氨基酸序列与预期一致;对重组菌株p EVCP/BL21的最佳诱导条件为IPTG浓度0.1 mmol/L、最佳诱导时间3 h、温度30℃。本研究结果可为后续冷水鱼类病毒疫苗的研制及病毒快速检测试剂盒的研发奠定基础。     

赤点石斑鱼神经坏死病毒MCP基因原核表达条件优化

[目的]优化赤点石斑鱼神经坏死病毒的主衣壳蛋白（MCP）基因的原核表达条件。[方法]采用RT-PCR技术扩增出赤点石斑鱼神经坏死病毒MCP基因,构建重组表达载体pRSETA-MCP,以其转化大肠杆菌BL21（DE3）plysS,在不同培养基、温度、pH值条件下进行诱导表达。[结果]重组菌在SOB和LB培养基、pH值7.0、37℃条件下表达量最高,所得的融合蛋白分子量约为44.5 kD。[结论]该研究为RGNNV-MCP疫苗研制奠定了基础。     

太平洋鳕抗冻基因AFP4的原核表达及多克隆抗体的制备

为进一步研究太平洋鳕Gadus macrocephalus抗冻蛋白AFP4的功能,通过RT-PCR方法克隆得到太平洋鳕4型抗冻蛋白基因(AFP4)的开放阅读框(open reading frame,ORF),构建原核表达载体并优化表达条件,利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测抗体的效价,用Western-blot法分析重组蛋白的免疫原性。结果表明:AFP4基因编码区长度为375 bp,编码125个氨基酸;将AFP4基因的ORF与载体p ET-32a连接,构建重组体p ET-32a-AFP4,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中;经诱导、表达和条件优化,发现该重组体在37℃、0.01 mmol/L IPTG条件下诱导3 h获得最大的表达量;对该重组蛋白进行纯化,利用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测该抗体效价为1∶1 600 000;Western blot分析显示,重组蛋白可以与兔抗AFP4多克隆抗体发生特异性结合,表明该重组蛋白具有免疫原性。本研究结果可为深入研究太平洋鳕AFP4蛋白功能提供理论依据。     

太平洋鳕抗冻基因AFP4的原核表达及多克隆抗体的制备

为进一步研究太平洋鳕Gadus macrocephalus抗冻蛋白AFP4的功能,通过RT-PCR方法克隆得到太平洋鳕4型抗冻蛋白基因(AFP4)的开放阅读框(open reading frame,ORF),构建原核表达载体并优化表达条件,利用纯化的重组蛋白制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测抗体的效价,用Western-blot法分析重组蛋白的免疫原性。结果表明:AFP4基因编码区长度为375 bp,编码125个氨基酸;将AFP4基因的ORF与载体p ET-32a连接,构建重组体p ET-32a-AFP4,并将其转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中;经诱导、表达和条件优化,发现该重组体在37℃、0.01 mmol/L IPTG条件下诱导3 h获得最大的表达量;对该重组蛋白进行纯化,利用纯化的蛋白免疫新西兰大白兔制备多克隆抗体,采用间接ELISA法检测该抗体效价为1∶1 600 000;Western blot分析显示,重组蛋白可以与兔抗AFP4多克隆抗体发生特异性结合,表明该重组蛋白具有免疫原性。本研究结果可为深入研究太平洋鳕AFP4蛋白功能提供理论依据。     

太平洋鳕抗菌肽Hepcidin基因克隆及体外表达研究

为揭示太平洋鳕Gadus macrocephalus抗菌肽Hepcidin(GmHep)的分子结构和表达特性,利用qPCR法对平均体质量为2.438 kg鳕不同组织和发育早期的GmHep表达模式进行了探讨,分别构建了原核(pET-32a-GmHep)和真核(pEGFP-GmHep)表达载体,研究了GmHep的体外表达特点。结果表明:GmHep基因开放阅读框长为297 bp,编码98个氨基酸,蛋白相对分子质量为10 833.56,该肽N端具22个氨基酸残基的信号肽,成熟肽含有8个半胱氨酸残基、4个二硫键;氨基酸序列比对发现,GmHep与大西洋鳕Hepcidin同源性最高(93%),但与其他鱼类Hepcidin同源性较低(小于60%),预示其功能具有独特性;GmHep在肝脏中的表达量显著高于其他组织(P<0.05),且GmHep在5、10、30、37、40日龄仔稚鱼中均有表达(P<0.05);GmHep体外诱导表达优化条件为IPTG浓度0.01 mmol/L、30℃、诱导4 h;GmHep在EPC细胞系中主要定位在细胞质中。研究表明,本研究成功构建了两种GmHep体外表达载体,确定GmHep为肝分泌型,且在太平洋鳕发育早期发挥一定作用。     

猪戊型肝炎病毒swCH189株衣壳蛋白基因CP239片段原核表达条件的优化

为了提高猪戊型肝炎病毒swCH189株衣壳蛋白基因CP239片段在大肠杆菌中的表达量,研究了载体、温度、转速、诱导时间以及诱导剂IPTG浓度等不同条件对衣壳蛋白基因CP239片段融合蛋白表达量的影响。结果表明,用LB培养基于37℃培养3.5 h后,采用终浓度为0.3 mmol/L的IPTG在37℃、200r/min诱导培养4 h,pET32a-CP239融合蛋白表达量最大;SDS-PAGE检测结果表明pET32a-CP239融合蛋白的分子质量与预期大小一致,约为45.3 ku;Western blotting结果表明,pET32a-CP239融合蛋白可以与抗-HEV阳性血清发生特异性反应,并具有良好的反应原性,说明衣壳蛋白基因CP239片段蛋白得到正确表达。     

一株貉源犬瘟热病毒核衣壳蛋白的原核表达

根据GenBank中犬瘟热病毒(CDV)核衣壳蛋白(N)基因的核苷酸序列设计合成1对引物,经RT-PCR从病毒总RNA中扩增出约1600bp的片段,将此片段克隆于pMD18-Tsimple载体。经测序分析表明,与其它毒株N基因序列的同源性很高。再将其定向克隆于原核表达载体pPROEXTMHTa中,转化感受态E.coli BL21细胞,经IPTG诱导表达分子量约63Ku的重组N蛋白。     

PRRS病毒核衣壳蛋白基因的原核表达

根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)核酸序列设计1对引物，用RT—PCR扩增出美洲型PRRSV的核衣完蛋白(N)基因，克隆到pGEM—Teasy载体中，再亚克隆到表达载体pGEX—6p—1谷既甘肽—S—转移酶(GST)基因的下游。重组质粒转化大肠杆菌BL21，用IPTG于37℃条件下诱导，经SDS—PAGE和Western blotting分析，GST—N融合蛋白的分子质量约为39．5ku，另3种不同大小的GST—N降解产物，分子质量分别为33．0、30．5和27．5ku，其中39．5和30．5ku的降解产物分别占菌体蛋白的30．9％和15．3％。结果表明：PRRSV核衣壳蛋白基因在大肠杆菌中以GST融合蛋白的形式得到高效表达，且表达产物能与PRRSV抗体阳性的猪血清发生特异性反应，可作为PRRS诊断抗原。     

鸡贫血病毒衣壳蛋白基因的原核表达

[目的]为VP1蛋白的免疫学研究和鸡贫血病毒基因工程疫苗的研制奠定基础。[方法]将1个新克隆的鸡贫血病毒vpl基因（AF448446）在大肠杆菌DE3中进行表达,并对该蛋白进行纯化。[结果]结果表明：已成功构建了表达载体pET30（b^＋）-vp1;VP1蛋白已成功诱导表达并得以纯化;获得的VP1蛋白序列与已发表的VPl蛋白序列存在差异。[结论]试验克隆的vp1基因大小为1347bp,编码449个氨基酸的蛋白。     

猪细环病毒1型衣壳蛋白的原核表达及鉴定

为了制备猪细环病毒1型(TTSuV1)抗体,并为建立TTSuV1免疫学检测方法奠定基础。用PCR技术扩增TTSuV1衣壳蛋白(Cap)基因片段,与载体pET-32a定向连接,构建重组原核表达质粒pET-32a-Cap,转化入大肠杆菌Rosetta(DE3),诱导重组阳性菌表达,SDS-PAGE研究融合蛋白表达情况。对重组融合蛋白进行纯化、复性后,免疫BALB/c小鼠4次来制备鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体。分别以鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体和TTSuV1猪阳性血清为一抗,对重组融合蛋白进行免疫印迹检测。结果显示,成功表达了TTSuV1Cap截短体融合蛋白,表达产物以包涵体形式存在,重组蛋白可与鼠抗TTSuV1-Cap蛋白抗体及TTSuV1猪阳性血清发生特异性结合,表明表达的TTSuV1-Cap融合蛋白具有良好的免疫原性和反应原性。     

太平洋鳕性腺发育及营养来源的初步研究

通过对大连海域太平洋鳕Gadus macrocephalus的繁殖力、卵径分布、性腺指数(GSI)和肝指数(HSI)进行周年调查,确定出太平洋鳕的繁殖期,分别测定了不同发育期太平洋鳕性腺、肝脏和肌肉的生化组成、能量密度变化,并观察了不同发育期太平洋鳕性腺和肝脏的组织学变化.结果表明:大连海域太平洋鳕的卵巢从12月开始进入第Ⅳ期,至翌年2月份排放;精巢处于Ⅳ、Ⅴ期的时间较长,11月份就有达到成熟的个体;从太平洋鳕肝脏组织学的变化来看,脂滴的体积变化很大,说明在繁殖过程中,肝脏经历了一个脂肪先积累又被大量消耗的过程;太平洋鳕在繁殖过程中,各个组织的能量密度变化较小,但粗蛋白、粗脂肪、粗灰分等成分变化较大.研究表明,太平洋鳕性腺发育的脂肪主要可能来源于肝脏,而肌肉蛋白的下降可能充当了性腺发育中蛋白质的主要来源.     

魔芋花叶病毒衣壳蛋白的原核表达和多克隆抗体制备

采用小RNA测序技术对甘肃省榆中县疑似感染病毒病的当归[(Angelica sinensis(Oliv.)Diels]样品进行测序鉴定,发现样品中含有魔芋花叶病毒(Konjac mosaic virus,KoMV),通过反转录PCR(RT-PCR)扩增KoMV衣壳蛋白(capsid protein, CP)的cp基因,克隆的KoMV cp基因连接原核表达载体pET-28a(+),导入E.coli Rosetta^TM(DE3)诱导表达蛋白,在Ni-NTA重力柱层析作用下纯化CP融合蛋白,并以此作为抗原免疫新西兰大耳白兔制备多克隆抗体。序列分析表明：KoMV cp基因片段大小为840 bp,编码280个氨基酸的外壳蛋白;与GenBank已注册同源性较高的KoMV分离物相比,核苷酸序列相似性为85.58%～99.41%,氨基酸序列相似性为89.32%～99.29%;KoMV的病毒种群分布存在明显的区域性和寄主差异。SDS-PAGE显示,不同温度诱导下KoMV CP融合蛋白在E.coli Rosetta^TM(DE3)中均以包涵体的形式大量表达,融合蛋...     

车前草花叶病毒衣壳蛋白的原核表达和多克隆抗体制备

为制备车前草花叶病毒(Plantago asiatica mosaic virus,PlAMV)衣壳蛋白(capsid protein,CP)及其多克隆抗体,采用RT-PCR方法从甘肃省种植的切花百合上克隆了PlAMV cp基因的部分序列,连接表达载体pET-28a(+),转化Escherichia coli BL21...     

太平洋鳕仔鱼消化系统发育形态学和组织学观察

采用切片技术和光学显微镜对1~50日龄太平洋鳕Gadus macrocephalus仔鱼的消化系统进行组织学和形态学观察。结果表明:初孵仔鱼消化系统基本没有分化,口和肛门尚未与外界相通,可见肝脏和胰脏;3日龄时,口裂形成,肠道开始分化;6日龄时,消化道已经分化出口咽腔、食道、胃前体、肠和直肠,上下颌可张合,初步具备摄食能力;12日龄时,卵黄囊完全消失,肠道皱褶和黏液细胞数量逐渐增多,消化系统逐渐发育完成,营外源性营养;仔鱼发育至47日龄时,肠道呈螺旋状,消化器官和消化腺趋于完善,接近成鱼。本研究可为太平洋鳕苗种的科学管理和营养饲料学方面的深入研究提供理论依据。     

总氨态氮对太平洋鳕仔稚鱼的急性毒性研究

为确保太平洋鳕Gadus macrocephalus人工育苗生产过程中的水质安全,采用换水式水生生物毒性试验方法,研究了总氨态氮对不同规格(体长4.37、4.88、5.83、7.46 mm)太平洋鳕仔稚鱼的急性毒性。结果表明:在水温为8.5~10.0℃、pH为7.96~8.14、溶氧为7.0~8.0 mg/L、盐度为29~30条件下,水中总氨态氮对不同日龄太平洋鳕仔稚鱼的毒性不同;对于4、15、22和35日龄的太平洋鳕仔稚鱼,水中总总氨态氮的安全浓度分别为11.518、9.576、1.982、0.959 mg/L,对应非离子氨态氮的安全浓度分别为0.219、0.182、0.038、0.018 mg/L。研究表明,随着太平洋鳕仔稚鱼个体的发育,其对水中总氨态氮的耐受能力逐渐降低。     

传染性造血器官坏死病病毒CJ-13株糖蛋白的原核表达及免疫原性

【目的】克隆传染性造血器官坏死病病毒(IHNV)CJ-13株糖蛋白(G蛋白)基因,构建原核表达载体,并检测其在大肠杆菌BL21中的表达情况,为IHNV诊断试剂盒和疫苗的研制奠定基础。【方法】设计1对G基因特异引物对G基因进行RT-PCR扩增,将扩增产物克隆到pGEM-T Easy载体上,构建重组质粒pGEM-T Easy-G,经双酶切鉴定、核苷酸序列分析后,将G基因亚克隆到pET-32a(+)原核表达载体上,构建传染性造血器官坏死病病毒G基因原核表达质粒pET-32a-G,转化至宿主菌BL21中,诱导表达目的蛋白,采用SDS-PAGE、Western blot和ELISA等方法对表达产物进行分析。【结果】成功克隆了IHNV G蛋白基因,该基因长度为1 527bp。成功构建了原核表达质粒pET-32a-G,诱导表达出约76ku的产物,与预期分子质量大小相符。Western blot分析结果显示,所表达的G蛋白能够被小鼠抗IHNV血清识别。间接ELISA结果显示,小鼠抗G蛋白血清能够识别IHNV全病毒。【结论】成功构建了IHNV G蛋白原核表达系统,重组G蛋白具有良好的反应原性和免疫原性。     

大蒜B病毒CP基因的原核表达及抗血清制备

制备抗大蒜B病毒(Garlic virus B,GarV-B)CP血清,为研究侵染大蒜6种葱X病毒属(Allexivirus)病毒之间的血清学关系以及大田检测GarV-B奠定基础。该研究根据GenBank报道的GarV-B序列设计引物,扩增从六安市寿县分离获得的GarV-B外壳蛋白基因(CP)并进行序列比对分析。将GarV-B的CP基因插入表达载体pS-BET,在大肠杆菌BL21(DE3)plys E菌株中诱导表达。表达的CP经12%SDS-PAGE和5%～20%梯度SDS-PAGE两次制备电泳纯化,免疫小鼠获得抗CP血清。Western blot分析抗体的特异性,采用ELISA分析抗体能否与天然GarV-B病毒结合。结果显示:GarV-B的CP基因与目前已报道的GarV-B不同分离物CP基因核苷酸序列的同源性为89%～90%,氨基酸序列同源性为92%～93%。表明制备的抗体对GarV-B的CP具有高度特异性,且能够与天然GarV-B病毒粒子结合。因此本研究制备的抗GarV-B的CP血清可以用于该病毒的检测。