红鳍东方鲀gsdf基因的克隆及表达模式分析

为研究红鳍东方鲀Takifugu rubripes的性别决定因子(gonadal soma derived factor,GSDF),利用c DNA末端快速扩增技术(RACE)首次克隆了红鳍东方鲀gsdf基因(Trgsdf)的c DNA全长序列(Gen Bank登陆号:KR914667)。结果表明:Trgsdf c DNA序列全长为1734 bp,其中5'端非编码区144 bp,开放阅读框648 bp,3'端非编码区942 bp,共编码215个氨基酸;预测的氨基酸序列中存在1个长度为19个氨基酸的信号肽和相同长度的跨膜区,1个N-糖基化位点NST,1个TGF-β家族成员特有的保守结构域;BLAST同源性分析结果显示,红鳍东方鲀GSDF氨基酸序列与其他鱼类的相似性为26%⁵8%;系统发育分析结果显示,鱼类GSDF单独聚为一支,与TGF-β超家族内的其他成员分开,红鳍东方鲀与青鳉Oryzias latipes GSDF的亲缘关系最近,先聚为一支,后与三斑海猪鱼Halichoeres trimaculatus聚在一起,与矛尾鱼Latimeria menadoensis的GSDF亲缘关系最远;应用RT-PCR技术检测Trgsdf mRNA在雌性和雄性红鳍东方鲀成鱼不同组织中的表达,结果显示,Trgsdf mRNA在卵巢和精巢中高表达,在皮肤和肌肉组织中微量表达,在其他组织中无表达;采用相对实时荧光定量PCR方法比较了成鱼卵巢和精巢中Trgsdf mRNA的表达量,结果显示,Trgsdf mRNA在精巢中的表达量显著高于卵巢(P<0.05),约为卵巢表达量的6倍。研究表明,gsdf基因可能在红鳍东方鲀的性腺尤其是精巢的分化和发育过程中起着重要的作用。     

红鳍东方鲀Sirt1基因的克隆及其原核表达

【目的】克隆红鳍东方鲀Sirtuin1(Sirt1)基因编码阅读框(ORF),并对其进行原核表达。【方法】采集红鳍东方鲀脂肪组织,提取其总RNA,采用RT-PCR方法扩增和克隆红鳍东方鲀Sirt1基因的ORF,构建其原核表达载体pET32a/Sirt1,并在大肠杆菌Rosetta(DE3)中进行表达。【结果】红鳍东方鲀Sirt1基因ORF区由2 070个核苷酸组成,编码689个氨基酸。根据红鳍东方鲀Sirt1ORF核苷酸序列推测的氨基酸序列与其他物种进行比对,发现其与罗非鱼(Oreochromis niloticus)、非洲齿鲤(Nothobranchius furzeri)、科恩氏假鳃鳉(Nothobranchius kuhntae)、斑马鱼(Danio rerio)、人(Homo sapiens)和小鼠(Mus musculus)的同源性分别为82%,82%,81%,66%,72%和69%;成功构建了重组质粒pET32a/Sirt1,用IPTG进行诱导表达,SDS-PAGE电泳结果显示,在约105ku处有特异性的蛋白条带出现。【结论】克隆得到红鳍东方鲀Sirt1基因的ORF序列,并成功对其进行了原核表达。     

红鳍东方鲀抗苗勒氏管激素(AMH)基因在不同发育时期的组织表达

为研究抗苗勒氏管激素(AMH)基因在红鳍东方鲀Takifugu rubripes各组织和不同发育时期的表达情况以及在性别分化和性腺发育等过程中的作用,利用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)技术对红鳍东方鲀成鱼的肾脏、脑、心脏、脾脏、肝脏、精巢和卵巢等组织进行了amh基因的表达分析以及不同发育时期(23、30、40、60、80日龄及2龄和3龄鱼)红鳍东方鲀个体水平上amh基因的表达分析。结果表明:红鳍东方鲀3龄成鱼脾脏、肾脏和肝脏中的amh基因表达量极显著高于其他组织(P<0.01),在精巢和心脏中的表达量极显著高于卵巢和脑(P<0.01),其中脾脏中表达量最高,脑中表达量最低;红鳍东方鲀23日龄、30日龄、2龄和3龄鱼中,雄鱼amh基因的表达量极显著高于同期雌鱼(P<0.01),而60日龄和80日龄时雌鱼表达量显著高于雄鱼(P<0.05),40日龄时雌、雄鱼的表达量无显著性差异(P>0.05),3龄时雌、雄个体性腺中amh基因的表达量均显著高于2龄鱼(P<0.05);雄性幼鱼amh基因的表达量从23³0日龄呈增长趋势,且在30日龄时达到最高,随后逐渐降低,而雌鱼整体amh基因的表达量也呈现先升高后降低的趋势,80日龄时雌鱼amh基因表达量最高。研究表明,amh基因在红鳍东方鲀的性腺发育和性别分化过程中发挥着一定的作用。     

红鳍东方鲀抗苗勒氏管激素(AMH)基因在不同发育时期的组织表达

为研究抗苗勒氏管激素(AMH)基因在红鳍东方鲀Takifugu rubripes各组织和不同发育时期的表达情况以及在性别分化和性腺发育等过程中的作用,利用荧光实时定量PCR(qRT-PCR)技术对红鳍东方鲀成鱼的肾脏、脑、心脏、脾脏、肝脏、精巢和卵巢等组织进行了amh基因的表达分析以及不同发育时期(23、30、40、60、80日龄及2龄和3龄鱼)红鳍东方鲀个体水平上amh基因的表达分析。结果表明:红鳍东方鲀3龄成鱼脾脏、肾脏和肝脏中的amh基因表达量极显著高于其他组织(P0.01),在精巢和心脏中的表达量极显著高于卵巢和脑(P0.01),其中脾脏中表达量最高,脑中表达量最低;红鳍东方鲀23日龄、30日龄、2龄和3龄鱼中,雄鱼amh基因的表达量极显著高于同期雌鱼(P0.01),而60日龄和80日龄时雌鱼表达量显著高于雄鱼(P0.05),40日龄时雌、雄鱼的表达量无显著性差异(P0.05),3龄时雌、雄个体性腺中amh基因的表达量均显著高于2龄鱼(P0.05);雄性幼鱼amh基因的表达量从23~30日龄呈增长趋势,且在30日龄时达到最高,随后逐渐降低,而雌鱼整体amh基因的表达量也呈现先升高后降低的趋势,80日龄时雌鱼amh基因表达量最高。研究表明,amh基因在红鳍东方鲀的性腺发育和性别分化过程中发挥着一定的作用。     

红鳍东方鲀IgM重组表达与多克隆抗体制备

红鳍东方鲀（Takifugu rubripes）是我国重要的海水养殖经济鱼类,探究红鳍东方鲀IgM的结构与功能对其病害防治与免疫系统的研究均有重要意义。本研究克隆获取了红鳍东方鲀IgM的重（H）链恒定（C）区序列,序列大小为1326bp,编码442个氨基酸,将获得的IgM序列连接至pET28a表达载体上,利用大肠杆菌BL21进行体外重组表达,SDS-PAGE结果显示：重组蛋白红鳍东方鲀IgM（TrIgM）大小约为62kDa,重组表达的IgM主要以包涵体形式表达。通过体外复性获得可溶性TrIgM蛋白, 将制备的TrIgM蛋白免疫BALB/c小鼠,获得了TrIgM鼠抗血清,Western blot检测结果表明：制备的鼠抗血清可以与重组TrIgM蛋白和红鳍东方鲀天然血清中的IgM的重链蛋白特异性结合。本研究中制备的抗血清可作为检测红鳍东方鲀IgM的特异性抗体,为红鳍东方鲀相关免疫检测提供基础。     

壳聚糖纳米颗粒对红鳍东方鲀生长、免疫酶及免疫基因的影响

为了研究壳聚糖纳米颗粒这一新型免疫添加剂对红鳍东方鲀Takifugu rubripes生长性能、免疫指标的影响,以体质量为(9.910±0.306)g的红鳍东方鲀幼鱼为研究对象,试验设6组,每组设3个平行,每个平行放30尾鱼,投喂基础饲料中分别添加0(对照)、0.2%的壳寡糖(COS)、0.2%的壳聚糖(CS),以及0.2%、0.1%、0.02%的壳聚糖纳米颗粒(CN)的试验饲料,养殖周期50 d,试验结束后测定各组红鳍东方鲀的特定生长率,肝、脾、肾组织中碱性磷酸酶(AKP)、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、酸性磷酸酶(ACP)及溶菌酶(LZM)的活性,以及补体c3、热休克性蛋白hsp70、免疫调节因子ifr2、Toll样受体tlr3等免疫基因的相对表达量。结果表明:饲料中添加壳聚糖纳米颗粒和壳寡糖能显著促进红鳍东方鲀的生长(P<0.05);饲料中添加壳聚糖纳米颗粒能显著增加鱼体肝脏的AKP、CAT酶活性,脾脏的ACP、LZM活性,肾脏的SOD、LZM酶活性(P<0.05);壳聚糖纳米颗粒对鱼体ifr2基因表达的促进作用不明显(P>0.05),但能显著提高脾脏中c3、tlr3、hsp70的相对表达量(P<0.05)。研究表明,饲料中添加壳聚糖纳米颗粒对红鳍东方鲀的生长具有促进作用,并能提高鱼体的免疫力,同时与壳寡糖的作用效果相当。     

红鳍东方鲀FoxO1基因的原核表达及纯化

采集红鳍东方鲀脂肪组织提取其总RNA,采用RT–PCR方法扩增和克隆红鳍东方鲀FoxO1基因的ORF,并构建其原核表达载体p ET–32/FoxO1,在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行表达,通过IPTG诱导表达,对重组FoxO1蛋白进行可溶性分析、纯化及鉴定,结果表明:重组质粒p ET32a/FoxO1被成功构建;用IPTG进行诱导表达,融合蛋白主要以可溶蛋白形式存在,能与抗His标签的兔多克隆抗体发生特异性反应;纯化出了融合表达蛋白,获得了相对分子质量约为110 000的重组蛋白。     

红鳍东方鲀微卫星DNA多态性初步分析

用红鳍东方(Takifugu rubripes)微卫星标记对两个不同群体红鳍东方的DNA多态性进行分析。经20对引物的扩增,得到每个个体的微卫星片段,其中16对引物能扩增出较好的谱带。用2%的琼脂糖凝胶电泳检测微卫星标记的PCR扩增产物,并对扩增结果进行了统计分析。计算得到两个群体的平均等位基因数分别为1.875 0和2.437 5;多态信息含量(PIC)平均值分别为0.275 1和0.379 4;平均杂合度观测值分别为0.025和0.200。统计结果初步表明两个不同群体平均杂合度较低,遗传多态性不高。     

3个线粒体基因在红鳍东方鲀和暗纹东方鲀中的比较分析

由于形态学无法更精准地鉴别部分红鳍东方鲀和暗纹东方鲀,因此需要通过分子手段鉴别此类无法直观辨认的东方鲀。该研究以15尾红鳍东方鲀和30尾暗纹东方鲀为材料,使用NCBI上红鳍东方鲀和暗纹东方鲀的线粒体全基因组中3个基因COⅠ、COⅡ、COⅢ保守区域通过Primer 5.0进行引物设计。将45个样品在摸索得到的最适条件下进行扩增并测序,对测序结果进行检验,分析种间差异并进行碱基组成性分析,得出COⅠ上有9个SNPs,COⅡ上有4个SNPs,COⅢ有10个SNPs,使用MEGA-X进行进化树分析得出,该研究所设计的引物可以有效地鉴别2种东方鲀。     

饥饿对红鳍东方鲀免疫细胞功能的影响

对红鳍东方鲀Fugu rubripes进行正常投喂和饥饿处理(10、20、30、40 d)后,测定红鳍东方鲀外周血中白细胞数量以及脾脏中淋巴细胞的转化率和巨噬细胞的吞噬率。结果表明:饥饿后红鳍东方鲀外周血中白细胞的数量明显高于正常投喂组,且在饥饿20 d时白细胞的数量达到最大值;饥饿后脾脏中淋巴细胞的增殖转化能力与转化率比正常投喂组高,饥饿10 d时达到最大值,随着饥饿时间的延长,淋巴细胞的转化率逐渐降低;饥饿后脾脏中巨噬细胞的吞噬活性与吞噬率均高于正常投喂组,且在饥饿20 d时达到最大值。     

红鳍东方鲀防御素db-1基因的原核表达分析

采用原核表达方法高效表达红鳍东方鲀Takifugu rubripes防御素db-1基因,并获得该基因的重组表达产物。通过RT-PCR扩增获得红鳍东方鲀防御素db-1基因成熟肽编码序列,将其连入pET32a+载体,构建原核表达载体pET32a-m DB-1,然后将其转入至大肠杆菌表达菌株Rosetta(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导目的基因表达,通过SDS-PAGE和Western Blotting检测该蛋白,并利用Ni-NTA亲和层析纯化该蛋白,最后以Anti-Mus defensin Beta2抗体为探针的Elisa反应鉴定该蛋白。结果表明:红鳍东方鲀db-1基因在大肠杆菌中高效表达,并纯化得到了这种重组防御素融合蛋白。本研究中提供了一种简单、高效获取重组防御素蛋白的方法,可为其应用和生产提供支持。     

低温诱导红鳍东方鲀雄性化及性腺分化的组织学观察

为探索无需紫外线照射、无需投喂性激素、操作简单的低温诱导红鳍东方鲀Takifugu rubripes雄性化的新方法,分别在孵化后15、45、75d将鱼苗进行15℃和17℃低温处理65d,以正常培育温度21℃为对照组,设置平行试验组,并对其性比及性别分化的组织学进行了观察。结果表明:(1)在15℃条件下,试验组雄性率最高可达(74.70±2.79)%;在17℃条件下,试验组雄性率最高为(59.60±3.49)%;在21℃条件下,对照组雄性率为(51.57±0.06)%;温度与雄性率呈负相关(R=-0.827),与雌性率呈正相关(R=0.823)。(2)在21℃条件下,对照组孵化后48d时出现卵巢腔,标志着卵巢分化的开始,68d时生殖腺柄部出现裂缝状的输精管原基,标志着精巢开始分化;在17℃条件下,试验组孵化后63d时观察到明显的卵巢腔,83d时出现输精管原基性腺;而在15℃条件下,试验组孵化后73d时出现明显卵巢腔,93d时出现精小叶,标志组织学上的分化。研究表明,随着处理温度的升高,性腺中细胞分裂速度呈线性关系,在一定范围内升温有助于性腺的发育。     

利用微卫星标记指导红鳍东方鲀亲本选配

为制定红鳍东方鲀家系配组方案提供可行性指导,利用微卫星标记辅助红鳍东方鲀Takifugu rubripes家系的建立,选择34个微卫星标记对红鳍东方鲀两个群体进行遗传评估。结果表明:A群体的平均等位基因数(Na)和Nei基因多样性指数(He)分别为6.647 0和0.711 5,B群体的相应值分别为4.647 1和0.646 1,且两个群体之间的遗传差异达到显著性水平(P0.05);群体间的遗传分化系数(GST)为0.050 7,基因流(Nm)为4.679 6,表明红鳍东方鲀群体间存在低程度的遗传分化和一定程度的基因交流;分子方差分析(AMOVA)表明,遗传变异主要存在于群体内,所占比例为78.49%,而群体之间仅占21.51%;根据群体间Nei氏遗传距离构建UPGMA系统树,群体内个体之间的遗传距离为0.11~0.82,依据遗传距离的远近将全部个体分成多个分支,不同分支内含有数个个体;各项遗传参数表明,试验群体具备一定程度的遗传变异,不同个体之间拥有相对较远的亲缘关系,可以根据个体之间遗传距离制定育种计划,建立家系进行选育研究。研究表明,利用微卫星标记信息构建红鳍东方鲀家系的方法是切实可行的。     

红鳍东方鲀生长性状的遗传力估计及性状间相关关系的初步研究

为估计红鳍东方鲀Takifugu rubripes生长性状的遗传力及生长性状间的相关关系,构建了5个全同胞家系,测定了210日龄(504尾)和360日龄(500尾)红鳍东方鲀的体质量、体长和体全长等生长性状的表型值,构建固定模型,用全同胞法估计了210日龄和360日龄红鳍东方鲀的体质量、体长和体全长3个生长性状的遗传力。结果表明:红鳍东方鲀的体质量、体长和体全长3个生长性状的遗传力估计值在210日龄时分别为0.54、0.38、0.52,在360日龄时分别为0.46、0.37、0.44,这3个性状的遗传力属于中等和高等遗传力;体质量与体长,体质量与体全长,以及体长与体全长的遗传相关系数在210日龄时分别为0.99、0.99、0.98,在360日龄时分别为0.97、0.97、0.96,这3个性状之间的遗传相关呈高度正相关;测定了102日龄(296尾)红鳍东方鲀的体质量、体长和体高3个生长性状,利用回归模型建立了体质量(W)与体长(L)和体全高(H)的数学模型为W=e-8.513L2.046H0.742(R2=0.903)。本研究结果可为红鳍东方鲀的遗传育种研究提供参考。     

红鳍东方鲀去乙酰化酶SIRT3基因的克隆及原核表达

从红鳍东方鲀(Takifugu rubripes)肝脏组织中提取总RNA,通过RT–PCR扩增,获得SIRT3基因的编码阅读框(ORF),用原核表达载体p ET32a(+)构建p ET32a/SIRT3重组质粒,用异丙基–β–D–硫代半乳糖苷(IPTG)将重组质粒p ET32a/STRT3在大肠杆菌Rosetta(DE3)进行诱导表达,并用镍柱纯化融合表达蛋白。结果显示,红鳍东方鲀SIRT3基因(tr SIRT3)ORF区大小为1 263 bp大小,编码420个氨基酸。经IPTG诱导表达后,获得1个带组氨酸(His)标签的融合蛋白,目的蛋白主要存在于上清溶液中,为可溶性表达。用镍离子亲和层析柱对重组蛋白进行纯化,获得了相对分子质量约66 000的重组蛋白。     

冷休克诱导红鳍东方鲀雄核发育单倍体的条件优化

为探索无需卵子失活仅用冷休克方法诱导雄核发育单倍体,以红鳍东方鲀Takifugu rubripes为研究对象,试验选用L_9(3~4)设计,进行3因素3水平的正交试验,处理温度设为0、2、4℃,处理持续时间设为30、45、60 min,处理起始时间设为2、5、8 min,共9个试验组,并对其后代采用单个胚胎染色体计数法进行染色体数目统计及微卫星分析。结果表明:冷休克诱导得到的单倍体率最高为第7试验组和第9试验组,分别为受精后8 min在4℃下处理30 min和受精后5 min在4℃下处理60 min,单倍体率分别为86.7%和80.0%;根据正交试验直观分析结果,得出冷休克诱导红鳍东方鲀雄核发育单倍体的3因素最优组合为处理温度4℃、处理持续时间60 min、处理起始时间8 min;影响冷休克诱导单倍体的3因素主次顺序为处理温度处理起始时间处理持续时间;微卫星分析结果表明,单倍体携带的遗传基因全部为父本的遗传基因。研究表明,仅用冷休克方法可以成功诱导红鳍东方鲀雄核发育单倍体,雄核发育单倍体率高达86.7%,为进一步研究诱导红鳍东方鲀雄核发育二倍体奠定了基础。     

壳寡糖对红鳍东方鲀血液指标和非特异性免疫指标的影响

为研究壳寡糖(chitosan-oligosaccbarides,COS)对红鳍东方鲀Takifugu rubripes血清和血液生化指标及非特异性免疫指标的影响,选用体质量为(129.2±3.1)g的红鳍东方鲀600尾,随机分为C0、C1、C2、C3 4组,每组设3个平行,在基础饲料中分别添加0、500、1000、2000 mg/kg的壳寡糖,经56 d饲养后,测定其血液指标、抗氧化酶活性及其攻毒耐受性。结果表明:饲料中添加壳寡糖能显著提高血清中碱性磷酸酶、溶菌酶、过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活力和全血中血小板数量(P0.05),各项指标随壳寡糖添加量的增加整体呈升高趋势;饲料中添加壳寡糖能显著提高红鳍东方鲀肝脏组织中过氧化氢酶、超氧化物歧化酶活力(P0.05),显著降低丙二醛含量(P0.05);壳寡糖能明显提高红鳍东方鲀对迟缓爱德华氏菌和哈维弧菌的抵抗力。研究表明,在本试验条件下,饲料中添加2000 mg/kg壳寡糖能够提高红鳍东方鲀的非特异性免疫功能。     

红鳍东方鲀BAC数据库和ESTs数据库中微卫星的筛选与应用

利用Tandem Repeats Finder软件在红鳍东方鲀Takifugu rubriper BAC数据库和ESTs数据库中查找微卫星标记.选取其中22个序列(11个BAC-SSRs序列、11个EST-SSRs序列)设计引物,并将22对引物用于庄河、河北Ⅰ和河北Ⅱ3个群体,均能扩增出产物,其中EST-SSRs有2对引物扩增产物比预期扩增产物偏大,可能是相应基因组中有内含子导致.研究结果表明,EST-SSRs标记要比BAC-SSRs标记的多态性低,其中11个BAC-SSRs和9个EST-SSRs标记有很好的多态性,可以用于红鳍东方鲀的遗传多样性分析和重要经济性状筛选等方面的研究.     

红鳍东方鲀防御素db-1基因的原核表达分析

采用原核表达方法高效表达红鳍东方鲀Takifugu rubripes防御素db-1基因,并获得该基因的重组表达产物。通过RT-PCR扩增获得红鳍东方鲀防御素db-1基因成熟肽编码序列,将其连入pET32a+载体,构建原核表达载体pET32a-m DB-1,然后将其转入至大肠杆菌表达菌株Rosetta(DE3)感受态细胞中,经IPTG诱导目的基因表达,通过SDS-PAGE和Western Blotting检测该蛋白,并利用Ni-NTA亲和层析纯化该蛋白,最后以Anti-Mus defensin Beta2抗体为探针的Elisa反应鉴定该蛋白。结果表明:红鳍东方鲀db-1基因在大肠杆菌中高效表达,并纯化得到了这种重组防御素融合蛋白。本研究中提供了一种简单、高效获取重组防御素蛋白的方法,可为其应用和生产提供支持。