家蝇幼虫抗菌肽MDL-2干扰细菌功能的初步研究

研究了家蝇幼虫抗菌肽MDL-2对细菌细胞壁的溶解作用、细胞膜渗透性和代谢的影响.抗菌肽MDL-2在抗菌过程中首先与细菌的细胞壁相互作用,使其破裂.菌肽对革兰氏阴性细菌大肠杆菌的细胞壁的作用有浓度依赖性,而对革兰氏阳性细菌金黄色葡萄球菌,MDL-2在较低的浓度时即具有破坏细胞壁的作用;抗菌肽MDL-2与金黄色葡萄球菌的细胞膜作用曲线呈现典型的S型,有较强的协同效应,并随着作用时间的延长细胞的渗透性增强;抗菌肽对细菌的代谢功能有较强的干扰作用,阻碍菌体的生命活动,加速菌体死亡.     

猪凝血酶C端衍生肽抑菌活性和膜作用机制研究

猪凝血酶C末端富含正电荷和疏水性氨基酸残基,通过结构参数分析获得截短肽RD27,测定相应指标。探讨猪凝血酶C末端肽段抑菌活性及作用机制。结果表明,RD27对革兰氏阴性和阳性菌最小抑菌浓度为4~8μmol·L~(-1),对血细胞最小溶血浓度为45.9μmol·L~(-1),显示较强的抑菌活性和较低的溶血活性,治疗指数为10,大于蜂毒素。RD27在模拟膜环境中呈现α-螺旋结构,优先与模拟细菌脂质体作用,使E.coli UB1005膜产生去极化作用,并存在时间和剂量依赖效应。揭示其膜作用机制,拓宽抗菌肽设计方法,探究凝血与免疫系统联系。     

邻苯二甲酸二甲酯对荧光假单胞菌的损伤研究

为探究邻苯二甲酸二甲酯(Dimethyl phthalate,DMP)对细菌的毒理作用,选择荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)为受试菌株,采用平板计数试验、对数生长数学模型、细菌表面Zeta电位、荧光偏振法、透射电镜和超高效液相色谱法,测定了P.fluorescens的比生长速率、代时、细胞表面电势、细胞膜流动性、细胞损伤程度和DMP在细胞内外分布,研究DMP对P.fluorescens的细胞毒性。结果表明:经0、10、20、40 mg·L~(-1)的DMP暴露后,细菌比生长速率减小,而代时增加;细菌表面Zeta电位从-12.21±0.56mV逐渐降低为-18.13±0.67 mV,同时DMP增加了细菌细胞膜的流动性,导致细胞明显变形、质壁分离严重并伴有内容物的泄露;在细胞内,DMP累积浓度从0.11±0.10 mg·L~(-1)增加到6.78±0.25 mg·L~(-1);在细胞外,DMP累积浓度从8.44±0.37 mg·L~(-1)增加到30.52±0.88 mg·L~(-1)。研究表明,DMP破坏了P.fluorescens的细胞壁和细胞膜,影响了细菌正常生长。     

茶叶抗菌肽粗提物的抑菌活性及其对冷却肉保鲜的影响

为了制备茶叶抗菌肽粗提物并将其应用在冷却肉保鲜上,以龙井茶叶为材料提取茶叶抗菌肽粗提物,采用平板抑菌法检测茶叶抗菌肽粗提物的抑菌活性,通过细胞膜渗透率、磷离子泄漏、DNA结合和透射电子显微镜等指标分析茶叶抗菌肽粗提物对细菌的作用机制,通过微生物菌落数量和pH值两个指标评价茶叶抗菌肽粗提物对冷却肉的防腐保鲜效果。结果表明:提取的茶叶抗菌肽粗提物主要包括分子量小于18.4 ku的多肽,其对金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌均具有抑菌活性,可造成细菌细胞膜渗透率增强,引起细菌细胞外磷离子浓度增加,造成细菌细胞膜不完整、出现破损,但不与细菌基因组DNA结合。茶叶抗菌肽粗提物可以显著抑制冷却肉中微生物的生长,延缓pH值上升,延长保鲜时间,对冷却肉具有防腐保鲜作用,具有较高的开发利用价值。     

MSL抗菌肽对绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌细胞膜的损伤作用研究

通过MSL抗菌肽(MSL)对细菌细胞膜的损伤作用研究,确定该抗菌肽的作用靶点。在1×108个/m L的绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌悬液中,分别加入MSL至终浓度为1×MIC,37℃保温孵育,分别于0min、10min、20min、30min、40min、50min、60min、120min、180min、240min离心收集上清液,检测各时间点蛋白浓度,分析蛋白浓度变化规律;分别在对数生长期的金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌悬液中加入MSL至终浓度为1×MIC,37℃保温孵育60min后,利用透射电镜观察分析细菌结构的变化。结果,MSL与2种细菌接触后均可引发胞液外流;透射电镜观察发现,MSL可造成绿脓杆菌和金黄色葡萄球菌细胞膜破损,胞浆内电子密度降低,染色质聚集,严重者细胞崩解结构不清,说明MSL对G+和G-细菌细胞膜均可造成损伤,证明细菌细胞膜是MSL作用的靶点之一。     

乳酸链球菌抗菌肽的分离纯化及生物活性检测

通过凝胶过滤层析及制备型高效液相色谱法,从乳酸链球菌发酵液中筛选分离出了具有广谱抗菌活性的物质,利用金黄色葡萄球菌(ATCC25923)、大肠杆菌(ATCC25922)、绿脓杆菌、枯草芽孢杆菌、耶尔森菌、粪肠球菌对该活性物质的抗菌谱及杀菌机理进行了研究。结果表明:经过分离纯化,得到的较纯的活性物质为乳酸链球抗菌肽,该物质除了对绿脓杆菌没有杀伤作用,对其他5种细菌均具有杀伤作用。透射电镜观察结果显示,金黄色葡萄球菌(ATCC25923)经抗菌肽处理后,细胞出现破损或肿胀,有部分细胞内容物外泄,并伴有细胞质稀释的现象,细胞膜界限模糊不清,细胞膜甚至完全溶解。由于细胞内容物外渗,最终导致菌体死亡。     

抗菌肽抗细菌机理研究进展

抗菌肽是一类有望解决全球范围内抗生素耐药性问题的新型抑菌多肽。抗菌肽主要有3种抑菌机制:其一是针对细菌细胞膜作用,膜作用主要针对两种不同菌膜结构特性的细菌,革兰氏阴性菌外膜富含脂多糖,革兰氏阳性菌细胞壁富含磷壁酸,抗菌肽可靶向作用于此类细菌菌膜结构特定组分。此外,抗菌肽可抑制细菌生物被膜形成,分解已形成细菌生物被膜。抗菌肽作用于特异性酶或靶向作用于DNA产生抑菌效果,其抑制作用可抵抗细菌耐药性产生。基于抗菌肽改变菌膜结构并抑制细菌外膜及酶合成的特性,此杀菌策略已应用于抗菌药物设计。     

抗菌肽CC34的氨基酸从头替换设计及优化肽的生物活性检测

以抗菌肽CC34的氨基酸序列为模板,采用氨基酸从头替换的方式对序列进行设计,借助生物信息学方法对预测不同序列的抗菌肽生物学参数,选取优化肽CC34PA、CC34PL、CC34K11、CC34P11进行化学合成,鉴定抗菌肽的抑菌活性、检测最小抑菌浓度、杀菌浓度和溶血率。结果表明,四种肽均属于α螺旋型抗菌肽,具有比CC34更好的非完美两亲性,对革兰氏阳性菌和阴性菌有抑制作用,除对产气肠杆菌的作用效果不及CC34之外,优化肽对不同的试验菌种的抑菌作用均有有不同程度的提高。优化肽相比于原肽对绵羊红细胞的溶血率降低,溶血率最低的是CC34K11;对鸡红细胞溶血率降低,溶血率最低的是CC34PA;对人红细胞溶血率没有降低作用。     

柞蚕抗菌肽对水稻白叶枯病菌的抑制作用

柞蚕蛹诱导含抗菌肽的免疫血淋巴,对水稻白叶枯病病原细菌(X(?)(?)pv (?))有明显的抑菌作用,对中国白叶枯病菌Ⅳ群强致病力菌株(RX77)的抑菌圈直径达12mm。电镜观察抗菌肽作用于白叶枯病菌能使其细胞膜破坏,内容物渗出而致死亡。处理10～30min即有效果。将抗菌肽与白叶枯病菌按不同比例混合后接种于水稻秧苗及孕穗期的叶子上,20天后调查病斑平均长度,经方差分析认为抗菌肽对病菌致病力有显著的减弱作用。     

SO_2衍生物对油菜毒性的研究

通过考察SO2衍生物—亚硫酸钠和亚硫酸氢钠(二者分子比为3比1)作用前后油菜叶片叶绿素含量,细胞膜脂质过氧化水平和细胞膜透性,以及SOD、POD酶活性的变化,研究了SO2衍生物对油菜的毒性。试验结果表明,SO2衍生物会造成油菜叶片叶绿素含量的下降,但不影响叶绿素a/b的比值;另外,SO2衍生物可增加油菜叶片细胞膜脂质过氧化产物丙二醛(MDA)的含量,造成细胞膜透性增大;结果还表明,低浓度SO2衍生物(0.5和1mmol·L-1)对油菜叶片适应逆境胁迫的重要保护酶SOD和POD活性均没有显著影响,随着浓度的增加(5、10、20、50和100mmol·L-1),叶片SOD酶的活性不可逆地下降,表明其丧失了抗氧化损伤的能力;但高浓度SO2衍生物对POD活性的影响却不相同:当SO2衍生物的浓度在一定范围内(5、10和20mmol·L-1)时,叶片的POD活性升高,油菜自身表现出积极的保护作用,浓度再增加(50和100mmol·L-1)则会使叶片的POD活性下降,说明此时细胞的保护机制已不能发挥作用。     

鸭β-防御素2基因的克隆、表达和表达产物的生物学特性分析

 【目的】从鸭组织中克隆鸭β-防御素（AvBD）2基因,在大肠杆菌中高效表达,检测重组鸭AvBD2蛋白的生物学特性。【方法】应用RT-PCR技术从鸭胰腺组织中扩增鸭AvBD2基因,根据已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素-2的氨基酸序列构建系统进化树,将该基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上进行原核表达,对该重组蛋白进行纯化,测定体外抗菌活性与理化特性。【结果】鸭胰腺组织中克隆出鸭AvBD2基因的cDNA大小为195 bp,编码64个氨基酸。同源性分析表明,鸭AvBD2与其它物种AvBD2同源性较高。凝胶电泳结果显示重组鸭AvBD2蛋白在原核高效表达（分子量约为32 kD）,对多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌有较高抗菌活性,对大肠杆菌与猪霍乱沙门氏菌的抗菌活性较弱。重组鸭AvBD2蛋白对上述细菌的最小抑菌浓度为15.25～125 μg?ml-1,对猪霍乱沙门氏菌最小抑菌浓度大于400 μg?ml-1。重组鸭AvBD2蛋白在-20～100℃或pH 3～12条件下处理30 min后仍有抗金黄色葡萄球菌作用。【结论】克隆并表达了鸭AvBD2基因,表达产物具有抗菌活性,对温度和酸碱度有较高的稳定性。     

鸭β-防御素16的分离、鉴定及其抗病毒机制

【研究目的】旨在克隆与表达鸭β-防御素16（AvBD16）基因及测定其生物学特性,监测了鸭肝炎病毒感染后麻鸭不同组织AvBD16与TLR-7的动态变化。【方法】采用RT-PCR方法,从鸭骨髓组织中扩增到鸭AvBD16,并将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1 上进行原核表达,对其重组和合成蛋白进行生物学活性测定。采用荧光定量PCR方法,分别检测了鸭肝炎病毒对鸭AvBD16和TLR-7在不同组织中表达量的影响。【结果】鸭AvBD16 cDNA 大小为155bp,编码50个氨基酸残基,与鸡AvBD3氨基酸同源性最高,为62%。重组和合成鸭AvBD16蛋白对12种细菌均有不同程度的抑制作用,高盐浓度对其抗菌活性有一定影响,且溶血活性极低。重组AvBD16蛋白具有体外抗病毒活性。经鸭肝炎病毒诱导后,鸭AvBD16在肝脏及其他组织中被诱导表达或表达量显著上调,且与TLR7的表达量呈正相关。【结论】成功克隆并表达了鸭AvBD16基因,重组和合成AvBD16蛋白具有广谱的抗菌活性且不具有溶血特性。重组AvBD16蛋白具有抗鸭肝炎病毒的活性,体内抗病毒作用可能受TLR-7通路调节。     

尼罗罗非鱼Hepcidin抗菌肽在大肠杆菌中的融合表达及其抗菌活性

Hepcidin是一类分子量较小、富含半胱氨酸的阳离子抗菌肽,TH1-5则是从莫桑比克罗非鱼(Oreochromis mossambicus)中分离到的3种hepcidin cDNA序列中的1种;虽然化学合成的TH1-5的成熟肽显示了对若干细菌的抑菌活性,但通过重组DNA表达的此肽是否也具生物学活性则是未知的。本文参考莫桑比克罗非鱼hepcidin TH1-5的核苷酸序列,以尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)的肝脏为基因克隆的材料,对其类似于hepcidin TH1-5的成熟肽(mTH)进行了重组DNA表达。在构建的重组表达质粒"pET-32a-mTH"中,mTH基因与携带有6×His-tag标签和肠激酶识别位点的trxA基因融合,25℃下,经1mmol/L IPTG诱导培养8h后,在E.coli BL21(DE3)中成功表达了"trxA-mTH"融合蛋白。经固化金属离子亲和层析(IMAC)纯化后的融合蛋白并不显示抑菌活性,但经肠激酶消化处理后,释放出的重组mTH显示了对革兰氏阳性的单增李斯特菌和金黄色葡萄球菌以及革兰氏阴性的大肠杆菌和铜绿假单胞菌的抑菌活性。     

鸭β-防御素9基因的克隆、组织分布及其原核表达

 【目的】从鸭组织中克隆鸭β-防御素9（AvBD9）基因,在原核表达重组鸭AvBD9蛋白;研究重组鸭AvBD9蛋白的体外抗菌活性与理化特性。【方法】采用RT-PCR法,从鸭肝脏组织中扩增鸭AvBD9基因,测定该基因在鸭各组织器官中的分布;将鸭AvBD9基因克隆到大肠杆菌原核表达载体pGEX-6p-1上,构建重组表达质粒pGEX-duck AvBD9,将重组质粒转化大肠杆菌BL21,用IPTG诱导表达;亲和层析纯化蛋白,利用薄层平皿琼脂糖孔穴扩散法测定重组鸭AvBD9蛋白的体外抗菌活性与理化特性。【结果】从鸭肝脏组织中克隆得到鸭AvBD9基因,序列分析表明该基因大小为204 bp,前体肽包括67个氨基酸残基。AvBD9基因在鸭体内广泛分布。SDS-PAGE电泳表明鸭AvBD9基因在大肠杆菌中高效表达,表达的重组鸭AvBD9融合蛋白以包涵体的形式存在,分子量约31 kD。重组鸭AvBD9蛋白对大肠杆菌、多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、嗜酸乳杆菌、枯草芽胞杆菌有抗菌活性,在-70～100℃或pH 3～10处理30 min后仍有抗多杀性巴氏杆菌作用。【结论】鸭AvBD9基因为204 bp,编码67个氨基酸残基,在鸭组织中广泛分布。重组鸭AvBD9蛋白基因在大肠杆菌中高效表达,该重组蛋白具有广谱的抗菌活性,对温度和酸碱性有较高的稳定性。     

鹅β-防御素10基因的分离、鉴定与表达

【目的】从鹅的组织中克隆鹅β-防御素10（avian β-defensin 10,AvBD10）基因,通过大肠杆菌进行原核表达,检测重组鹅AvBD10蛋白的生物学特性。【方法】采用RT-PCR方法,从鹅的肾脏组织中扩增鹅AvBD10基因。根据已发现的禽β-防御素和部分哺乳类动物β-防御素的氨基酸序列构建系统进化树,进行遗传进化分析;并应用荧光定量的方法对该基因的组织表达水平进行鉴定。将该基因克隆到原核表达载体pGEX-6p-1 上进行原核表达,并对该重组蛋白进行纯化,测定体外生物学活性。【结果】从鹅肾脏组织中克隆出了鹅AvBD10基因,该基因的cDNA大小为207 bp,编码68个氨基酸。经遗传进化分析表明,该基因推导的氨基酸序列与鸭AvBD10的同源性最高,达92.7%。通过对重组蛋白抗菌活性的检测发现,该蛋白对12种致病性细菌均具有较强抑菌作用,但在高盐离子浓度下活性减弱。并且重组蛋白不具有溶血的特性。【结论】成功克隆并表达了鹅AvBD10基因,原核表达产物具有广谱的抗菌活性且不具有溶血特性。     

中华蜜蜂Apidaecin的重组表达及其抗菌活性

【目的】研究中华蜜蜂（Apis cerana cerana）抗菌肽Apidaecin在枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）中的重组表达,并验证纯化后的重组抗菌肽Apidaecin在体内和体外是否具有抗菌活性,为开发新型、安全具有抗菌和免疫调节功能的抗菌肽制剂提供理论依据。【方法】以意大利蜜蜂（Apis mellifera ligustica）Apidaecin为模板,克隆出中华蜜蜂抗菌肽Apidaecin,成功构建his-pHT43/Apidaecin表达载体,并参照MoBiTec所提供的制备方法成功制得枯草芽孢杆菌感受态细胞,现配现用,以保证其活性并得以在枯草芽孢杆菌表达系统中重组表达。使用His标签蛋白纯化试剂盒（可溶性蛋白）进行表达蛋白的分离纯化,使用Easy II Protein Quantitative Kit（BCA）试剂盒测定浓度。纯化得到的重组抗菌肽Apidaecin作用于大肠杆菌K88,在体外进行抑菌圈试验和最小浓度抑菌法测定;在体内,以小鼠为试验动物模型,试验组小鼠腹腔注射重组抗菌肽Apidaecin,阴性对照组注射相同体积的生理盐水,阳性对照组注射相同体积的头孢霉素,然后人为感染大肠杆菌K88,感染24 h后对小鼠进行解剖,取得肠道样品和血液样品,并从肠道屏障和免疫功能两个方面探讨重组抗菌肽Apidaecin对感染大肠杆菌K88小鼠的保护作用。使用ELISA试剂盒对染菌小鼠血清免疫球蛋白（IgA、IgG、IgM）与肠道sIgA水平进行测定,采用qRT-PCR法对小鼠肠道紧密连接蛋白基因（claudin-1、ZO-2）以及小鼠肠道细胞因子（促炎因子TNF-α、IFN-γ、IL6和抑炎因子IL10）的转录水平进行测定。【结果】克隆得到的中华蜜蜂Apidaecin含有183 bp的碱基,编码60个氨基酸,包含Apidaecin的信号肽序列、一个基础的RR二肽以及抗菌肽Apidaecin的氨基酸序列（内含高度保守的8个氨基酸序列）,编码的蛋白质命名为AccApidaecin,其分子量为15.6 kD,等电点为5.33。在IPTG终浓度为3 mmol·L ^-1,诱导温度为30℃,诱导表达12 h后,可从1 L表达上清中纯化得到约20 mg抗菌肽。药敏试验显示,重组抗菌肽Apidaecin在体外与阴性对照相比有明显抑菌圈出现,且测得的最小抑菌浓度为10 mg·L ^-1;在小鼠体内,腹腔注射重组抗菌肽Apidaecin的染菌试验组与注射生理盐水的染菌试验组相比免疫球蛋白含量差异显著(P<0.05),说明腹腔注射重组抗菌肽Apidaecin能够有效缓解由大肠杆菌K88引起的小鼠免疫球蛋白含量的增加;同时,小鼠肠道相关蛋白的基因表达量也差异显著(P<0.05),说明重组抗菌肽Apidaecin能够有效保护被大肠杆菌K88侵染的小鼠肠道。【结论】在枯草芽孢杆菌中能够成功重组表达中华蜜蜂抗菌肽Apidaecin,并且纯化后的中华蜜蜂抗菌肽Apidaecin在体外对大肠杆菌K88有良好的抗菌效果;经腹腔注射进入小鼠体内,能够提高小鼠的免疫机能,有效抵抗大肠杆菌K88对小鼠的侵染。     

鸭TTR基因cDNA克隆和表达研究

为研究转甲状腺素蛋白(transthyretin,TTR)与肉鸭脂肪代谢的相关性,通过快速扩增cDNA末端技术(RACE)获得北京鸭TTR基因全长cDNA序列,并采用实时荧光定量PCR法对鸭TTR基因表达谱进行研究。结果显示:鸭全长TTRmRNA编码150个氨基酸的前体肽,该肽含20个氨基酸的信号肽和130个氨基酸的成熟肽;与哺乳动物相比,鸭TTR亚基N-末端序列多出的3个氨基酸Val-Ser-His,可能使鸭TTR结合甲状腺素T3的亲合力增加。定量检测结果表明,鸭TTRmRNA在脉络丛中的表达量最高,与鸡、爬行类和哺乳动物类似。本实验证实鸭TTR基因在脉络丛中的表达量比鸡更高,并首次发现TTRmRNA在鸭皮下脂肪组织中表达。     

Red cell membrane glycophorin labeling from within the lipid bilayer

Human red blood cell membranes were labeled from within the lipid bilayer by the apolar photosensitive reagent, 5-[125I]iodonaphthyl-1-azide. Glycophorin, the major sialoglycoprotein of the red cell membrane, was purified by two different methods; it contained approximately half of the total label incorporated into membrane proteins. The label was confined to the trypsin-insoluble peptide of glycophorin that includes a sequence of 20, mainly apolar, amino acids. These findings provide direct evidence that the labeled segment resides within the membrane in direct contact with the lipid bilayer, and support the suggestion that glycophorin spans the bilayer through its hydrophobic domain.