猪圆环病毒2型多抗原表位串联在大肠杆菌中表达与反应原性分析

为将猪圆环病毒2型(PCV2)的多个抗原表位串联,并在大肠杆菌中表达,本研究人工合成PCV2多抗原表位串联的编码序列并与pET32a(+)载体连接构建重组表达质粒。将其转化到BL21感受态细胞,经IPTG诱导表达。检测结果显示,多抗原表位串联基因在大肠杆菌中获得表达并以包涵体形式存在;表达的融合蛋白分子量约为27 ku。将包涵体溶解并经Ni-His柱纯化得到纯化的目的蛋白,western blot和ELISA结果显示,该表达产物具有较好的反应原性。     

猪圆环病毒2型衣壳蛋白优势B细胞表位重组蛋白免疫原性研究

猪圆环病毒2型(PCV-2)衣壳蛋白(Cap)是研制基因工程疫苗和血清抗体检测方法的主要候选抗原。为筛选免疫原性强的Cap抗原表位,将定位在Cap上的6个B细胞线性表位的编码基因序列重新组合,命名为R1234、R1235、R1236、R2345、R2346和R3456,然后克隆至pET32a原核表达载体,转化到大肠埃希菌中进行诱导表达。通过对表达和纯化条件的优化,最终获得6个多抗原表位串联体的重组蛋白。Western blot和间接ELISA结果显示,6组重组表位蛋白均能被PCV-2阳性血清特异性识别,具有良好的反应原性。将其与完整Cap分别免疫Balb/c小鼠,检测免疫后血清中特异性抗体和细胞因子水平以及脾脏淋巴细胞中CD4^+和CD8^+T淋巴细胞的比例。结果表明,R2346组合刺激机体产生的特异性抗体和细胞因子IFN-γ、IL-4的水平明显高于其他组,脾脏淋巴细胞中CD4^+和CD8^+T淋巴细胞含量与对照组相比显著增加(P<0.05),说明该重组蛋白能够刺激体液免疫和细胞免疫反应。因此,筛选获得的R2346重组表位蛋白可以作为研制PCV-2多表位基因工程疫苗和血清抗体诊断方法的候选抗原,用于PCV-2的预防和控制工作中。     

猪圆环病毒2型CAP蛋白B细胞表位预测与分析

基于PCV2 CAP蛋白的氨基酸序列,采用Kyte-Doolittle的亲水性方案、Emini方案、Karplus方案Jameson-wolf抗原指数方案,辅以对PCV2 CAP蛋白的二级结构柔性区域分析,并结合吴玉章氨基酸抗原指数计算方法预测CAP蛋白的B细胞表位。结果表明,最有可能的B细胞优势表位位于CAP蛋白N端第4~18,23~28,32~41,57~64,96~103,175~182区段和第224~233区段。本研究用多参数预测PCV2 CAP蛋白的B细胞表位,为多肽疫苗的设计提供理论依据。     

猪圆环病毒2型ORF2基因的原核表达及其免疫原性检测

以病猪脾脏组织为材料,提取总RNA,通过RT-PCR得到579 bp的猪圆环病毒2型(PCV-2)/ORF2片段,与原核表达载体pET32a重组,通过菌落PCR鉴定、双酶切鉴定及测序鉴定后,证实重组质粒pET32a/ORF2构建成功,将其转化入表达菌Balgold,通过IPTG诱导表达,利用Ni-NTA亲和层析纯化目的产物,Western blot验证其免疫原性,重组蛋白免疫Balb/c小鼠,检测小鼠体内中和抗体滴度。获得的重组蛋白包涵体的形式出现,表达量占菌体总蛋白的30%,变性纯化后纯度达90%以上,Western blot证实重组蛋白能与PCV-2阳性血清发生反应,免疫Balb/c小鼠45 d后中和抗体滴度达到1∶22。     

猪圆环病毒2型全基因组序列分析及Cap蛋白CTL表位预测

【目的】监测当前湖南省猪圆环病毒2型(Porcine circovirus type 2,PCV2)流行毒株及其衣壳蛋白(capsid protein, Cap)变异情况,并预测Cap蛋白细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxic T lymphocyte, CTL)表位,为新型PCV2疫苗研制和病毒净化提供参考依据。【方法】本研究对2019-2021年于湖南省6个地区收集的17份PCV2阳性组织样品进行PCV2全基因组序列扩增及测序分析,绘制系统进化树,利用生物信息学方法分析Cap蛋白氨基酸变异情况,并预测CTL表位。【结果】系统进化树显示,获得的17株PCV2全基因组序列中,1株PCV2a、7株PCV2b和9株PCV2d。Cap蛋白氨基酸序列比对分析发现,共有16个氨基酸残基突变位点位于病毒Cap蛋白表面,且有11个突变位点参与构象型表位的形成。此外,共预测出9个PCV2 Cap蛋白潜在的CTL表位,其中4个表位(16-24、28-36、136-144和179-187位氨基酸)在GenBank的1 610株PCV2不同基因型毒株中高度保守。通过TCR-pMHC复合物3D结构对4个保守性...     

猪圆环病毒2型SH毒株免疫原性

用D-氨基葡萄糖处理PK-15细胞,将PCV2-SH分离株增殖传代至第50代,测定病毒滴度TCID50均为10-6.25/mL.将第20代和第50代病毒液分别灭活乳化制成灭活疫苗,进行猪体免疫保护试验.结果显示,这2个不同代次的病毒制成的疫苗都能刺激机体产生较高水平的ELISA抗体,攻毒后2个免疫组的猪均没有明显的临床症状,相对日增重相似,同时病理变化和病毒血症程度明显减轻.结果表明,PCV2-SH株具有稳定的免疫原性,并可以提供有效的免疫保护作用.     

猪圆环病毒2型Cap蛋白杆状病毒载体表达及免疫保护性分析

为了获得低成本高产量的抗原表达,开发新型、有效防控猪圆环病毒的亚单位疫苗,根据猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白序列,通过软件设计优化了密码子并合成cap基因,利用多角体病毒作为载体,构建了表达PCV2 Cap蛋白的重组病毒,命名为flashBAC-PCV2-ORF2株.经过鉴定,证明该病毒株表达Cap蛋白的抗原量在...     

猪圆环病毒Cap蛋白的分泌表达及其免疫原性研究

探索利用杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac expression system)分泌表达猪圆环病毒2型(PCV2)Cap蛋白及将其作为亚单位疫苗的应用价值。将PCV2 Cap基因克隆到已插入蜂毒信号肽(Melittin)的转移载体pFastBacⅠ中,将鉴定正确的重组质粒(pFastBAC-Cap)转化至DH10Bac大肠杆菌感受态细胞,经抗性及蓝白斑筛选得到含Cap基因的重组杆状病毒DNA(Bacmid-Cap),转染提取的Bacmid-Cap DNA转染至sf9昆虫细胞,获得重组杆状病毒(rBac-Cap),应用无血清培养的High Five细胞进行重组蛋白的表达及条件优化。重组蛋白通过聚丙烯酰胺凝胶电泳分析(SDS-PAGE)证明:在重组杆状病毒感染的High Five昆虫细胞中获得分泌表达,并可产生较高浓度的重组蛋白;Western blotting结果显示:重组蛋白可被猪PCV2的特异性抗体所识别,表明重组蛋白具有反应原性;应用重组蛋白免疫BALB/C小鼠试验结果显示:该蛋白可刺激小鼠产生较高水平的特异性抗体。该研究成功分泌表达了PCV2 Cap蛋白,该蛋白能够刺激机体产生免疫应答,为PCV2亚单位疫苗的研制打下基础。     

猪圆环病毒2型研究进展

猪圆环病毒2型（PCV2）已成为家猪和野猪常见的一种病毒病,由其引起的疾病称为猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）,自猪圆环病毒相关疾病（PCVAD）暴发以来,已成为近年来阻碍养猪业发展的重要传染病。为了进一步了解该病,以便更好地预防和控制该病,本文从病原学、流行病学、致病机理、临床症状、防控措施等方面进行了综述。     

猪圆环病毒2型Cap蛋白表达及免疫原性鉴定

以猪圆环病毒2型（Porcine circovirus type 2,PCV2）WH株基因组DNA为模板,扩增ORF2截短基因,经BamH I/NotI双酶切处理后与经相同酶切处理的pET32a（＋）原核表达载体连接,获得重组质粒pET32a-Cap2。将重组质粒转化至BL21（DE3）,经IPTG诱导,对表达产物进行SDS-PAGE和Western blot分析。纯化的重组蛋白免疫小鼠,并对获得的血清进行间接ELISA检测和中和活性测定。SDS-PAGE分析表明,ORF2截短基因在大肠杆菌中得到表达,蛋白分子质量大小为40 kDa,重组PCV2 Cap蛋白主要以上清的形式存在。Western blot证实重组蛋白能够识别抗PCV2阳性血清。经间接ELISA检测,鼠抗PCV2 Cap血清抗体效价能达到1：25 600,间接免疫荧光检测分析表明,鼠抗PCV2 Cap血清能特异性识别PCV2感染细胞中的Cap蛋白。病毒血清中和实验证实,抗PCV2 Cap血清抗体具有中和病毒的活性,中和效价为1：36。猪圆环病毒2型Cap蛋白的表达,为进一步研究该蛋白的功能及Cap蛋白亚单位疫苗和检测试剂盒的制备奠定了基础。     

猪圆环病毒2型ORF3编码蛋白的体外表达

设计特异引物,以猪圆环病毒2型(PCV-2)杭州株HZ0201的基因组DNA为模板,PCR扩增出ORF3基因,构建了pGEX-4T-1-ORF3原核表达载体和pEGFP-C2-ORF3真核表达载体。ORF3基因全长315 bp,编码105个氨基酸。SDS-PAGE、Western blot分析及真核PK15细胞转染结果显示:ORF3蛋白在大肠杆菌中以包涵体形式存在,分子量大小约为37.7 ku;ORF3重组蛋白在真核PK15细胞的细胞核和细胞浆都有表达,尤其在细胞核中表达量较高,且对细胞有一定的毒性。     

猪圆环病毒2型的分离与鉴定

利用PCR方法,从疑似断奶猪多系统衰竭综合征(PMWS)的自然病例的淋巴结和脾脏中扩增出了预期长度的猪圆环病毒2型(Porcine Circovirus type 2,PCV2)的DNA片段,并用限制性内切酶对PCR产物进行了酶切鉴定。将经PCR扩增和酶切鉴定为PCV2阳性的组织样品匀浆液接种到无PCV污染的PK15细胞中传代,经间接免疫荧光检查,在接毒细胞内观察到了特异性免疫荧光;用接毒细胞制备超薄切片,在电镜下观察到了直径大约为17nm的圆形病毒样粒子和大量不同形态的胞浆内包涵体。由此表明分离出的病毒为猪圆环病毒2型。     

猪圆环病毒2型诊断技术研究进展

猪圆环病毒2型(PCV2)是新发现的迄今为止最小的动物病毒,是猪断奶后多系统衰竭综合征(PMWS)的病原.PMWS给世界养猪业造成了巨大的经济损失.本文综述了猪圆环病毒2型的诊断技术,包括抗原和抗体的检测技术.     

猪圆环病毒2型重组Cap蛋白在昆虫杆状病毒中的表达

猪圆环病毒2型(PCV2)基因组包含2个开放阅读框架(ORFs),其中ORF1编码病毒复制相关蛋白(Rep),ORF2编码病毒衣壳蛋白(Cap).为了在昆虫细胞表达Cap蛋白,本研究采用PCR扩增PCV2-ORF2编码基因,将PCR产物插入到昆虫杆状病毒转移载体上,经酶切反应及DNA序列分析得到验证.重组质粒与昆虫杆状病毒线性基因组混合,转染到昆虫细胞(Sf-21)进行基因重组,经3次病毒蚀斑克隆,获得高效表达Cap蛋白的重组杆状病毒,毒价可达1.28×108pfu/mL.采用SDS-PAGE凝胶电泳分析表明,重组Cap融合蛋白分子量为32.8 ku,占总蛋白含量的17.2%.免疫印迹试验分析表明,重组Cap蛋白与PCV2阳性血清产生特异性反应,证明该重组蛋白具有良好的免疫活性反应.本研究为进一步进行该病毒分子诊断、亚单位疫苗以及分子生物学等研究奠定了基础.     

Time course differential gene expression in response to porcine circovirus type 2 subclinical infection

This study was aimed at characterizing the potential differences in gene expression in piglets inoculated with Porcine circovirus type 2 (PCV2), the essential causative agent of postweaning multisystemic wasting syndrome. Seven-day-old caesarean-derived, colostrum-deprived piglets were distributed into two groups: control (n = 8) and pigs inoculated with 10^5.2 TCID₅₀ of the Burgos PCV2 isolate (n = 16). One control and three inoculated pigs were necropsied on days 1, 2, 5, and 8 post-infection (p.i.). The remaining pigs (four of each group) were sequentially bled on days 0, 7, 14, 21, and 29 p.i. (necropsy). Total RNA from the mediastinal lymph node (MLN) and lysed whole blood (LWB) samples were hybridized to Affymetrix Porcine GeneChip^®. Forty-three probes were differentially expressed (DE) in MLN samples (FDR < 0.1, fold change > 2) and were distributed into three clusters: globally down-regulated genes, and up-regulated genes at early (first week p.i.) and late (day 29 p.i.) stages of infection. In LWB samples, maximal differences were observed at day 7 p.i., with 54 probes DE between control and inoculated pigs. Main Gene Ontology biological processes assigned to up-regulated genes were related to the immune response. Six common genes were found in both types of samples, all of which belonged to the interferon signaling antiviral effector pathway. Down-regulated genes were mainly related to cell adhesion and migration in MLN, and cellular organization and biogenesis in LWB. Microarray results were validated by quantitative real-time PCR. This study provides, for the first time, the characterization of the early and late molecular events taking place in response to a subclinical PCV2 infection.     

猪GM-CSF基因对猪圆环病毒2型DNA疫苗诱导仔猪免疫反应的调节作用

粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）能够诱导树突状细胞的成熟和存活，并提高其抗原递呈功能，是非常有潜力的分子佐剂之一。为了探讨猪GM-CSF对猪圆环病毒2型（PCV2）DNA疫苗诱导免疫反应的调节作用，本研究将表达猪GM-CSF和PCV2衣壳蛋白的重组质粒混合物（pcDNA3．1-gm-csf和pcDNA3．1-orf2）及在同一载体上表达PCV2衣壳蛋白与猪GM-CSF的双表达重组质粒（pIRES-orf2／gm-csf），分别接种于7日龄健康仔猪，共肌肉注射3次，每次间隔2周。结果表明猪GM-CSF基因能够明显增强PCV2DNA疫苗诱导的特异性体液免疫反应，提高外周血淋巴细胞（PBLC）对ConA刺激的增殖活性，增强NK细胞的杀伤功能，影响细胞因子IL-12、IFN-γ、IL-4和IL-10的表达水平。但GM-CSF基因单独表达和与PCV2衣壳蛋白基因在同一载体上表达，对上述4个细胞因子表达的影响有一定差异。     

广西猪圆环病毒2型感染的流行病学调查

结合流行病学、临床症状、病理变化，采用PCR技术，对2004年1月至2005年5月采自广西14个市97个疑似猪圆环病毒2型（PCV2）感染发病猪场的197份组织病料（脾、肺、淋巴结）进行了PCV2检测；同时，对鉴定为PCV2阳性的组织病料和猪场进行了猪生殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）、猪瘟病毒（CSFV）、猪流感病毒（SIV）和猪伪狂犬病病毒（PRV）的检测，另外，对6个地（市）11个生猪屠宰场采集的外观健康屠宰猪的295份组织样品（脾、肺、淋巴结）进行了PCV2检测。结果显示，在197份组织样品中检出PCV2阳性病料108份，平均阳性率为54．82％（108／197），阳性猪场62个，平均阳性率为63．92％（62／97）。PCV2与PRRSV、CSFV、SIV、PRV混合感染的组织病料总阳性率为42．13％（83／197），混合感染的猪场总阳性率为57．73%（56／97）。从21头外观健康屠宰猪的组织样品中检测到PCV2，阳性率为7．10％。由此可见，PCV2感染在广西猪群中已普遍存在，混合感染和健康带毒现象使病情更加复杂。     

猪圆环病毒2型灭活疫苗免疫佐剂的比较试验

以猪圆环病毒2型(PCV2)遗传标记毒株为毒种,经细胞培养传代,优化了病毒增殖条件,获得较高滴度的病毒培养物用于PCV2灭活疫苗的研制。为了比较不同免疫佐剂的效果,本试验对国产矿物质白油和铝胶两种佐剂以及赛比克公司提供的MONTANIDETMISA206、ISA15VG、IMS1315VG3种佐剂配制的灭活疫苗进行了猪体免疫试验。通过临床观察、血清抗体效价测定,确认ISA15VG佐剂配制的疫苗在增强免疫效果方面优于其它佐剂。按5种佐剂免疫效果排序为ISA15VG、IMS1315VG、铝胶、ISA206、国产白油。ISA15VG佐剂属于水包油剂型,可刺激接种动物产生快速免疫应答反应,抗体产生效价高、持续时间长,有可能成为新型PCV2灭活疫苗佐剂的候选。