鼠伤寒沙门菌LH430株asd基因缺失株平衡致死系统的构建及生物学特性分析

本研究旨在构建基于减毒鼠伤寒沙门菌的平衡致死系统。将打靶基因片段Cat基因重组入鼠伤寒沙门菌LH430株asd基因位置,之后将温敏型质粒pCP20转入菌体中用以消除Cat基因片段,通过PCR技术两步法筛选出缺失株Δasd LH430;将asd⁺的原核表达质粒pYA3493转入Δasd LH430,经PCR及测序鉴定表明鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430（pYA3493）构建成功。对构建的基因缺失株研究表明,该缺失株失去了在二氨基庚二酸（DAP）阴性环境中生存的能力;糖发酵试验表明,缺失菌株在利用碳源的能力方面与亲本菌株保持一致;9种生化试验结果显示,缺失菌株遗传了亲本菌株的生化特性;遗传稳定性试验表明,缺失菌株能够稳定遗传缺失的423 bp的基因片段;将绿色荧光基因转入所构建的平衡致死系统,成功构建携带绿色荧光基因的重组菌Δasd LH430（pYA-gfp）,对其研究表明该重组菌能够有效表达绿色荧光蛋白。本研究成功构建了鼠伤寒沙门菌平衡致死系统Δasd LH430（pYA3493）,能够有效表达所携带的基因,该系统可作为疫苗活载体来携带外源基因。     

鼠伤寒沙门菌SL1344株AcrpAasd缺失株的构建及生物学特性初步研究

构建鼠伤寒沙门菌SL1344△cr户△nsd双基因缺失突变株,并对其生物学特性进行初步研究。首先以Y7213（pREAasd）为供体菌,SL1344Acrp为受体菌进行结合转移,通过自杀性质粒介导的等位交换技术两步法筛选sI,1344的AcrpAasd双缺失株。该缺失株在有外源DAP的存在下能够正常生长,且能稳定遗传缺失的“sd基因;其血清型与亲本株SL1344Acrp及强毒株SL1344保持一致;其生化特性与亲本株基本相同,但与强毒株相比变化较明显,且生长速度明显减慢;雏鸡毒力试验结果表明其毒力较SL1344降低约10j倍。鼠伤寒沙门菌SL1344AcrpzSasd缺失株构建成功,为进一步开发以鼠伤寒沙门菌为载体的口服疫苗奠定了基础。     

新型重组减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd)平衡致死系统的构建及其特性

为开发新型重组减毒鸡白痢沙门菌口服活疫苗载体。本研究以pcDNA3.1-Zeo(+)质粒为基础,用沙门菌asd基因替代其氨苄抗性基因Amp,构建不含抗性基因的真核互补质粒pcD-asd;再将互补质粒pcD-asd电转入沙门菌ΔcrpΔasdC79-13,构建ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd)平衡致死系统,研究其生物学特性,进一步将报告基因EGFP克隆入pcD-asd,构建重组菌株ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd-EGFP),感染鸡胚成纤维(CEF)细胞,Western blot分析该系统递呈外源抗原的能力。PCR、酶切及测序结果表明ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd)平衡致死系统构建成功;生物学特性鉴定结果表明,其血清型与亲本株ΔcrpΔasdC79-13及野生株C79-13保持一致;其生化特性与亲本株基本相近,但与野毒株相比发生明显变化;生长速度也更为缓慢,对氨苄抗生素敏感;重组菌株ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd)的LD50较野生株C79-13降低了3.4×104倍;Western blot结果发现,重组菌株感染CEF细胞后,可表达大小约为27 000EGFP蛋白。以上结果证实,本研究成功构建了新型重组减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpΔasdC79-13(pcD-asd)株,其能够有效递呈外源抗原,该重组菌株有潜力作为安全、稳定、高效表达外源基因的口服重组活疫苗载体。     

鼠伤寒沙门菌SL1344株cAMP受体蛋白基因缺失株的构建及其生物学特性

通过自杀性质粒介导的细菌同源重组技术,构建鼠伤寒沙门菌SL1344株的crp基因缺失疫苗候选菌株,并对其生物学特性进行初步研究。首先构建含缺失321bp crp基因的重组自杀性质粒pREΔcrp,然后利用重组自杀性质粒介导的等位基因交换技术,两步法筛选SL1344的Δcrp缺失株,用PCR鉴定结果表明该缺失株构建成功。生物学特性研究发现,缺失株ΔcrpSL1344保留了亲本菌株SL1344的血清型1,4,5,12：i：1,2,且能够稳定遗传缺失321bp的crp基因;但是,与亲本株SL1344相比,其生化特性发生明显改变,生长速度明显减慢。缺失株ΔcrpSL1344口服感染1日龄雏鸡的LD50为7.40×109 CFU,毒力较亲本株SL1344降低32 456倍。以上研究结果表明,SL1344株crp基因缺失株构建成功,且遗传稳定,毒力明显降低,为进一步将其开发为鼠伤寒沙门菌弱毒疫苗候选菌株奠定基础。     

表达NDV HN蛋白重组减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpΔasdC79-13的构建及生物学特性

利用平衡致死系统构建表达鸡新城疫病毒(newcastle disease virus,NDV)血凝素-神经氨酸酶(HN)的减毒鸡白痢沙门菌活载体疫苗株。以p MD18-T-HN为模板,经PCR扩增出HN基因,定向插入原核表达载体p YA3493,构建重组质粒p YA-HN,再将其电转入减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpΔasd C79-13中,获得重组减毒鸡白痢沙门菌ΔcrpΔasd C79-13(p YA-HN)。对重组菌的生化特性、生长特性、稳定性及安全性进行测定;并对重组菌表达的HN蛋白进行SDSPAGE和Western blot分析。结果显示,该重组菌保留了在DAP阴性环境中的生存能力;不能利用麦芽糖、蔗糖及乳糖等碳源,但保留了利用葡萄糖的能力;其生长速度明显低于强毒株C79-13,而与ΔcrpΔasd C79-13相比变化不明显;在体外连续传代能稳定遗传HN基因片段;经SDS-PAGE出现1条蛋白质量约为63 000的蛋白条带;Western blot证明重组菌表达的HN蛋白能与NDV阳性血清特异性结合;雏鸡口服接种试验表明ΔcrpΔasd C79-13(p YA-HN)的毒力较强毒株C79-13下降183倍。上述结果表明,成功构建了能稳定表达NDV HN蛋白的口服重组减毒鸡白痢沙门菌,为开发鸡白痢—新城疫的基因工程口服疫苗奠定了初步基础。     

鼠伤寒沙门氏菌SL1344株△crp△cya缺失株的构建及其生物学特性初步研究

为研制更加安全并保持良好免疫原性的弱毒株鼠伤寒沙门氏菌(S.typhimurium)及疫苗活载体,本研究通过自杀性质粒介导的细菌同源重组技术,将已缺失cya基因的SL1344株进一步缺失crp基因,构建S.typhi-murium SL1344△crp△cya双基因缺失突变株,并对其生物学特性进行初步研究。双基因缺失株的构建是以含有重组自杀性质粒pRE△crp的大肠杆菌χ7213为供体菌,SL1344△cya为受体菌进行接合转移,两步法筛选crp/cya基因双缺失突变株,并通过PCR和测序鉴定。对双缺失菌株的生物学特性鉴定表明,SL1344△crp△cya血清型与亲本株SL1344△cya及野生株SL1344保持一致,并且能够稳定遗传缺失后的crp基因;其生化特性与亲本株基本相近,但与野毒株相比发生明显变化,生长速度也更为缓慢;对雏鸡致病性测定试验显示,双缺失株毒力比SL1344至少降低了约106倍。实验结果表明,S.typhimurium SL1344△crp△cya缺失株具有良好的遗传稳定性,毒力明显降低,为深入研究以S.typhimurium为载体的口服疫苗奠定了基础。     

减毒鼠伤寒沙门菌活疫苗载体研究进展

活载体疫苗技术的发展促使产生了更多的疫苗设计新思路.沙门菌是一种肠道细菌,目前已通过基因突变的方法构建了许多种减毒株,如GID101、GID105、X4064、ZJⅢ、Ty800、X4632、X4550、X4072和X3730等,这些减毒株被突变掉了两个或两个以上的基因,然而其基因型和血清型仍很稳定,所以人们常将其用作基因疫苗的表达载体或运送载体.现在已有许多种细菌、病毒和寄生虫的减毒沙门菌活载体疫苗被研制成功.文章对沙门菌的减毒方法,减毒沙门菌的免疫机理以及其用途和作为疫苗载体的优缺点做了简述.     

5株鼠伤寒沙门菌基因缺失株的生物学特性比较

为了探讨crp、cya、sipB、crp/cya、crp/sipB基因缺失株成为鼠伤寒沙门菌减毒候选活疫苗的可能性,对缺失株的生物学特性进行研究。结果显示,缺失株的血清型仍和亲本菌株相同,其中crp、cya、crp/cya、crp/sipB与亲本菌株相比失去了利用麦芽糖、乳糖、山梨醇等碳源的能力,也不能分解H2S、半乳糖和鼠李糖,但仍保留了利用葡萄糖的能力。通过口服方式把5株crp、cya、sipB、crp/cya、crp/sipB基因缺失株接种KM小鼠进行毒力测定和免疫保护性测定,结果它们的半数致死量比野生株的至少高700倍,双基因缺失株的毒力更弱,攻毒后crp、cya、sipB、crp/cya、crp/sipB基因缺失株的免疫保护率分别为90.0%,60.0%,50.0%,60.0%,60.0%。结果表明,crp基因缺失株可作为鼠伤寒沙门菌减毒活疫苗的候选株。     

鹅源鼠伤寒沙门菌crp、hfq基因缺失株的构建及生物学特性分析

为构建鹅鼠伤寒沙门菌单基因缺失株并鉴定其生物学特性,本研究以广东地区鹅源鼠伤寒沙门菌流行株A29为研究对象,采用λ-Red同源重组技术,分别构建crp、hfq基因缺失株(A29Δcrp和A29Δhfq)及相应基因回补株,并分别采用相应引物经PCR鉴定。通过细菌培养,对各菌株生物学特性进行比较;通过PCR鉴定各菌株的遗传稳定性;采用K-B纸片扩散法检测各菌株的药物敏感性;将各菌株纯培养物经腹腔注射4周龄小鼠,测定各菌株对小鼠的毒力,并观察感染后小鼠的临床症状及各组织剖检病变与组织病理变化。PCR和测序结果表明,正确构建各基因缺失株和相应回补株。生物学特性试验结果显示,与亲本株相比,A29Δcrp菌落直径极显著变小(P<0.001),不产酸、不产生H₂S,菌体极显著变短(P<0.001);A29Δhfq菌落边缘不整齐,不产生H₂S,菌体极显著变长(P<0.001),表明crp、hfq基因影响细菌的菌落形态、生化特性和形态特征。菌株遗传稳定试验结果显示,菌株传至60代时,基因缺失株仍能够稳定缺失。药敏试验结果显示,与亲本株比较,A...     

鼠伤寒沙门菌sapC基因缺失株的构建及生物学特性分析

旨在研究鼠伤寒沙门菌ABC转运膜蛋白SapC在沙门菌致病机制中的功能。本研究利用λ-Red重组技术构建了鼠伤寒沙门菌sapC基因缺失突变株SMΔsapC,对其进行生长特性、酸性应激试验、多黏菌素B敏感性试验、生物被膜检测、胞内存活和小鼠体内毒力试验。结果显示,基因缺失株SMΔsapC与亲本菌株和互补菌株相比,其生长速度无明显差异;在酸应激条件下,SMΔsapC存活率显著低于亲本菌株;sapC基因缺失降低了鼠伤寒沙门菌生物被膜的形成能力;同时,SMΔsapC基因缺失株在鼠源巨噬细胞内的增殖能力和小鼠体内的毒力显著低于亲本菌株。研究表明,sapC基因影响鼠伤寒沙门菌的抗酸能力、生物被膜形成能力,从而影响沙门菌在体内外的毒力。本研究为进一步阐释鼠伤寒沙门菌的致病机制奠定了基础。     

鼠伤寒沙门菌oppCDF基因缺失株的构建及生物学特性分析

利用λ-Red同源重组技术构建鼠伤寒沙门菌oppCDF基因缺失株,并检测其生长特性、运动性、生物被膜形成能力、胞内存活能力及LD₅₀毒力。结果显示,与野生型菌株相比,oppCDF基因缺失株的生长特性无明显变化;oppCDF基因缺失株可降低鼠伤寒沙门菌的运动性;oppC与oppF基因缺失后可提高鼠伤寒沙门菌生物被膜形成能力;同时,oppC基因缺失可降低在RAW267.4细胞内的存活能力和其在小鼠体内的毒力,oppF基因缺失可显著增强在RAW267.4内的存活能力和对小鼠毒力的影响,而oppD基因缺失后其在小鼠体内的毒力和RAW267.4内的存活率均无显著变化。研究表明,oppCDF基因与鼠伤寒沙门菌的运动性、生物被膜形成和毒力密切相关,为进一步揭示鼠伤寒沙门菌致病作用中的复杂调控和机制提供了理论基础。     

小鼠感染猪源鼠伤寒沙门菌分离株的检测

小鼠对鼠伤寒沙门菌感染的检测分析有助于沙门菌致病机理的研究。从扬州市某屠宰场猪胴体表面采样分离出了一株沙门菌,通过生化鉴定及血清型分析,判断该菌株为鼠伤寒沙门菌。药物敏感性分析表明,该菌株对氨苄青霉素高度耐药,而对头孢类等药物敏感。动物试验结果表明,腹腔注射5×105CFU/只的剂量即可致死小鼠,1×104 CFU/只的剂量感染后,虽然不能致死小鼠,但能引起小鼠肝脏和脾脏的病理损伤和炎症反应,脏器系数升高,肝脏抗氧化系统紊乱;细菌在小鼠体内的定殖能力较强,4周以后肝脏和脾脏中仍能分离到;感染小鼠血清生化指标(ALT、AST、ALP、TP、ALB)异常,部分细胞因子(IFN-γ和TNF)升高。说明该菌株能诱导脾脏中T淋巴细胞的活化。通过以上分析,对该分离菌株的生物学特性有了初步的了解。     

减毒鼠伤寒沙门菌在雏鸡体内的安全性与免疫原性研究

通过鸡接种不同剂量的SL8132、SL8786、SL8132/pcDNA3s与SL8786/pcDNA3s,测定其致病力与免疫效果,检测了诱导乙肝表面抗体(抗-HBs)的动态变化.结果表明减毒鼠伤寒沙门菌原菌SL8132、SL8786接种后连续观察雏鸡10d,不同剂量组的感染均未引起死亡.接种后7周,肝脏、脾脏中已没有菌落,粪便中仅有极少量的菌落.口服减毒鼠伤寒沙门菌在完成抗原呈递后即被鸡体免疫系统所清除,未发现雏鸡出现明显毒副作用.SL8132/pcDNA3s与SL8786/pcDNA3s疫苗诱导的抗-HBs动态检测发现,抗-HBs在免疫后水平逐渐升高,到第8周最高,此后逐渐下降.原菌SL8132与SL8786与重组菌株SL8132/pcDNA3s与SL8786/pcDNA3s均具有良好的安全性与免疫原性.     

鼠伤寒沙门菌tolA缺失株的构建及生物学功能研究

为了研究tolA基因在鼠伤寒沙门菌外膜完整性及外膜囊泡(OMVs)形成中的作用,通过自杀载体介导的同源重组技术,构建鼠伤寒沙门菌X3761的tolA基因缺失株△tolA.通过比较鼠伤寒沙门菌野生株X3761与缺失株△tolA的生物学特性,发现敲除tolA基因对X3761的生长特性没有显著影响.革兰染色镜检发现,X376...     

表达破伤风毒素C片段的重组鼠伤寒沙门菌的构建与鉴定

为构建表达破伤风毒素C片段基因的减毒鼠伤寒沙门菌，将编码破伤风毒素C片段的基因插入到asd^＋的组成型表达载体pYA3333，转化asd基因突变的E．coli X6212。获得重组质粒pYA3333-TetC，再将重组质粒通过电穿孔法转入宿主菌，构建成表达破伤风毒素C片段基因的平衡致死的鼠伤寒沙门菌X4550（pYA3333-TetC）。免疫印迹试验证实，该重组菌表达的蛋白与预期的目的蛋白一致。重组菌X4550（pYA3333-TetC）的稳定性试验表明，在体外培养100代后，随机挑选的重组菌落全部都能生长，重组菌X4550（pYA3333-TetC）的生长曲线测定表明，X4550（pYA3333-TetC）和X4550（pYA3333）的生长状态基本一致。动物试验证明，该重组菌是安全的，破伤风毒素攻击后能提供良好的保护作用。     

鹅源鼠伤寒沙门菌的分离鉴定及药敏试验

对临床送检疑似鼠伤寒沙门菌感染的病例进行细菌分离,利用沙门菌所具有的种属特异性的亲膜蛋白基因inv A做PCR鉴定,结合生化鉴定和血清型鉴定,并分析分离菌的耐药性。从4例病死鹅病料中共分离到4株细菌,经inv A PCR鉴定、生化特点和血清型鉴定确认为鼠伤寒沙门菌。药敏试验结果显示,4株分离菌对庆大霉素、诺氟沙星、头孢曲松等药物敏感性较强,但对多黏菌素B、多西环素耐药。其中,有2个分离株表现出多重耐药性。     

鼠伤寒沙门菌烈性噬菌体的分离鉴定与生物学特性

旨在分离鼠伤寒沙门菌烈性噬菌体,为控制该病原菌感染或污染提供生物制剂.以1株从市售散装牛奶中分离到的多重耐药性鼠伤寒沙门菌为宿主菌,采用人工诱导方法,连续1周每日给3只试验鸡饲喂宿主菌悬液,7 d后,采用双层琼脂平板法从试验鸡粪便中分离培养噬菌体,并对其效价、核酸类型、宿主谱、热稳定性与酸碱耐受性以及对鼠伤寒沙门菌感染...     

STM1863分子特征分析及其基因缺失对鼠伤寒沙门菌生物学特性的影响

为揭示鼠伤寒沙门菌SL-1344菌株RcsCDB系统STM1863调控子分子特征,及对STM生物学特性的影响。本研究通过PCR扩增STM1863基因并进行克隆和测序,预测分析其编码蛋白的分子特征;利用λ-Red同源重组技术构建STM-ΔSTM1863基因缺失突变株,并对其生化特性、遗传稳定性、酸碱胁迫环境中的适应性及粘附侵袭小鼠巨噬细胞的能力进行研究。结果显示：STM1863基因全长159 bp,编码52个氨基酸,具有一个跨膜和d1p32a同系物结构域;与SL-1344亲本株相比,STM-ΔSTM1863缺失株生化特性与亲本株无明显差异,生长速度与亲本株生长速度一致,但STM-ΔSTM1863在p H4.0酸应激下对数期生长速度显著低于亲本株（P<0.05）;粘附和侵袭小鼠巨噬细胞能力与亲本株相比极显著降低（P<0.01）。提示STM1863因参与了STM酸应激和粘附侵袭宿主细胞的调控,本研究为深入揭示STM1863对STM粘附侵袭宿主细胞的调控机制提供了参考。