利用实时定量PCR研究不同蛋白质饲料对嗜淀粉瘤胃杆菌生长参数的影响

本试验主要研究不同蛋白质饲料对嗜淀粉瘤胃杆菌(Ruminobacter amylophilus)生长的影响.选用4只装有瘤胃瘘管的徐淮白山羊羯羊,分别饲喂以羽毛粉、玉米蛋白粉、豆粕和鱼粉为蛋白质补充料的4组日粮,进行4×4拉丁方设计的试验,并采用实时定量PCR(RT-PCR)技术对嗜淀粉瘤胃杆菌进行定量分析.结果表明,豆粕组瘤胃氨氮浓度最高,并显著高于其他3组(P<0.05);细菌总数在组间差异不显著(P>0.05);嗜淀粉瘤胃杆菌的密度及其数量在细菌总数中的比例均以豆粕组最高,且组间差异显著(P<0.05).总之,豆粕饲料适宜于嗜淀粉瘤胃杆菌的生长,RT-PCR技术适用于瘤胃微生物的定量研究.     

放牧与舍饲育肥对绒山羊成年羊与羔羊瘤胃内几种微生物数量的影响

试验主要研究了放牧与舍饲两种不同饲养方式对阿尔巴斯白绒山羊成年羊与羔羊瘤胃内总菌、原虫及7种微生物数量的影响。试验采用单因子完全随机试验设计,分2部分进行。试验1将60只年龄、体重相近的淘汰成年母羊随机分为2组,每组30只。一组为对照组,在天然草场进行自然放牧育肥;一组为试验组,采用全混合日粮进行舍饲育肥,自由采食,育肥期60 d。试验2将60只日龄相近[(130±10)d]的去势公羔分为2组,每组30只。一组为对照组,进行放牧补饲育肥,一组为试验组,进行全混合日粮舍饲育肥。各组羔羊均自由饮水,育肥期3个月。在试验结束时,分别从2个试验的对照组和试验组中各选择6只成年羊(共12只)或羔羊(共12只),在禁食24 h、禁水2 h后屠宰,采集瘤胃液用于分析。结果表明,与对照组相比,试验组成年羊瘤胃液中原虫、产琥珀酸丝状菌与脂解厌氧弧杆菌数量显著增加(P=0.01,P=0.05,P=0.05),总产甲烷菌与反刍月型单胞菌趋于显著增加(P=0.06,P=0.09),牛链球菌趋于显著降低(P=0.07),总细菌、白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌及嗜淀粉瘤胃杆菌的组间差异均不显著(P0.10)。试验组成年羊瘤胃内以反刍月型单胞菌比例最高,脂解厌氧弧杆菌占比最低,趋于显著或显著高于对照组(P=0.03,P=0.05);对照组以嗜淀粉瘤胃杆菌比例最高,反刍月型单胞菌比例次之,脂解厌氧弧杆菌最低。与对照组相比,试验组羔羊瘤胃液的总细菌量显著增加(P=0.003),总产甲烷菌及原虫数量差异趋于显著增加(P=0.077,P=0.089);其他7种菌的数量无显著变化(P0.10),试验组与对照组羔羊瘤胃内均以嗜淀粉瘤胃杆菌占比最高,脂解厌氧弧杆菌最低。这些结果表明,舍饲育肥可显著增加瘤胃原虫和部分菌群的数量及其比例,成年羊的作用效果更大。     

热应激对奶牛瘤胃液微生物数量的影响

本试验采用实时荧光定量PCR技术研究热应激对不同泌乳阶段奶牛瘤胃液微生物数量的影响。采用2×3交叉试验设计,根据胎次、平均泌乳天数和产奶量相近的原则,选择18头经产中国荷斯坦奶牛,分为泌乳前期(产后15～100 d)组、泌乳中期(产后112～175 d)组、泌乳后期(产后200～230 d)组,每组6个重复,根据实测的牛场温湿指数(THI)变化,采用热应激与非热应激的自身对照试验。结果表明:与非热应激期相比,热应激极显著提高了泌乳前期组奶牛瘤胃液各类微生物数量(P<0.01),极显著提高了泌乳后期组奶牛瘤胃液黄化瘤胃球菌数量和泌乳中期组的产琥珀酸拟杆菌数量(P<0.01),极显著降低了泌乳中、后期组的总细菌数量、白色瘤胃球菌数量和泌乳后期组的产琥珀酸拟杆菌数量(P<0.01)。整个热应激期THI与泌乳前期组奶牛瘤胃液总细菌数量(P<0.01)、厌氧真菌数量(P<0.05)、白色瘤胃球菌数量(P<0.01)和黄化瘤胃球菌数量(P<0.05)有较强的相关性,而THI与泌乳中、后期组奶牛的这些指标相关性较差。综上所述:1)泌乳前期组奶牛热应激期的瘤胃液各类微生物数量均极显著高于非热应激期,但对泌乳中、后期组的各类微生物数量影响无规律性。2)泌乳前期组奶牛瘤胃液微生物数量对热应激的反应更敏感。     

山羊瘤胃嗜淀粉瘤胃杆菌16S rDNA序列体外扩增鉴定

以嗜淀粉瘤胃杆菌(Ruminobacter amylophilus) 目的菌种,依其16S rDNA序列(Y15992)设计特异引物,进行PCR扩增,并测序后进行同源性分析.结果表明,特异性引物成功扩增出的嗜淀粉瘤胃杆菌DNA的特异性片段.与基因库中原序列具有较高的同源民性(96.9%).说明利用这种方法可以对山羊瘤胃微生物进行鉴定和分析.     

3种瘤胃纤维分解菌实时定量PCR方法的建立

为探索以减毒胞内侵袭菌介导的黏膜免疫对宿主动物胃肠道微生态的影响,本试验以白色瘤胃球菌、黄化瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌3种主要瘤胃纤维分解菌16S rRNA分别设计引物,以山羊瘤胃液提取细菌总DNA,分别扩增3种纤维分解菌目的DNA片段,并连接至pMD-18 T Vector上,经PCR和测序鉴定后,以不同稀释度的重组质粒为模板进行荧光定量PCR反应。结果显示,扩增得到的3种瘤胃纤维分解菌目的片段与已知菌种相应片段的同源性大于99%;以不同稀释度重组pMD-18 T为模板建立的荧光定量PCR扩增曲线差异明显,绘制标准曲线的相关系数均接近1,熔解曲线均呈单一峰值。因此,本试验成功建立了3种瘤胃主要纤维分解菌的实时定量PCR方法,为减毒胞内侵袭菌介导的黏膜免疫研究奠定了基础。瘤胃纤维分解菌;Real-time PCR;标准曲线;     

瘤胃内微生物对饲料蛋白质消化的探析

1饲料蛋白质被瘤胃微生物降解瘤胃中有很多细菌能分泌蛋白酶,具有降解蛋白质的能力。最熟知的有嗜淀粉拟杆菌、溶纤维丁酸弧菌和栖瘤胃普雷沃氏菌这3种细菌。瘤胃真菌也具有分解蛋白质的能力。瘤胃厌氧性真菌菌株都可产生金属蛋白酶,N.frontalis可产生相当于细菌产生的高活性蛋白酶。     

运用Real-time PCR方法研究日粮添加豆油与胡麻油对肉牛瘤胃纤维分解菌数量的影响

本研究分别以产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)、黄色瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)、白色瘤胃球菌(Ruminobacter albus)和溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisolvens)16S rDNA序列设计引物,运用Real-time PCR技术研究日粮中添加豆油与胡麻油对肉牛上述4种瘤胃纤维分解菌数量的影响.结果表明,与对照组(CK)相比,添加豆油组(LOC1)和胡麻油(LOC2)组,产琥珀酸丝状杆菌(Fibrobacter succinogenes)、黄色瘤胃球菌(Ruminococcus flavefaciens)、白色瘤胃球菌(Ruminobacter albus)和溶纤维丁酸弧菌(Butyrivibrio fibrisol-vens)数量显著减少(P<0.05),分别降低了78%和31%、30%和36%、27%和23%、6%和13%.通过该方法的结果表明日粮中添加4%的豆油和胡麻油显著减少了瘤胃中纤维分解菌,对产琥珀酸丝状杆菌的影响明显.而且采用Real-time PCR方法对瘤胃纤维分解菌进行定量,可以快速有效反映出在日粮改变的情况下菌的数量变化趋势,相对于传统计数方法更直观、快捷与准确.     

不同长链脂肪酸组合对体外瘤胃细菌发酵和群体结构的影响

本试验旨在研究不同长链脂肪酸组合对体外培养瘤胃细菌发酵和群体结构的影响。以3头瘤胃瘘管奶牛提供瘤胃液,对照(A)组底物含5%脂肪酸钙,试验组培养底物中硬脂酸、油酸、亚油酸和亚麻酸的含量分别为1.5%、1.0%、0.5%和1.5%(B组),1.5%、1.0%、1.5%和1.0%(C组),1.0%、1.5%、1.5%和0.5%(D组)以及1.5%、0.5%、0.5%和1.0%(E组)。在培养后0、3、6、12、18、24 h采集培养液,测定p H、氨氮浓度和瘤胃细菌含量。结果表明:1)培养液p H在组间的差异不显著(P0.05);C组的培养液氨氮浓度显著高于B、D组(P0.05)。2)除白色瘤胃球菌,其他菌属含量在组间存在显著差异(P0.05)。其中琥珀酸拟杆菌、生黄瘤胃球菌、蛋白溶解梭菌和嗜淀粉瘤胃杆菌含量在B组较高;C组溶纤维丁酸弧菌、埃氏巨球菌、降解淀粉瘤胃球菌以及瘤胃总细菌含量显著高于其他各组(P0.05)。培养液埃氏巨球菌含量最高,为优势菌。综合得出,脂肪酸组合对瘤胃总细菌和大部分细菌种属含量有显著影响,这与发酵模式有关。     

小花棘豆中毒对和田羊瘤胃微生物数量的影响

探讨小花棘豆对和田羊瘤胃微生物区系的影响,进一步揭示小花棘豆的毒性作用机理。将12只和田羊随机分为3组,即对照组、试验Ⅰ组和试验Ⅱ组。试验组分别按10g/kg和20g/kg的剂量饲喂小花棘豆,至典型临床症状出现为止。攻毒前及攻毒后每隔7d取瘤胃液,检测瘤胃液中微生物数量的变化。结果显示,与正常对照相比,试验羊瘤胃液中总细菌数、白色瘤胃球菌数、黄化瘤胃球菌数、纤毛虫数、内毛虫数和双毛虫数极显著下降（P〈0.01）,并与小花棘豆中毒呈现较强的相关性;而瘤胃液中厌氧真菌数、产琥珀酸拟杆菌数和等毛虫数与小花棘豆中毒无明显相关性。结果表明,小花棘豆中毒可显著影响和田羊瘤胃纤维素分解菌和纤毛虫数量,且具有一定的时间效应和剂量效应关系。     

外源纤维酶对奶牛瘤胃纤维降解细菌影响的研究

为研究外源纤维酶对奶牛瘤胃纤维降解细菌的影响,试验选用安装有永久性瘤胃瘘管,年龄、体重相近的3头奶牛为试验动物,采用前后期自身对照试验方法,进行2期动物试验,第1期基础日粮中不加外源纤维酶(对照组),第2期(试验组)基础日粮中,将外源纤维酶组合按日粮的0.1%进行添加饲喂。结果显示,外源纤维酶显著提高了奶牛瘤胃中的白色瘤胃球菌、黄化瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌、溶纤维丁酸弧菌、反刍兽真细菌和栖瘤胃普雷沃氏菌(P<0.05～P<0.01)的数量。     

Ground transport stress affects bacteria in the rumen of beef cattle: A real‐time PCR analysis

Transport stress syndrome often appears in beef cattle during ground transportation, leading to changes in their capacity to digest food due to changes in rumen microbiota. The present study aimed to analyze bacteria before and after cattle transport. Eight Xianan beef cattle were transported over 1000 km. Rumen fluid and blood were sampled before and after transport. Real‐time PCR was used to quantify rumen bacteria. Cortisol and adrenocorticotrophic hormone (ACTH) were measured. Cortisol and ACTH were increased on day 1 after transportation and decreased by day 3. Cellulolytic bacteria (Fibrobacter succinogenes and Ruminococcus flavefaciens), Ruminococcus amylophilus and Prevotella albensis were increased at 6 h and declined by 15 days after transport. There was a significant reduction in Succinivibrio dextrinosolvens, Prevotella bryantii, Prevotella ruminicola and Anaerovibrio lipolytica after transport. Rumen concentration of acetic acid increased after transport, while rumen pH and concentrations of propionic and butyric acids were decreased. Body weight decreased by 3 days and increased by 15 days after transportation. Using real‐time PCR analysis, we detected changes in bacteria in the rumen of beef cattle after transport, which might affect the growth of cattle after transport.     

酵母发酵饲料对瘤胃菌群数量及多样性的影响

本试验研究日粮中添加酵母发酵饲料对蒙古绵羊瘤胃菌群数量及多样性的影响.选用10只安装永久性瘤胃瘘管且体重约40 kg的14月龄蒙古羯羊,分为对照组和试验组,每组各5只.对照组饲喂基础日粮,试验组饲喂基础日粮+酵母发酵饲料(13.37％).预试期15 d,正试期5 d.于正试期晨饲后0、3、6、9、12 h依次采集瘤胃液...     

藏绵羊暖、冷季瘤胃微生物菌群密度与其短链脂肪酸浓度互作分析

针对藏绵羊暖、冷季营养供给严重不均衡的生产实际,本试验旨在解析藏绵羊应对冷季营养严重匮乏的适应机制.试验选择1周岁(±1月龄)健康的放牧藏绵羊母羊12只,采用气相色谱仪和荧光定量PCR仪分别测定藏绵羊暖(7月)、冷(12月)季瘤胃短链脂肪酸(SCFA)浓度和微生物菌群密度,分析藏绵羊暖、冷季瘤胃SCFA浓度与微生物菌群...     

Effect of ginkgo extract supplementation on in vitro rumen fermentation and bacterial profiles under different dietary conditions

Ginkgo extract was applied to a batch culture study and evaluated for its potential as a feed additive for ruminant animals under different forage‐to‐concentrate (F:C) ratios (1:9, 3:7, 5:5, 7:3 and 9:1). Rumen fluid was mixed with respective diet and incubated at 39°C for 24 h with and without ginkgo extract (1.6% fruit equivalent in culture). Methane production was significantly decreased by ginkgo extract, with the greatest reductions found in the 5:5 (41.9%) followed by the 7:3 ratios (36.7%). Total short chain fatty acid and ammonia levels were not affected by ginkgo extract supplementation in any of the five different diets. However, ginkgo extract increased propionate proportion and decreased acetate proportion in all dietary conditions tested. The levels of total bacteria, Ruminococcus flavefaciens, Ruminococcus albus and Fibrobacter succinogenes were decreased by ginkgo extract. The levels of Selenomonas ruminantium, Anaerovibrio lipolytica, Ruminobacter amylophilus, Succinivibrio dextrinosolvens and Megasphaera elsdenii were increased by ginkgo extract supplementation, possibly contributing to the higher propionate production. These results suggest that rumen modulation by ginkgo extract can be achieved at a wide range of F:C ratios with no adverse impact on feed digestion. Moreover, F:C ratios of 5:5 and 7:3 may be optimal when methane mitigation is expected.     

Quantitative comparisons of select cultured and uncultured microbial populations in the rumen of cattle fed different diets

ABSTRACT: BACKGROUND: The number and diversity of uncultured ruminal bacterial and archaeal species revealed by 16S rRNA gene (rrs) sequences greatly exceeds that of cultured bacteria and archaea. However, the significance of uncultured microbes remains undetermined. The objective of this study was to assess the numeric importance of select uncultured bacteria and cultured bacteria and the impact of diets and microenvironments within cow rumen in a comparative manner. RESULTS: Liquid and adherent fractions were obtained from the rumen of Jersey cattle fed hay alone and Holstein cattle fed hay plus grain. The populations of cultured and uncultured bacteria present in each fraction were quantified using specific real-time PCR assays. The population of total bacteria was similar between fractions or diets, while total archaea was numerically higher in the hay-fed Jersey cattle than in the hay-grain-fed Holstein cattle. The population of the genus Prevotella was about one log smaller than that of total bacteria. The populations of Fibrobacter succinogenes, Ruminococcus flavefaciens, the genus Butyrivibrio, and R. albus was at least one log smaller than that of genus Prevotella. Four of the six uncultured bacteria quantified were as abundant as F. succinogenes, R. flavefaciens and the genus Butyrivibrio. In addition, the populations of several uncultured bacteria were significantly higher in the adherent fractions than in the liquid fractions. These uncultured bacteria may be associated with fiber degradation. CONCLUSIONS: Some uncultured bacteria are as abundant as those of major cultured bacteria in the rumen. Uncultured bacteria may have important contribution to ruminal fermentation. Population dynamic studies of uncultured bacteria in a comparative manner can help reveal their ecological features and importance to rumen functions.     

发酵玉米蛋白粉对奶牛瘤胃体外发酵特性及微生物菌群的影响

本试验旨在研究全混合日粮（TMR）中添加发酵玉米蛋白粉（fermented corn gluten meal,FCGM）对奶牛瘤胃体外发酵特性及微生物菌群的影响。选用3头体重（600±25）kg,安装永久性瘤胃瘘管的荷斯坦奶牛作为瘤胃液供体,发酵底物为TMR,分为对照组和3个试验组,各组分别在发酵液中添加0、0.3、0.6、0.9 g/L FCGM（干物质基础）,每个处理3个重复。记录体外发酵12、24、36和48 h产气量,测定体外发酵12、24和48 h发酵液pH、体外干物质消失率（IVDMD）、纤维素酶活性、氨态氮（NH₃-N）、挥发性脂肪酸（VFA）和菌体蛋白浓度,并测定体外发酵24 h发酵液中瘤胃微生物菌群相对丰度。结果显示：①添加不同水平FCGM组的体外产气量（除12 h外）、慢速产气部分、潜在产气部分和有效产气速率均显著或极显著高于对照组（P < 0.05;P < 0.01）;②与对照组相比,添加不同水平FCGM处理组的发酵液pH显著或极显著低于对照组,纤维素酶活性、菌体蛋白、挥发性脂肪酸、氨态氮含量和体外干物质消失率均显著或极显著升高（P < 0.05;P < 0.01）,且0.9 g/L FCGM组达到最高。③添加0.6和0.9 g/L FCGM组发酵液中白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌、产琥珀酸丝状杆菌、牛链球菌、普雷沃氏菌、溶纤维丁酸弧菌、嗜淀粉瘤胃杆菌、真菌和原虫相对丰度均显著高于对照组（P < 0.05）,且0.9 g/L FCGM组达到最高,而产甲烷菌相对丰度显著低于对照组（P < 0.05）,且0.9 g/L FCGM组达到最低。综上所述,TMR中添加FCGM可提高体外发酵产气量,增加发酵液内纤维素酶活性、VFA、NH3-N及菌体蛋白含量,提高瘤胃内某些纤维降解菌、蛋白降解菌、淀粉降解菌、真菌和原虫相对丰度,降低产甲烷菌相对丰度,调节瘤胃微生物菌群结构,改善瘤胃发酵,其中以添加0.9 g/L FCGM为宜。     

实时荧光定量PCR对瘤胃纤维分解菌定量方法的构建

试验构建了白色瘤胃球菌、黄色瘤胃球菌及产琥珀酸丝状杆菌等3种瘤胃纤维分解菌实时荧光绝对定量PCR的标准品及标准曲线,以用于纤维分解菌的定量测定。提取瘤胃微生物总DNA,以各菌特异性引物进行PCR扩增,回收纯化PCR产物,与pMD18-T Vector连接并转化到大肠杆菌。用氨苄青霉素培养基筛选阳性重组质粒,提取含目的片段质粒DNA,通过PCR及测序鉴定重组质粒。根据OD值确定浓度,将梯度稀释的质粒作为模板,进行荧光定量PCR反应做出标准曲线。结果表明:所构建的3条标准曲线具有很高的相关性(R2>0.999),并获得了高扩增效率产物(白色瘤胃球菌为101%、黄色瘤胃球菌为98.0%、产琥珀酸丝状杆菌为97.7%),说明成功构建了瘤胃纤维分解菌实时绝对定量PCR的标准品和标准曲线,为定量研究瘤胃纤维分解菌奠定基础。     

饲粮中燕麦干草含量对绵羊瘤胃液pH及微生物区系的影响

本试验旨在研究饲粮燕麦干草含量对绵羊瘤胃液p H及微生物区系的影响。选取9只体况和体重[(70.32±2.14)kg]相近、装有永久性瘘管的德国美利奴与蒙古羊杂种公羊,采用3×3拉丁方设计,随机分为3组,每组3只,各组分别采用全株玉米青贮、全株玉米青贮+燕麦干草(1∶1)(混合组)、燕麦干草为粗饲料。饲粮精粗比34.50∶65.50。进行3期饲养试验,每期20 d,15 d预试期,5 d采样期。采集饲喂前(0 h)和饲喂后1、3、5和7 h的瘤胃液,测定p H,采用实时定量PCR方法测定微生物相对含量。结果表明:1)全株玉米青贮组的瘤胃液p H在1、5 h均显著低于燕麦干草组(P0.05),在3 h极显著低于混合组(P0.01);2)混合组和燕麦干草组瘤胃液真菌的相对含量在0 h均极显著高于全株玉米青贮组(P0.01),燕麦干草组在5 h真菌相对含量显著高于全株玉米青贮组(P0.05);3)混合组原虫的相对含量在1、5 h显著低于全株玉米青贮组(P0.05);4)饲喂后5 h,混合组和燕麦干草组的纤维分解菌相对含量均较高,其中燕麦干草组黄色瘤胃球菌相对含量显著高于全株玉米青贮组(P0.05),白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌的相对含量极显著高于全株玉米青贮组(P0.01)。综上所述,在精粗比为34.50∶65.50的饲粮中采用全株玉米青贮+燕麦干草(1∶1)的粗饲料,有利于维持绵羊瘤胃内环境的稳态及瘤胃微生物的生长,白色瘤胃球菌和产琥珀酸丝状杆菌为优势菌。     

羊草茎在奶牛瘤胃中降解特性及其对食糜纤维分解菌数量的影响

本试验旨在研究羊草茎降解特性和紧密吸附于茎的3种主要纤维分解菌的动态变化。选用羊草茎为试验材料,将其纵切6份后装入尼龙袋投入瘤胃中,分别在6,12,24,48和72 h取出,利用扫描电子显微镜观察超微结构变化;取粉碎后羊草茎进行尼龙袋试验,分别在0.5,2,6、12,24,48和72 h取出,测定不同时间点中性洗涤纤维(neutral detergent fiber,NDF)降解率和吸附在茎中3种主要纤维分解菌的数量变化。结果表明,薄壁组织和韧皮部可被瘤胃微生物降解,维管束会伴随薄壁组织的降解而发生脱落。羊草茎和食糜不同时间点纤维分解菌数量均为产琥珀酸丝状杆菌>白色瘤胃球菌>黄色瘤胃球菌,茎中产琥珀酸丝状杆菌和黄色瘤胃球菌数量在24 h达峰值,分别为10⁹和10⁵ copy/g羊草茎,白色瘤胃球菌在12 h达峰值,为10⁸ copy/g羊草茎。瘤胃食糜中3种纤维分解菌的数量在24 h内基本处在一个恒定的水平,而羊草茎NDF降解率在72 h内逐渐提高,羊草NDF降解率与瘤胃食糜中3种纤维分解菌数量不同步,这可能与纤维分解菌分泌的酶活力存在滞后有关。