实时荧光定量TaqMan-PCR检测鸭瘟病毒方法的建立

根据GenBank中鸭瘟病毒UL6和UL7基因的序列,设计了一对特异性引物及TaqMan探针,扩增位于UL6和UL7基因第891￣991位长度为101bp片段。以DPV标准强株DNA为模板,建立了实时荧光定量PCR检测鸭瘟病毒的方法。该方法只能在鸭瘟病毒DNA样本中检出荧光信号,最小检出量为1.57×102copies(23.7fg);线性范围达8个数量级;平行复管检测,组内变异系数为0.84%(n=20),同一组样本(n=6)间隔30d重复检测,结果无显著性差异;对试验感染鸭肝脏和脑组织中鸭瘟病毒的检出率为100%(40/40),对临床病例的检测结果与病毒分离鉴定结果一致;从核酸提取到报告检测结果仅需3h;对鸭正常组织、鸡传染性喉气管炎病毒、鸭病毒性肝炎病毒、鸡源大肠杆菌、鸭源多杀性巴氏杆菌、鸭副伤寒沙门氏菌等非鸭瘟病毒DNA检测,不出现非特异性荧光信号。     

猪瘟病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

为建立一种特异、灵敏、快速及量化的猪瘟病毒(CSFV)检测方法,设计扩增CSFV E2基因的特异性引物,建立Eva Green染料的RT-qPCR检测方法,对其特异性、灵敏性、重复性测试,并检测疑似猪瘟病毒感染的临床样品.结果显示,所建立的RT-qPCR检测方法标准曲线的线性相关系数R2=1.000,具有良好的线性关系...     

鸭瘟病毒SYBR Green I荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鸭瘟病毒（DPV）快速、敏感的检测方法,本研究利用PCR技术扩增出DPV UL30基因中510bp的保守序列,并克隆到p MD18-T载体中作为标准品制作标准曲线,建立了DPV的SYBR Green I荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏度可达5×101拷贝,与鸭细小病毒、鸭圆环病毒、小鹅瘟病毒、鸭肝炎病毒、鸭H9亚型流感病毒和鸭副粘病毒均不发生交叉反应,具有良好的特异性和重复性。结果表明,建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床DPV的检测。     

鸭圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

根据GenBank中鸭圆环病毒(DuCV)基因序列,在保守区设计了1对引物,建立了SYBER GreenⅠ荧光定量PCR检测鸭圆环病毒的方法。结果:该方法可检测到每个反应相当于1×102个拷贝的标准品DNA。与H9亚型禽流感、小鹅瘟、鸭瘟、鸭肝炎病毒等不发生交叉反应,且具有良好的重复性。表明建立的实时荧光定量PCR具有特异、敏感、快速、定量、重复性好等优点,可用于临床上DuCV感染的检测。     

小鹅瘟病毒SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR检测方法的建立

采用PCR方法扩增GPV VP1基因173 bp的基因片段,克隆到PMD18-T载体上,将纯化后的质粒做为模板,建立扩增反应的标准曲线,最终建立了小鹅瘟病毒(GPV)SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法。该方法检测灵敏性高,可检测2×101拷贝/μL的模板量;特异性好,与鹅副黏病毒、鹅流感病毒、鹅源鸭瘟病毒、大肠杆菌、沙门氏菌、曲霉菌均不发生交叉反应。建立的GPV荧光定量PCR具有特异性好、敏感度高、检测时间短、结果重复性好等优点,可用于小鹅瘟的临床诊断和流行病学调查。     

采用实时定量PCR技术评价三种药物体外抗鸭瘟病毒效果

采用实时定量PCR技术,对阿昔洛韦、利巴韦林及禽重组干扰素等三种药物体外抗鸭瘟病毒的作用进行了评价。结果显示,阿昔洛韦能有效抑制鸭瘟病毒在鸭胚成纤维细胞中的增殖。研究结果为抗鸭瘟病毒药物筛选提供了一种有效的技术平台,同时提示阿昔洛韦制剂有可能作为一种有效的抗鸭瘟病毒药物用于其感染的防治。     

鹅圆环病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立鹅圆环病毒(GoCV)快速检测方法,本研究根据GenBank中登录的GoCV全长基因组序列,在其保守基因区设计并合成1对引物,采用荧光嵌合法(SYBR GreenⅠ)建立检测GoCV的实时荧光定量PCR(real-time PCR)方法。以本实验室构建的含有GoCV永康株(GoCV-yk01)全长基因组的重组质粒为标准模板,经退火温度、循环次数等反应条件的优化,绘制GoCV real-time PCR的标准曲线,并进行融解曲线分析。试验结果表明:建立的GoCV real-time PCR方法特异性强,检测范围广(Ct值范围12～32),最低检出病毒拷贝数为1.46×102。该方法能够对组织中病毒进行定量检测,为快速检测GoCV提供了有效的技术手段。     

一种塞内卡病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种塞内卡病毒实时荧光定量PCR方法,研究针对塞内卡病毒3C基因保守区域设计了一对引物和探针,将3C基因克隆到pCR-4 TOPO载体中,以重组质粒为标准品,通过优化PCR反应条件,建立了一种检测SVA的实时荧光定量PCR方法。结果表明,该检测方法的敏感性达到2.5×10 copies/μL,灵敏度高于普通PCR;与其他相关病毒及细菌均不发生交叉反应,批内和批间试验重复性的变异系数(CV)均小于4%,具有良好的稳定性。研究建立的一种塞内卡病毒实时荧光定量PCR方法可以检测SVA的定性和定量,对SVA快速诊断检测具有重要意义。     

鸭甲肝病毒2型TaqMan实时荧光定量PCR方法的建立

研究利用全基因合成技术合成DHAV-2全基因组序列,并以此为标准品建立检测DHAV-2的TaqMan实时荧光定量PCR方法。结果表明:建立的方法敏感性高,最低检测限仅为33.7拷贝/μL;特异性强,对鸭甲肝病毒1型(DHAV-1)、鸭甲肝病毒3型(DHAV-3)、禽流感病毒(Avian influenza virus,AIV)、番鸭呼肠孤病毒(Muscovy duck reovirus,MDRV)、新型鸭呼肠孤病毒(Novel duck reovirus,N-DRV)、鸭源禽Ⅰ型副黏病毒(Duck-origin avian paramyxovirus type 1,APMV-1)和禽坦布苏病毒(Avian Tembusu virus,ATmV)均无交叉扩增;重复性佳,组内和组间变异系数最高分别为1.68%和2.19%。对2018年福建地区临床收集的128份鸭源病料进行检测,结果未检测DHAV-2感染阳性。研究结果为DHAV-2的快速检测试剂盒研究及储备DHAV-2检测技术奠定了基础。     

沙门菌实时荧光定量PCR检测试剂盒的研制与应用

根据沙门菌保守的fimY基因序列设计合成了引物和TaqMan探针，建立了快速检测沙门菌的实时荧光定量方法，并对反应条件进行了优化，组装成快速检测试剂盒。通过对临床样品的检测，该试剂盒的检测灵敏度达4.5CFU（25μL反应体系），比常规PCR高100倍，而且稳定性良好，至少可以冷冻保存9个月。结果表明，所建立的沙门菌实时荧光定量PCR检测试剂盒具有操作简便、快速、特异性强、灵敏度高、重复性好、稳定性强等优点，适于大量样品的检测。     

猪戊型肝炎病毒实时荧光定量PCR检测方法的建立及初步应用

根据GenBank中注册的AJ272108等序列,参考有关文献,利用引物设计相关软件在HEV ORF2片段的保守区设计并合成1对引物及探针,采用TaqMan探针建立了荧光定量PCR法。以鉴定正确的质粒为模板建立标准曲线,Ct值线性范围为14.89~27.02,相关系数为0.996。本试验建立的猪戊型肝炎病毒ORF2片段基因实时荧光定量PCR方法扩增效率高、线性范围广,为快速检测猪戊型肝炎病毒的绝对定量分析奠定了基础。     

Ⅰ型鸭肝炎病毒SYBR-Green实时荧光定量PCR检测方法的建立

为建立一种快速、特异的Ⅰ型鸭肝炎病毒（DHV-Ⅰ）SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法,根据GenBank已登录的DHV-Ⅰ型疫苗株C80（DQ864514.3）的非编码区基因序列设计1对特异性引物,经RT-PCR扩增出230bp的靶序列,并克隆到pMD18-T载体上,构建重组质粒;将纯化的重组质粒10倍梯度稀释后作为标准阳性模板,进行SYBR GreenⅠ荧光定量PCR扩增并建立标准曲线,对其敏感性、特异性和重复性进行评价。结果显示,建立的标准曲线的循环阈值与模板浓度呈现良好的线性关系（R2=0.998 2）,产物Tm值为87.2～87.9℃,检测灵敏度为71.5拷贝/μL。对55份疑似病料进行检测,荧光定量检测48份为阳性,而用常规PCR方法只能检出39份阳性,ELISA方法只检出30份阳性。这表明所建立的DHV-Ⅰ的SYBR GreenⅠ荧光定量PCR检测方法具有特异、灵敏、快速和重复性良好等优点,可用于临床DHV-Ⅰ感染的快速检测,为DHV的分子诊断、流行病学调查及定量分析奠定了基础。     

鸭呼肠孤病毒TaqMan与SYBR Green荧光定量检测方法的建立及比较

本研究旨在针对新型鸭呼肠孤病毒(NDRV)建立两种快速、敏感、特异的荧光定量PCR诊断方法并对其临床实用性进行比较。试验根据呼肠孤病毒S1基因序列设计合成1对特异性引物和1条MGB探针,分别建立TaqMan和SYBR GreenⅠ两种荧光定量PCR检测方法,并对两种方法的特异性、灵敏性、重复性进行比较。结果显示,两种检测方法标准曲线的相关系数均为0.999,对鸭细小病毒(DPV)、A型鸭甲肝病毒(DHV-1)、C型鸭甲肝病毒(DHV-3)、鸭传染性支气管炎(IBV)、鸭坦布苏病毒(DTMUV)、鹅星状病毒(JSHV)的检测结果均为阴性,特异性良好。SYBR GreenⅠ法的最低检测限度为10⁰拷贝/μL,TaqMan法的最低检测限度为10¹拷贝/μL,前者的灵敏度比后者高10倍。SYBR GreenⅠ法和TaqMan法重复性试验的组内和组间变异系数均分别小于2.1%和1.8%。利用这两种方法对临床30份疑似病料进行检测,其中TaqMan法检出29份,SYBR GreenⅠ法检出30份,符合率为97%。综上,两种荧光定量方法均可用于临床NDRV...     

复方中药“禽康散”对鸭瘟病毒感染鸭胚及成纤维细胞的保护效应

将不同浓度复方中药“禽康散”和鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)分别以不同方式接种到鸭胚尿囊膜后观察其对DPV感染的鸭胚保护率;用MTT法测定“禽康散”对鸭胚成纤维细胞(DEF)的安全质量浓度和增殖的影响,及安全质量浓度范围内的“禽康散”对DPV感染鸭胚成纤维细胞(DEF)能力的影响.结果显示,“禽康散”在10日龄鸭胚内对DPV具有显著的杀灭和阻断感染的作用.“禽康散”对DEF的最大安全质量浓度为2-4 g/mL,在2-4～2-8 g/mL质量浓度范围内对DEF有显著的增殖和抑制DPV感染DEF的能力,且与加药方式和药物质量浓度有一定关系.结果表明,一定质量浓度的“禽康散”对DEF具有增殖作用,并对DPV在鸭胚内和细胞水平上均有较好的杀灭和拮抗作用.     

二重PCR检测鸭瘟病毒和鹅细小病毒的初步研究

根据鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)DNA聚合酶基因和鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)NS基因序列分别设计2对引物,应用这2对引物对混合样品中鸭瘟病毒和鹅细小病毒进行了二重PCR扩增。PCR产物的琼脂糖凝胶电泳结果表明2条特异性带为563bp(DPV)和1146bp(GPV),与实验设计相符,且与常规单一PCR结果一致。二重PCR反应检测出的DPV含量相当于20个PFU;检测出的GPV含量相当于0.1个ELD50,对禽痘病毒和减蛋综合征病毒的核酸未能扩增出任何条带,特异性良好。该二重PCR能够在一次扩增反应中检测两种病毒,为两种鹅病的病原检测和诊断提供了一种简便、经济、快速的手段。     

禽(番鸭)呼肠孤病毒TaqMan探针荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

为了建立检测(番鸭)呼肠孤病毒(DRV)感染的方法,本研究根据DRV的σNS基因核苷酸序列设计引物及TaqMan探针,经过反应条件的优化,建立了该病毒的TaqMan探针实时荧光RT-PCR检测方法.用已知浓度的重组质粒为标准品,构建的标准曲线的相关系数达到99%.试验表明,该方法的重复性、稳定性、特异性良好,且灵敏度高,可以检测到1.0×10~2拷贝/μL的标准品,比普通PCR至少高100倍.该检测方法对DRV人工感染番鸭肝脏组织检出率达到100%.本实验所建立的TaqMan探针荧光RT-PCR为的快速检测以及进行分子流行病学的调查提供了新的技术手段.     

鸭瘟病毒、鹅细小病毒和番鸭细小病毒三重PCR检测方法的建立

为建立鉴别鸭瘟病毒(DPV)、鹅细小病毒(GPV)和番鸭细小病毒(MDPV)的多重PCR检测方法,参考文献合成针对DPVUL6基因、GPVNS基因和MDPVVP1基因序列的特异性引物。通过优化多重PCR反应中的引物浓度和退火温度,建立快速鉴别3种病毒的多重PCR方法,并对该方法的特异性、敏感性和重复性进行检验。结果显示,该方法对禽流感病毒、新城疫病毒、鸭肝炎病毒、鸭源巴氏杆菌、鸭疫里氏杆菌的核酸扩增结果均为阴性,表明特异性较强;DPV、GPV和MDPV的最低核酸检出量分别为237.3pg、22.45pg和204.6pg,表明敏感性良好;该方法对DPV+GPV+MDPV、DPV+GPV、DPV+MDPV、GPV+MDPV、DPV、GPV和MDPV的核酸均能扩增出与预期大小一致的目的条带,表明该多重PCR方法重复性较好。本研究方法具有特异性强、敏感性良好、重复性较好和快速简便等特点,可用于DPV、GPV和MDPV临床感染病例的联合检测与鉴别诊断。