甘蔗Ca~(2+)/H~+反向运转体基因的克隆与表达分析

CAX(Ca~(2+)/H~+antiporter)是植物细胞膜Ca~(2+)主动运输体系的一个大类。本研究以高粱的CAX1基因(GenBank登录号为XM_002441593)为探针,利用电子克隆并结合RT-PCR技术,获得甘蔗CAX1基因的1条cDNA序列,命名为Sc CAX1(GenBank登录号为KT799799)。生物信息学分析显示,ScCAX1基因全长784 bp,包含1个645 bp的开放阅读框,编码1个214个氨基酸的蛋白质。ScCAX1蛋白被定位于叶绿体类囊体膜,为稳定的疏水性蛋白,不存在信号肽。蛋白二级结构元件多为α-螺旋,具有1个Na_Ca_ex superfamily。实时荧光定量PCR分析表明,甘蔗ScCAX1基因的表达具有组织特异性,在各组织中均表达,但在茎中表达量最低,叶中的表达量最高。在PEG、NaCl、SA、ABA和Me JA胁迫过程中,ScCAX1基因的表达均受到调控。其中ABA、SA和PEG胁迫下表达量上调,均在胁迫24 h达到最大值。SA胁迫24 h的表达量为对照的5.47倍,而ABA胁迫24 h的表达量为对照的3.5倍。NaCl胁迫6 h的表达量达最大值,为对照的2.14倍。推测ScCAX1基因能够响应逆境胁迫,其表达可能与甘蔗的抗盐、抗渗透胁迫性状有关。     

水分胁迫下斑茅3个逆境代谢相关基因表达的实时PCR分析

【研究目的】初步探讨斑茅3个关键逆境适应相关基因在水分胁迫下的表达机制。【方法】已克隆S-腺苷蛋氨酸脱羧酶、鸟氨酸氨基转移酶、甜菜碱脱氢酶3个基因和内参基因的基础上,应用定量PCR技术,对这3个基因在不同胁迫时间下的表达水平进行分析。【结果】斑茅的S-腺苷蛋氨酸脱羧酶、鸟氨酸氨基转移酶基因、甜菜碱脱氢酶基因表达在初期均受抑制,后期表达持续上调,但甜菜碱脱氢酶基因受水分诱导表达较前两个基因明显。【结论】这可能暗示着在斑茅中,脯胺酸和甜菜碱的合成受水分胁迫诱导,而甜菜碱的合成相对脯胺酸和多胺受水分胁迫诱导影响更大。这些研究为斑茅抗旱的分子机制提供初步的理论基础。     

利用斑茅cDNA芯片研究甘蔗受黑穗病菌侵染后基因差异表达

为了解甘蔗抗黑穗病的分子机制,利用斑茅干旱胁迫cDNA芯片检测了甘蔗受黑穗病菌胁迫后的基因差异表达。经杂交,在cDNA芯片的3 860个模板中,有效差异表达(Ratio值≥2.0或≤0.5)的基因为101个,其中上调55个,下调46个。部分基因的定量PCR验证表明,芯片杂交结果可靠。上调表达基因经测序、冗余序列剔除,一共获得36个unique ESTs。已知功能的22个上调表达基因,涉及多条生理代谢途径,如光合作用、离子转运和核酸代谢途径;以及多种分子水平的进程,如基因转录、蛋白质合成与修饰以及细胞信号转导等。另外,还检测到14个未知功能基因。结果表明,甘蔗对黑穗病的抗性具有复杂的机制。本研究为解释甘蔗受黑穗病菌胁迫后的基因差异表达及其网络构建奠定了基础,还可以为今后系统研究甘蔗对生物与非生物胁迫的响应机制提供技术支持。     

小麦wzy2-1基因的克隆及功能分析

脱水素是一类植物胚胎发育后期丰富蛋白(late embryogenesis abundant protein, LEA蛋白),属于LEA D-11家族,植物受非生物胁迫会大量表达。利用同源克隆技术,从郑引1号小麦中克隆了1个Kn型脱水素基因,命名为wzy2-1。该基因全长1740bp,编码579个氨基酸,含有9个保守的K片段,与大麦的Dhn5基因具有较高同源性。生物信息学预测该蛋白属于高度亲水性的无序蛋白。通过该蛋白对大肠杆菌的保护作用研究表明,WZY2-1蛋白能够提高大肠杆菌对低温、高温、高盐以及高渗胁迫的耐受性。荧光实时定量PCR分析表明,wzy2-1基因受低温、盐渍、干旱诱导表达,但不受外源ABA诱导,说明wzy2-1基因属于非ABA依赖型脱水素基因。     

外源ABA对低温胁迫下玉米幼苗内源激素含量及Asr1基因表达的调节

脱落酸(ABA)是低温逆境下的重要信号因子,为了探讨外源ABA对低温胁迫下玉米幼苗的生长调节作用,以耐低温玉米品种久龙5号为试验材料,采用不同浓度(5、15、25、35 mg L–1)ABA于玉米三叶一心时喷雾于叶片,并进行低温梯次处理。分析处理后玉米叶片相对电导率、抗氧化酶活性及内源激素ABA、IAA的含量变化,并采用Real-time PCR明确Asr1基因表达水平变化。结果表明,低温胁迫下不同浓度外源ABA处理的玉米叶片相对电导率整体呈上升趋势,SOD和POD活性加强,15 mg L–1和25 mg L–1ABA处理的SOD活性均显著高于未应用ABA处理,玉米內源ABA和IAA合成水平上升,应用ABA后Asr1基因相对表达水平上调,其中5、15和25 mg L–1浓度处理基因表达上调显著。相关分析表明,ABA含量与Asrl基因相对表达量、SOD活性均表现为极显著正相关,与POD活性显著正相关。说明Asr1基因表达受ABA的介导调控,Asr1基因表达量的提升,也促进了内源ABA的合成,抗氧化酶活性加强,提升了应用ABA后玉米的抗低温能力。但外源ABA的介导调控具有一定浓度效应,表现为低促高抑。     

空气凤梨Tillandsia bergeri花芽分化时期叶片内源激素含量的变化

以Tillandsia bergeri为试材,研究T. bergeri在花芽分化过程中体内激素及其平衡的动态变化过程。用植物生长调节剂乙烯利进行整株喷洒处理,以喷施清水为对照。测定叶片内ZRs、GAs、IAA和ABA的含量。结果表明：外源乙烯利对植株有明显的催花作用,且乙烯利处理后出花整齐,外源乙烯利处理初期使IAA和GAs含量下降,在花器官发育时,GAs含量上升。在花芽诱导时期,ABA和ZRs含量升高;在花器官发育时期,ABA和ZRs激素含量恢复到正常水平。低水平的IAA及GAs含量促进T. bergeri花芽的诱导,而相对高的IAA及GAs含量有利于花形态的形成。较高水平的IAA/GAs、ABA/GAs、ZRs/GAs和低水平IAA/ZRs有利于T. bergeri的花芽诱导和萌动;激素平衡在T. bergeri花芽诱导期起到了关键作用。     

斑茅cDNA中抗病基因同源序列的分离和表达特性分析

植物抗病基因具有一些特定的保守结构域。本研究根据已知植物同源抗病基因(RGAs)保守序列设计简并引物, 从甘蔗近缘植物斑茅的cDNA中扩增出6条抗病基因同源序列, 它们在NCBI上登录号分别为EU685835、EU685836、EU685837、EU685838、EU685839 和 EU685840。序列分析表明, 这些RGAs均含有典型的NBS-LRR类抗病基因保守结构域P-loop、Kinase-2a、Kinase-3a和疏水结构域(Hydrophobic domain, HD)。氨基酸序列的同源性比对表明,6条RGAs序列同11条参试的抗病基因之间的同源性为8.3%~93%,而6条RGAs之间的氨基酸序列同源为30.5%~45.6%。另外,本实验所克隆的6条斑茅抗病基因同源序列中, kinase-2 (LLVLDDVW/D)最后一个氨基酸皆为色氨酸,推测所克隆的NBS-LRR类抗病基因都属于non-TIR-NBS-LRR类。定量PCR分析表明, 6条斑茅抗病基因同源序列在根、茎和叶片中组成型表达,同时这些抗病基因同源序列的表达会受外源信号分子水杨酸和过氧化氢的上调作用,可能在斑茅的抗病性中具有一定的作用。     

花生种子休眠解除过程中相关基因的表达分析

种子休眠性是花生重要的农艺性状,外源乙烯利能诱导花生种子休眠的解除,为了阐明乙烯利作用下花生种子休眠解除的分子机制,设置吸胀的休眠种子为对照,100 mg L–1乙烯利处理吸胀休眠种子后不同时间的样品(AE1、AE2、AE3)进行转录组分析,比较了花生种子休眠解除过程中ABA、GA、ETH、auxin相关基因的表达。结果表明,15个与GA、40个与ABA、60个与ETH、56个与auxin相关的unigenes在花生种子休眠解除过程中表现显著差异表达。荧光定量PCR结果显示,ABA合成关键基因Ah NCED2和代谢关键基因Ah CYP707A1在种子休眠解除过程中均受外源乙烯利诱导,表达差异显著;在休眠和无休眠种子吸胀萌发过程中,Ah NCED2和Ah CYP707A1的表达趋势不同,Ah NCED2对于种子休眠的维持发挥积极作用,而Ah CYP707A1对于种子休眠解除发挥积极作用。     

非生物胁迫下海马齿SpSOS1基因的表达及响应ABA模式分析

为分析盐生植物海马齿(Sesuvium portulacastrum L.) SpSOS1基因的表达模式,本研究利用实时荧光定量PCR技术分析SpSOS1在海马齿不同组织以及不同胁迫条件下的表达情况。空间表达模式分析表明,SpSOS1在海马齿根中表达量最高,在花中的表达量最低。不同胁迫条件下SpSOS1基因的表达分析表明,在干旱、高温(42℃)、低温(4℃)以及氧化胁迫下表达量无明显变化;在ABA处理后,SpSOS1基因呈现上调表达,且在6 h表达量达到峰值,与盐胁迫处理下的表达趋势基本一致。为进一步探究盐胁迫下SpSOS1的上调表达是否受ABA的诱导,使用钨酸钠和氟啶酮作为ABA生物合成抑制剂和清除剂处理海马齿,结果表明,用钨酸钠和氟啶酮处理后,盐胁迫下SpSOS1的表达增加量从9.8倍分别降为起始表达量的1.8和2.1倍,表明盐胁迫下SpSOS1的上调受ABA信号途径诱导。本研究为进一步探究SpSOS1的耐盐调控途径提供参考依据。     

大豆KTI1基因表达方式分析及其启动子预测

为明确大豆胰蛋白酶抑制剂基因(KTI1)在不同逆境、ABA条件下及大豆不同组织中的表达方式,本研究采用实时荧光定量PCR技术检测,结果表明KTI1基因受低温、盐、干旱和ABA诱导,分别在处理10、5、24和1 h时获得诱导最高值,相对表达量分别是未处理的288.65,274.35,136.04和56.48倍;KTI1基因在大豆种子中的表达量相对较高,叶中的表达量为1时,种子中的表达量为8.70。根据大豆基因组序列,扩增KTI1基因ATG上游启动子序列1 831 bp;生物信息学预测分析表明启动子中存在多种常出现在逆境胁迫诱导型启动子中的顺式调控元件,推测大豆KTI1基因启动子可能是受低温、盐、干旱和ABA诱导的诱导型启动子。本研究为进一步研究和应用大豆KTI1基因及其启动子提供理论基础。     

用基因组原位杂交方法分析甘蔗-斑茅杂种及回交后代的染色体组成

斑茅(Erianthus arundinaceus Retz)是甘蔗的近缘属植物,具有多种优良特性,是甘蔗育种的重要种质资源之一。本实验使用基因组原位杂交(GISH)技术分析了甘蔗-斑茅杂种及回交后代F1、BC1和BC2的染色体构成与传递行为。结果表明:在F1代,来自斑茅HN92-77的染色体数目介于28～30条,来自热带种Badila的染色体数目介于38～40条,体细胞染色体数为2n=68～70,基本符合n+n的染色体传递方式;在BC1和BC2代,来自斑茅的染色体数分别为22～28条和13～15条,来自甘蔗的染色体数分别是87～94条和98～101条,其体细胞染色体数2n分别为110～121条和112～115条,基本上分别符合2n+n和n+n的染色体传递方式。在所观察的渐渗系中,均存在有染色体丢失的现象,但未观察到染色体发生交换与重组。     

Characterisation of Erianthus sect. Ripidium and Saccharum germplasm (Andropogoneae - Saccharinae) using RFLP markers

A collection of 65 Erianthus Michx. sect. Ripidium Henrard accessions (representing seven accepted species) and 14 Saccharum L. representatives (S. officinarum L. and S. spontaneum L.) were studied by RFLP analysis using 14 dispersed nuclear single-copy probes from maize. An intergeneric distance (1–F) of 0.748 was revealed between Erianthus and Saccharum. Within the Erianthus collection, the greatest distances were found between E. elephantinus Hook f. or E. ravennae (L.) P. Beauv. (the two 2n=20 species), and the rest of the Erianthus collection. The smallest distances were found amongst the E. arundinaceus (Retz.) Jeswiet clones collected in Indonesia ((1–F)=0.005). In addition, a partition based on the geographical origin and consistent with the chromosome numbers, ie E. arundinaceus from Indonesia versus E. arundinaceus and E. procerus from India, was revealed. E. bengalense was intermediate. The study of the Saccharum individuals confirmed the greater variability of S. spontaneum compared to the so called noble cane, S. officinarum. The 2n=80 S. spontaneum genotypes were shown to be closely related to S. officinarum. The implication of these results on the involvement of S. spontaneum and Erianthus sect. Ripidium in the origin of S. officinarum is discussed. This revised version was published online in July 2006 with corrections to the Cover Date.     

河北杨脱水素基因(Phdhn1)的克隆与胁迫表达分析

为了鉴定河北杨中的脱水素基因并研究其在逆境胁迫中的表达规律,以初步分析脱水素基因在河北杨逆境胁迫中的调控功能,在实验室前期工作的基础上设计引物,通过PCR方法扩增河北杨cDNA文库获取脱水素基因,并通过半定量RT-PCR方法研究其在逆境中的表达情况。结果表明,河北杨脱水素全长基因856 bp,共编码227个氨基酸。同源性分析表明,河北杨中的脱水素基因与已知的其他杨树脱水素高度同源,因此将该基因定名为Phdhn1。半定量RT-PCR结果表明在干旱、低温、高温、高盐及ABA溶液不同时间段(0、0.5、1、2、5、10、24 h)的胁迫下,河北杨Phdhn1在干旱、ABA以及低温胁迫下均出现表达差异。该研究初步阐述了Phdhn1的逆境表达模式,说明了Phdhn1在河北杨逆境胁迫中起到的重要作用。     

转录因子ABP9基因过表达对植物生长发育的影响分析

【研究目的】为分析玉米ABA/逆境响应转录因子ABP9基因过量表达对植物生长发育的影响以利用该基因开展抗逆分子育种。【方法】本研究构建了35S启动子驱动ABP9组成型表达的植物表达载体，获得了过表达ABP9基因的拟南芥转基因株系，并在正常生长条件下，比较了转基因植株和野生型在种子萌发、营养生长和生殖生长阶段的形态和生理变化，分析了可能的分子机制。【结果】结果表明，正常生长条件下，转基因植株与野生型相比表现出萌发，幼苗生长以及开花阶段的生长抑制；气孔开度减小，叶片内源ABA含量降低；ABA信号传导基因表达增强，而ABA合成基因表达降低；而且这些效应在ABP9基因表达相对较强的转基因株系中表现更明显。【结论】说明ABP9基因过量在正常生长条件下即诱导转基因植株产生耐逆反应，抑制植株的生长发育。因此，在利用ABP9基因进行转基因抗逆育种时须考虑控制ABP9基因适时适量表达。     

陆地棉GhERF8基因的克隆与表达分析

 乙烯响应元件结合因子（Ethylene-responsive element-binding factor,ERF）是植物中最大的转录因子家族之一。本研究以棉花叶片cDNA文库为基础,从陆地棉中棉所10号中克隆得到一个新的ERF基因,命名为GhERF8（GenBank：JN656957）。该基因编码265个氨基酸,蛋白序列中包含一个AP2保守结构域。采用荧光定量PCR（RT-PCR）的方法,对GhERF8基因在棉株不同生育时期叶片和不同组织中的表达水平进行了定量分析。结果表明,GhERF8基因在各组织中均有表达,但在成熟后期的叶片中表达量最高。GhERF8表达量与叶片衰老过程中叶绿素含量出现相反的变化趋势,推测GhERF8可能与叶片衰老有一定关系。在乙烯利和茉莉酸处理下GhERF8基因在叶片中上调表达,而在脱落酸处理下GhERF8表达量无显著变化,推测GhERF8可能处于乙烯和茉莉酸信号转导网络中,且表达途径为非ABA依赖途径。     

白菜型油菜WRKY基因片段的克隆与表达分析

WRKY转录因子能广泛地参与植物的生物与非生物胁迫反应。为了研究WRKY转录因子在ABA诱导下的表达调控,首先利用同源克隆法在白菜型油菜中克隆WRKY基因和Actin基因片段, 用BLAST和DNAMAN软件对核酸及氨基酸序列进行分析;通过荧光定量PCR技术检测白菜型油菜WRKY基因在ABA处理条件下的相对表达趋势;然后利用相对定量PCR技术（real-time relative quantification PCR,以下简称RT-qPCR）检测WRKY基因在ABA(100 μM)诱导不同时段的差异表达。在白菜型油菜中克隆到一段中克隆到一段长度为680 bp的WRKY基因片段和一段长度为933 bp的β-actin基因片段。RT-qPCR实验结果表明,BcWRKY能被ABA诱导表达,且在诱导1 h后表达量最高。本实验文成功地克隆了白菜型油菜的WRKY转录因子基因和Actin基因片段,并证明了白菜型油菜WRKY基因的表达受ABA的影响。     

谷子转录因子基因SiNAC45在拟南芥中对低钾及ABA的响应

NAC(nascent polypeptide-associated complex)转录因子在植物生长发育和非生物胁迫响应等过程中发挥重要的调控作用,目前,关于NAC转录因子参与耐低钾胁迫的研究报道很少。本研究在前期工作对低钾胁迫的转录组测序基础上,对筛选出的一个低钾胁迫下表达量上调的NAC类转录因子基因SiNAC45进行了深入研究。结果表明,SiNAC45基因全长1383 bp,编码461个氨基酸,分子量为50.7 k D,等电点为6.92。SiNAC45在20~100个氨基酸之间有一段NAM保守结构域。系统进化树结果显示,SiNAC45位于NAC基因家族的第1亚族。基因表达谱分析显示,SiNAC45主要在谷子根部表达,并且能够被低钾和ABA诱导表达。亚细胞定位结果显示SiNAC45定位于细胞核。基因功能分析结果显示,在不同浓度低钾处理下,和野生型拟南芥相比,SiNAC45转基因拟南芥的根长和植株鲜重显著增加,说明过表达SiNAC45可以提高转基因植物对低钾胁迫的抗性。下游基因表达分析结果显示,在SiNAC45转基因植物中两种重要的钾离子转运体基因AKT1和HAK1的表达显著提高,证明SiNAC45通过调控植物钾离子转运体基因的表达影响植物对低钾胁迫的耐性。种子萌发试验结果显示,SiNAC45转基因拟南芥与野生型拟南芥相比对ABA的敏感性降低,说明SiNAC45可能负调ABA信号。     

芒果MiCO基因逆境胁迫下表达模式分析及转基因株系的获得

CONSTANS(CO)基因是调控植物开花光周期途径的关键基因,近来有研究发现其与植物的逆境胁迫也有关。目前CO参与植物逆境胁迫的作用尚不清楚。为了探究CO在芒果逆境胁迫中的功能,我们利用实时荧光定量技术对MiCO基因在芒果2℃低温胁迫、盐胁迫和PEG-6000模拟干旱胁迫后0 h、6 h、12 h、24 h、48 h和72 h的表达模式进行分析。结果显示,这三种逆境处理均诱导芒果MiCO基因的表达,其中盐胁迫处理条件下MiCO基因的表达水平上调,2℃低温和PEG胁迫条件下MiCO基因的表达水平下调。说明该基因参与了芒果逆境胁迫的调控。为了验证MiCO基因在芒果逆境胁迫中的功能,本研究构建了MiCO超量表达载体,将MiCO基因转化到拟南芥中,获得阳性植株,经过三代筛选得到了纯合株系,为进一步验证MiCO基因在逆境胁迫中的作用提供实验材料。