应用荧光定量RT-PCR检测H5亚型禽流感病毒

为了解青岛市饲养的家禽是否感染H5亚型禽流感病毒,以制定切合实际的防控措施,2005年1月～2006年9月,对139个养禽场和211个养禽户饲养的家禽采集棉拭子和组织样品,共采集活禽样品27 835份,病死禽样品573份,应用荧光定量RT-PCR技术,进行H5亚型禽流感病毒检测,结果全部为阴性,在分子水平上证明了青岛市无禽流感病毒感染.     

荧光定量RT-PCR检测H5亚型禽流感病毒方法的建立与验证

根据H5亚型禽流感病毒HA基因上的保守序列,设计合成引物,以H5亚型禽流感病毒HA基因重组质粒为标准品绘制标准曲线,建立了荧光定量逆转录聚合酶链反应检测方法。结果表明,本试验建立的标准曲线循环阈值(Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.995,灵敏度约为8拷贝/μL,相当于8个AIV颗粒,对新城疫病毒和其他禽病病毒无交叉反应,特异性好、重复性佳,为H5亚型禽流感病毒检测提供了一种特异、敏感、快速、低成本、高通量、生物安全性好的定量检测方法。对178份临床泄殖腔棉拭子样品的检测,该方法结果与经典病毒分离方法符合率大于90.0%,在禽流感病毒临床样品快速筛检、流行病学监测等方面显示了良好的应用前景。     

H5、H9亚型禽流感分子鉴别诊断方法的建立

为了快速、敏感、特异地鉴别诊断禽流感,根据H5、H9亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计出并合成2对特异性引物,利用这2对引物对H5、H9亚型禽流感病毒的HA基因片段进行二联RT-PCR扩增,并对二联RT-PCR检测方法进行敏感性及特异性试验。结果表明:这2对引物能特异性地扩增出H5、H9亚型禽流感病毒HA基因片段,大小分别为490bp和686bp;该检测方法敏感性高,特异性强;初步建立了快速、敏感、特异地鉴别检测H5、H9亚型禽流感病毒的分子诊断方法。     

不同H5亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR试剂盒的比较

H5亚型禽流感病毒严重威胁家禽产业的发展和人类健康,实时荧光定量PCR是快速准确诊断该病毒的有效方法之一。比较和分析了国内4种H5亚型禽流感病毒实时荧光定量PCR试剂盒的灵敏度、重复性和特异性,结果表明,不同厂家的试剂盒总体检测效果都不错,但是不同厂家的试剂盒在灵敏度等方面存在一定差异。     

禽流感病毒H5、H7、H9亚型多重荧光RT-PCR检测方法的建立

为了简便、快速、准确的检测禽流感病毒(avian influenza virus,AIV)H5、H7、H9亚型(lumpy skin disease virus,LSDV),本研究通过对禽流感病毒HA2基因保守区域的分析,设计、合成特异性引物和探针,结合Taq man-MGB探针技术,建立禽流感病毒H5、H7、H9亚型...     

H5、H9亚型禽流感病毒快速鉴别诊断方法的建立

为了快速、敏感、特异地鉴别诊断我国目前流行的禽流感，根据H5、H9亚型禽流感病毒HA基因序列的保守区域设计并合成2对特异性引物，利用这2对引物对H5、H9亚型禽流感病毒的HA基因片段进行二联RT—PCR扩增，并对二联RT—PCR检测方法进行了敏感性及特异性试验。结果表明，这2对引物能特异地扩增H5、H9亚型禽流感病毒HA基因片段，大小分别为490bp和686bp；该检测方法敏感性高，特异性强；初步建立起快速、敏感、特异地鉴别检测H5、H9亚型禽流感病毒的分子诊断方法。     

H9亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

根据H9亚型禽流感病毒HA基因上的保守序列,设计合成引物,以阳性H9亚型禽流感病毒HA基因重组质粒为标准品做标准曲线,建立了荧光定量逆转录聚合酶链反应检测方法。结果表明:本试验建立的标准曲线循环阈值(Ct值)与模板浓度具有良好的线性关系,相关系数为0.997,灵敏度约为6拷贝/μL,对新城疫病毒和其他禽病病毒无交叉反应,特异性好,重复性佳,对193份临床泄殖腔棉拭样品的检测,其结果与经典病毒分离方法符合率大于90.0%。该方法为H9亚型禽流感病毒检测提供了一种特异、敏感、快速、较便宜、高通量、生物安全性好的定量检测手段,将在禽流感病毒临床样品快速筛检、流行病学监测等方面显示良好的应用前景。     

一株鹅源H5N1亚型禽流感病毒人工感染鸡的病理学研究

鸡肌肉接种鹅源禽流感病毒A/goose/Guangdong/2/1996(H5N1)后,引起约70%发病率和60%死亡率,并表现出一些显微和超微病理学变化,主要为全身性充血、淤血、出血和血栓形成,多种器官的细胞变性、坏死、炎症,以及胰腺、肾脏、肝脏、心脏、肺脏、脑、肠、胸腺、脾脏、法氏囊等的细胞凋亡。     

H6亚型禽流感病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

本研究旨在建立一种快速、特异、敏感的H6亚型禽流感病毒(AIV)实时荧光定量RT-PCR检测方法。针对H6亚型AIV的血凝素(HA)基因序列保守区设计1对引物,并优化反应条件。结果表明,该方法的最低检测限为1.07×101拷贝质粒DNA,与常规PCR相比,灵敏度高出1 000倍;扩增产物的熔解曲线分析只出现1个单特异峰,无引物二聚体,Tm值为(80.81±0.08)℃,组内变异系数为0.08%～0.99%,组间变异系数为1.85%,可重复性好;对H1、H3、H5、H7、H9亚型禽流感病毒及新城疫病毒等其他呼吸道病原体无扩增;检测快速,从样本处理到报告结果仅需3.5 h。     

禽流感病毒H5、H9亚型的多重RT-PCR鉴别诊断

根据禽流感病毒H5、H9亚型的HA基因序列,设计了两对RT-PCR引物,同时对H5、H9亚型进行了多重RT-PCR扩增,得到了两条清晰的目的带.将目的带回收并进行测序,同源性比较结果证明其为禽流感H5、H9亚型的HA基因序列,作者对多重RT-PCR进行反应条件优化以及敏感性与特异性测定,证明该方法的敏感性和特异性都比较好.初步应用于30份临床病料,其检测结果与病毒的分离培养一致,比电镜和琼扩的检出率高,与其他NDV、IBV的病料无交叉反应,可用于禽流感病毒H5、H9亚型的鉴别诊断.     

广东省禽流感原疫点及周围地区H5亚型禽流感监测报告

从广东省8个曾发生禽流感疫情的原疫点及周围地区,在强制免疫后21～28天采集家禽血清和咽喉、泄殖腔及环境样品拭子,进行H5亚型禽流感血清学监测和病原学调查。结果表明:发生禽流感疫情的地区,在进行紧急免疫接种后21～28天,受威胁区大部分禽只产生H5亚型禽流感保护性抗体,在环境样品拭子和家禽拭子中未监测到H5亚型禽流感病毒。     

新型H5亚型禽流感疫苗研制成功

在农业部和科技部共同主持及国家“973”、“863”和“攻关”项目资助下,通过30多位科研人员不懈的努力,具有国际先进水平的高效、安全新型H5N1亚型禽流感灭活疫苗和重组禽痘病毒活载体疫苗研制成功。新型H5亚型禽流感灭活疫苗系由高度致弱的H5N1亚型疫苗种子株制备,该疫苗种     

土杂鸡H9亚型禽流感和传染性喉气管炎混合感染的诊断

为了诊断昆明市某土杂鸡(阉鸡)养殖场疫病类型,采集病鸡喉气管、肺脏、脾脏等组织样品,混合研磨后提取病原核酸,通过RT-PCR对新城疫、禽流感、H5亚型禽流感、H9亚型禽流感、传染性支气管炎、传染性喉气管炎等家禽呼吸系统疫病病原核酸进行检测。检测结果为禽流感、H9亚型禽流感和鸡传染性喉气管炎病原核酸阳性,诊断该病例为H9亚型禽流感和传染性喉气管炎混合感染所致。     

H5、H7和H9亚型禽流感病毒四重荧光RT-PCR检测方法的建立与应用

旨在提高对禽流感病毒（avian influenza virus,AIV）检测效率,及时发现疫病。本研究通过分析M基因以及H5、H7和H9亚型的HA基因序列保守区域,设计并合成了相关探针和引物,建立了禽流感病毒（AIV）四重荧光RT-PCR检测方法,该方法可在检测禽流感病毒（AIV）的同时,确定病原是否为H5、H7和H9亚型。结果显示,该检测方法耗时短、特异性好、检测下限达到10^-5 ng·μL^-1。采用该方法检测临床采集的13个活禽交易市场的384份禽咽喉和泄殖腔双拭子样品,经检测,其中有60份样品为流感病毒阳性,且全部是H9亚型,该结果与行业标准方法（NY/T 772—2013）检测结果一致,κ值为1（P<0.001）。本方法能实现对禽流感病毒及H5、H7和H9亚型的高通量快速检测,将在AIV快速检测中发挥重要作用。     

禽流感病毒H5、H7和H9亚型一步法多重RT-PCR检测方法的建立

为了建立能同时检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒(AIV)的方法,参考GenBank中H5、H7和H9亚型AIV的HA基因序列的保守区域,利用Primer 5.0软件设计3对分别针对AIV H5、H7和H9亚型的特异性引物,预期特异扩增H5AIV片段大小为380bp、H7AIV为501bp、H9AIV为732bp。经过反应条件的优化,建立了同时检测H5、H7和H9亚型AIV的一步法多重RT-PCR方法。该方法特异性强,对其他亚型AIV和禽呼吸道病原体检测结果为阴性;敏感性高,H5、H7和H9亚型AIV RNA的最低检出量分别为10-4、10-4、10-2拷贝/μL。初步建立了快速、敏感、特异地鉴别检测H5、H7和H9亚型禽流感病毒的分子生物学诊断方法。     

TaqMan实时荧光RT-PCR快速检测H5亚型禽流感病毒

根据GenBank中100个H5亚型禽流感病毒分离株的HA基因核苷酸保守序列设计引物和TaqMan探针,对荧光定量RT-PCR反应体系和条件进行优化,并对该方法进行评价.结果表明:该方法对H5N1亚型和H5N2亚型禽流感病毒灭活抗原均有阳性扩增,对H7、H9亚型禽流感病毒、健康鸡、鸭组织及其他家禽常见病原RNA无扩增;敏感度高,最低检测限为21个拷贝质粒DNA;可重复性好,批内变异系数及批间变异系数分别为2.01%和4.93%;检测速度快,从样本处理到报告结果仅需4 h.     

SYBR Green I荧光RT-PCR法检测H5亚型禽流感病毒

用2株不同致病力的H5亚型禽流感病毒(AIV)感染Madin-Darby canine kidney(MDCK)细胞,收集感染后6,12,24,48,72 h的病毒,提取总RNA,利用Rotor Gene RG3 000实时定量PCR仪对H5亚型AIV的HA基因进行检测,试图建立快速检测H5亚型AIV的real-time RT-PCR方法,并用所建立的方法对来自全国各地的疑似H5亚型AIV的病料和咽喉拭子、泄殖腔拭子346份进行检测。结果表明：农业部动物流感重点开放实验室建立的HA基因的teal-time RT-PCR方法可以检测到细胞培养物中和临床样品中是否含有H5亚型AIV,与常规RT-PCR比较,该方法更加特异、准确、快速。     

TaqMan实时荧光RT-PCR快速检测H5亚型禽流感病毒

根据GenBank中100个H5亚型禽流感病毒分离株的HA基因核苷酸保守序列设计引物和TaqMan探针,对荧光定量RT-PCR反应体系和条件进行优化,并对该方法进行评价.结果表明:该方法对H5N1亚型和H5N2亚型禽流感病毒灭活抗原均有阳性扩增,对H7、H9亚型禽流感病毒、健康鸡、鸭组织及其他家禽常见病原RNA无扩增;敏感度高,最低检测限为21个拷贝质粒DNA;可重复性好,批内变异系数及批间变异系数分别为2.01%和4.93%;检测速度快,从样本处理到报告结果仅需4 h.     

H7亚型禽流感RT-PCR诊断方法的建立

参照GenBank中已发表的H7亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因设计合成了一对预计扩增片段大小约为310bp的引物。利用这对引物,通过对RT-PCR反应体系和反应条件的优化,建立了针对H7亚型禽流感的RT-PCR检测方法。敏感性试验和特异性试验结果表明,该方法敏感性高,最低可检出100pg的AIV-H7的mRNA,且应用该引物对新城疫病毒(NDV)、传染性支气管炎病毒(IBV)及其他亚型的流感病毒(H1、H3、H5、H9)在相同反应条件下未扩增出任何片段,具有较好的特异性。用所建立RT-PCR方法检测发病鸡组织病料及咽、肛拭子,检测结果与鸡胚病毒分离结果相比,阳性符合率高达90.6%。     

揭阳市H5亚型禽流感免疫抗体监测分析

揭阳市曾在2004年2月发生过H5N1高致病性禽流感疫情.通过彻底有效的扑杀、无害化处理、全面强制免疫等综合性防控措施,疫情得到彻底扑灭.H5亚型禽流感抗体监测结果表明:注射H5亚型油乳剂灭活苗能获得有效的免疫抗体,但许多技术操作因素和环境卫生因素可影响抗体水平.