家蚕幼虫各发育时期酚氧化酶原基因的转录活性分析

[目的]为进一步了解家蚕酚氧化酶原基因的功能奠定基础。[方法]根据GenBank上登录的家蚕酚氧化酶原基因(PPO1和PPO2)的cDNA序列设计2对特异引物,通过半定量RT-PCR技术检测家蚕幼虫各发育时期(蚁蚕到5龄起蚕)酚氧化酶原基因的转录活性。[结果]PPO1和PPO2基因在家蚕幼虫各发育时期的转录活性存在较大差异。PPO1基因在2龄眠蚕、4龄眠中的表达量最高,其次是2龄起蚕、3龄眠蚕3、龄起蚕和1龄眠蚕,在3龄眠中、4龄起蚕的表达量较低,在4龄眠蚕有弱表达,在其他发育时期几乎无表达。PPO2基因除了在蚁蚕1、龄眠中、2龄眠蚕无表达外,在其他时期的表达量均较高。[结论]酚氧化酶原基因在家蚕幼虫各发育时期的转录表达均具有明显的时空特异性。     

野桑蚕酚氧化酶原基因PPO1的克隆及其特征(英文)

利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)克隆野桑蚕(Bombyx mandarina)酚氧化酶原基因PPO1,获得其cDNA序列;该序列长2 086bp,含有一个2 058bp的完整开放阅读框,编码一个由685个氨基酸残基组成的蛋白质;该基因推导的氨基酸序列与其他鳞翅目昆虫PPO1基因相应的氨基酸序列有较高的同源性,该序列具有它们的PPO基因所共有的典型特征。RT-PCR检测分析表明该基因仅在野桑蚕的头部和血液中表达,而Northern杂交检测表明该基因仅在血液中有表达。这些结果为进一步研究该基因的功能提供了分子基础。     

小金蝠蛾酚氧化酶原基因的克隆及表达分析

通过逆转录PCR技术克隆获得小金蝠蛾(Thitarodes xiaojinensis)幼虫酚氧化酶原(TxPPO)基因cDNA的部分序列,对其进行生物信息学分析及组织表达谱分析。克隆该基因cDNA所得的部分序列长度为2654 bp,其CDS全长为2 070 bp,编码的蛋白质由689个氨基酸残基组成,预测分子质量为79.31 ku、等电点为5.91,无信号肽。进一步对TxPPO氨基酸序列分析及系统发育树构建,发现该基因与其他鳞翅目昆虫酚氧化酶原-2(PPO2)聚为一支,同源性较高,相似度为62.45%～63.61%。此外,TxPPO含有与其他鳞翅目昆虫PPO相似的丝氨酸蛋白酶酶切位点、thiolester-like位点、3个保守的血蓝蛋白结构域、2个高度保守的铜离子结合位点及位于铜离子结合位点内的6个保守的组氨酸残基。通过实时荧光定量PCR及Western blot方法对PPO基因在小金蝠蛾幼虫各组织中的表达情况进行检测,RT-qPCR结果显示,该基因在小金蝠蛾幼虫的血细胞中转录水平最高,其次为头部、脂肪体、表皮、中肠组织;Western blot检测结果表明,该蛋白分布于小金蝠蛾幼虫的血浆、头部、表皮组织及中肠组织中,而未在脂肪体检测到其分布。     

克氏原螯虾酚氧化酶原mRNA组织分布特性研究

酚氧化酶原系统是甲壳动物体内与免疫相关的重要功能系统之一,对于甲壳动物的防御反应具有重要作用。本研究针对克氏原螯虾酚氧化酶原基因保守序列设计引物,利用实时荧光定量PCR法对克氏原螯虾酚氧化酶原mRNA的组织分布进行了初步研究。结果表明,克氏原螯虾酚氧化酶原基因在血淋巴、肝胰腺、卵巢和精巢中转录水平较高;在肌肉、表皮和鳃中有较弱表达;而在肠和胃中几乎无表达。此种组织表达特性可能与酚氧化酶原基因在机体生命活动过程中的功能有关。     

“桑蚕乳酸脱氢酶基因的克隆与表达分析

为了研究野桑蚕乳酸脱氢酶基因的功能,选择野桑蚕5龄3日幼虫的组织及不同发育时期的个体,利用 PCR 技术对野桑蚕乳酸脱氢酶基因进行克隆,得到野桑蚕乳酸脱氢酶基因开放阅读框长度为996 bp,没有内含子,只有1个外显子。该基因编码的蛋白含有331个氨基酸残基,等电点为6·76,分子量为36·35 kD。氨基酸序列分析表明,该蛋白高度保守,亚细胞定位预测分析表明该蛋白主要定位于细胞质中。转录表达分析表明,该基因在野桑蚕5龄3日幼虫的组织（马氏管、中肠、表皮、脂肪体、丝腺、血液、精巢和卵巢）及不同发育时期的个体（卵、幼虫、蛹和蛾）中均有表达,且表达量趋于一致。表明乳酸脱氢酶基因在野桑蚕的生命活动中可能具有重要的生理功能。     

白背飞虱酚氧化酶原PPO基因特性及其免疫应答

【目的】酚氧化酶(phenoloxidase,PO)是昆虫体内的免疫蛋白,在昆虫体内起重要的调节作用,主要以无活性的酚氧化酶原(prophenoloxidase,PPO)形式存在。本研究在转录组测序获得白背飞虱(Sogatella furcifera)3条PPO序列的基础上,通过分析白背飞虱体内不同SfPPO的发育和组织表达模式,并进一步抑制SfPPO的表达以及病原菌诱导,探讨SfPPO在白背飞虱体内的生物学功能。【方法】以白背飞虱3条SfPPO序列为研究对象,利用生物信息学方法分析其蛋白结构以及与其他昆虫之间的同源性。并以注射绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)的dsRNA作为对照组,通过注射合成的ds SfPPO后采用实时荧光定量PCR(qRT-PCR)检测基因表达抑制效果;此外,为了探究SfPPO在白背飞虱生长发育和免疫应答方面的作用,利用qRT-PCR检测SfPPO在不同发育阶段及组织中的表达情况,以及注射大肠杆菌(Escherichia coli)和枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)后3个SfPPO的诱导表达情况。【结果】...     

亚洲玉米螟幼虫体内酚氧化酶原cDNA片段的克隆

利用昆虫酚氧化酶原(PPO)基因序列设计简并引物，采用RT-PCR方法从亚洲玉米螟幼虫体内扩增了一段522个核苷酸的eDNA片段，编码174个氨基酸。经Blastp分析表明，该段氨基酸序列同鳞翅目和双翅目中PPO的相同区域具有较高的相似性(39％一63％)。其中与烟草天蛾PPO的相似性最高(63％)；与家蚕、大蜡螟、惜古比天蚕蛾PPO也有较高的相似性。在该片段中含有1个该类酶原中保守的2个铜离子结合位点之一(含4个组氨酸残基)。据此推断克隆的片段为PPO基因片段。     

槲皮素和硫脲对野桑蚕多酚氧化酶的抑制类型

多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)在昆虫的变态发育和免疫防御中起着非常重要的作用,为开发以该酶为靶标的新型害虫抑制剂提供理论依据,以野桑蚕(Bombyx mandarina)五龄幼虫为材料提取多酚氧化酶,探讨了槲皮素和硫脲对该酶的抑制作用。结果表明,这两种抑制剂分别属于竞争性和非竞争性抑制剂。     

拟穴青蟹酚氧化酶原基因的抗菌免疫反应研究

以拟穴青蟹酚氧化酶原(SP-proPO)基因作为研究对象,通过金黄色葡萄球菌和哈维氏弧菌免疫刺激后表达模式的分析,来探索SP-proPO基因在防御细菌入侵过程中的先天免疫作用.结果表明,SP-proPO基因在正常拟穴青蟹的血细胞中存在较高的表达量;而且在细菌刺激的情况下,SP-proPO基因的表达量存在较为明显的上升,哈维氏弧菌刺激12h后,血细胞中SP-proPO基因的表达量提高了近4倍;金黄色葡萄球菌刺激2h后,血细胞中SP-proPO基因的表达量提高了近2.5倍.     

野桑蚕scalloped同源基因的克隆和序列分析

Hippo通路与昆虫的生长、发育和变态等过程密切相关,在动物不同物种之间高度保守。scalloped基因是Hippo通路元件Yki的偶联因子之一,参与调控基因的表达。克隆了野桑蚕(Bombyx mandarina)scalloped基因的完整开放阅读框(ORF)及其上下游的部分非编码序列。序列联配分析表明,与家蚕相比,野桑蚕scalloped基因序列存在多处的核酸片段缺失、插入及位点差异。结构域分析表明,野桑蚕Scalloped蛋白与家蚕、黑腹果蝇、小鼠和人的蛋白结构类似,均含有完整的TEAD蛋白家族典型TEA结构域和PDB结构域,但野桑蚕编码蛋白缺失蛋白C末端序列。系统发生树分析表明,昆虫Scalloped蛋白与脊椎动物TEF3可能存在共同的起源;家蚕Scalloped在进化中出现晚于野桑蚕且经历较多遗传选择过程。     

野蚕孵化酶基因的克隆与生物信息学分析

采用RT-PCR法从野蚕胚胎中克隆了一个885 bp孵化酶基因,命名为BmandHE(GenBank登录号:JN620366)。BmandHE ORF编码294个氨基酸残基,蛋白分子质量为33.57 kD,等电点为5.55。在BmandHE N-端存在16个氨基酸的信号肽,BmandHE序列含有锌指结合序列、Met-转角基序等孵化酶保守功能区域和构成孵化酶二级结构骨架的4个半胱氨酸残基。BmandHE与其他动物孵化酶氨基酸序列的相似性为30.4%～97.1%。进化分析表明,野蚕与昆虫家蚕、柞蚕、家蚊聚为一类,亲缘关系比较近。     

野桑蚕不同组织细胞色素P450 CYP305B1V1基因的诱导表达特征研究

[目的]研究不同诱导物对野桑蚕各组织中细胞色素P450CYP30581V1基因表达的影响。[方法]参照GenBank中公布的野桑蚕CYP305B1V1基因的mRNA序列,设计1对引物,采用半定量RT-PCR方法分析经NaF、芸香苷、氯氰菊酯和蜕皮激素处理的野桑蚕各组织中CYP305B1V1基因的表达情况,并对该基因的氨基酸序列进行同源性比较和进化分析。[结果]氯氰菊酯、芸香苷和NaF影响野桑蚕6TP305B1V1基因在组织中的表达,蜕皮激素无明显影响。氨基酸的同源性分析表明该基因氨基酸序列与家蚕CYP305B1的氨基酸序列同源性最高（100％）;与赤拟谷盗推测的CYP305A1、蜜蜂推测的CYP305A1、果蝇CYP305A1、冈比亚按蚊CYP305A2及库蚊CYP2L1有较高的同源性。[结论]野桑蚕CYP30581V1基因可能主要参与外源性化舍物的代谢,对揭示细胞色素P450的功能和不同药物的代谢机理具有重要意义。     

野桑蚕对溴氰菊酯抗性品系的筛选

[目的]通过溴氰菊酯对野桑蚕进行抗性品系的筛选,探明该药剂的抗药性发展情况,为科学施药和抗性治理提供依据。[方法]室内饲养繁殖来自3个不同地区的野桑蚕,点滴法测定其亲代对溴氰菊酯的敏感性。分别以半数致死量左右的剂量通过点滴法逐代处理其幼虫,统计幼虫死亡情况,建立毒力回归方程并计算抗药性倍数及其提高倍数。[结果]在桑叶育条件下,经3代室内筛选,启东野桑蚕（YQD）F4代抗药性倍数为14.26,较F0代提高了0.2倍;苏大桑园野桑蚕（YSD）F4代抗药性倍数为16.48,较F0代提高了0.9倍;在人工饲料条件下,经6代室内筛选,吴江野桑蚕（YWJ）F6代抗药性倍数为18.67,较F0代提高了0.2倍。[结论]相同剂量筛选下,YSD比YQD抗药性倍数提高快;YWJ在人工饲料饲育和杀虫剂筛选双重选择下,抗药性发展较慢。     

野桑蚕中肠组织cDNA文库的构建及丝氨酸蛋白酶基因片段的克隆与序列分析(英文)

[Objective] The aim of the study is to construct cDNA library of midgut tissue of wild silkworm and isolate the serine protease gene. [Method] The midgut tissue-specific cDNA library of wild silkworm was constructed via cDNA Library Construction Kit (TaKaRa), then the serine protease gene was cloned via sequencing of the yielded cDNA library. [Result] The titer of cDNA library reached 6.2×105 pfu/ml, average insert size was about 1.2 kb. The serine protease gene cDNA fragment was obtained from colony sequencing (Accession No: EU672968). The nucleotide sequence of the cloned 854 bp fragment encodes 284 amino acid residues. Homology analyses showed some homology between putative amino acid sequence of the cloned fragment and amino acid sequences of serine proteases from other ten insects. [Conclusion] The results may avail to reveal the resistance of silkworm and wild silkworm to exotic intrusion.     

野桑蚕中肠组织cDNA文库的构建及丝氨酸蛋白酶基因片段的克隆与序列分析

[目的]构建野桑蚕中肠组织cDNA文库并分离其丝氨酸蛋白酶基因。[方法]利用TaKaRa公司生产的cDNA Library Construction Kit构建了野桑蚕中肠组织的cDNA文库,并采用测序法克隆分析丝氨酸蛋白酶基因cDNA。[结果]经鉴定,文库的滴度达6.2×105pfu/ml,文库插入片段的平均大小为1.2 kb左右。从文库的测序结果中获得了野桑蚕丝氨酸蛋白酶基因片段(登录号:EU672968),序列分析结果显示:该基因片段由854个核苷酸组成,编码284个氨基酸残基。通过对该基因片段编码的氨基酸和其他10种昆虫的丝氨酸蛋白酶基因编码的氨基酸的同源性分析,发现该氨基酸序列与其他丝氨酸蛋白酶具有一定的同源性。[结论]该基因的发现对于研究家蚕和野桑蚕对外来入侵物的抗性具有重要意义。