pCB-zeolin-GFP表达载体的构建及瞬时表达

为利用荧光蛋白基因GFP检测外源基因在转基因植株中的表达和定位,构建含有GFP基因的植物表达载体pCB-zeolin-GFP。在目的基因的开放阅读框（ORF）两端设计引物,并引入酶切位点和保护碱基,用PCR方法从pDHA扩增得到zeolin基因的全长,克隆到中间载体pMD18-T,分别用NcoⅠ和BglⅡ2种限制性内切酶酶切重组质粒和经过改良的pCAMBIAI1302植物表达载体,经回收、连接、转化、鉴定后,利用基因枪转化法将重组载体转入洋葱表皮细胞,通过共聚焦显微镜检测绿色荧光蛋白在洋葱表皮细胞中的瞬时表达。构建了zeolin基因与绿色荧光蛋白（GFP）融合的植物表达载体pCB-zeolin-GFP,并在洋葱中得到了表达。构建的融合植物表达载体pCB-zeolin-GFP正确,该载体的成功构建为今后进行基因转移、基因功能研究及培育新品种奠定了基础。     

SeNHX1与GFP融合基因在酵母中表达及其耐盐性表现

通过构建盐角草的液泡型Na /H 反向转运蛋白SeNHX1基因的酵母表达载体,研究该基因对酵母耐盐性的影响.将SeNHX1基凶与荧光报告基因GFP融合,分别构建酵母表达载体pYES2.SeNHX1-GFP、pYES2-SeNHX1和pYES2-GFP,转化酵母W303,诱导3个载体表达,并测定含有不同表达载体的酵母生长曲线.结果表明.荧光显微镜下观察到带有报告基因GFP的2个转化子W303(pYES2-SeNHX1-GFP)和W303(pYES2-GFP)均可发出绿色荧光,而没有报告基因的转化了W303(pYES2-SeNHX1)不发出荧光;在含有0.8 mol/L NaCl培养基中培养0～48 h内,W303(pYES2-SeNHX1-GFP)和W303(pYES2-SeNHX1)菌株前期生长比对照菌株W303(pYES2-GFP)慢,但在培养48 h后则大大超过对照菌株.表明所构建带有目的基因SeNHX1的酵母表达载体已表达,且证实SeNHXl基因可提高酵母的耐盐性.     

高羊茅光周期调控基因FaCONSTANS亚细胞定位与差异表达分析

构建高羊茅光周期调控基因FaCONSTANS与绿色荧光蛋白基因GFP融合的植物表达载体P-FaCONSTA NS-hGFP,基因枪转化法转入洋葱表皮细胞,荧光显微镜检测融合基因的瞬时表达.并运用实时荧光定量PCR研究光周期调控基因FaCONSTANS在长日照与短日照条件下昼夜24 h的表达差异.结果表明:FaCONST...     

玉米蛋白激酶ZmSPK1在转基因拟南芥中的定位

为了研究玉米蛋白激酶ZmSPK1在植物体内亚细胞水平上的分布情况,利用绿色荧光蛋白基因gfp为报告基因,分别构建了以35S为启动子表达ZmSPK1-GFP融合蛋白和GFP的植物表达载体35S∷ZmSPK1-GFP和35S∷GFP,用花粉浸醮的方法将表达载体转入拟南芥,筛选稳定表达株系,在共聚焦激光扫描显微镜下观察ZmSPK1在植物细胞中的定位。研究结果表明:融合蛋白ZmSPK1-GFP的荧光分布与游离GFP相似,在细胞浆及细胞核内均可见。与单独表达GFP相比,融合蛋白ZmSPK1-GFP在核内信号更强,推测ZmSPK1是可溶性蛋白,定位在核内。     

马铃薯损伤诱导型启动子Wun1基因的克隆及其GFP表达活性

通过聚合酶链式反应(PCR),以马铃薯基因组DNA为模板,根据已报道Wun1序列设计了一对特异引物,在优化的PCR反应条件下扩增出了Wun1基因片段,通过序列分析与文献报道的碱基序列有96.86%的同源性,该基因已登录到GenBank(No.AY803296)。以pBIPG(携带GFP基因)的质粒DNA为模板,通过PCR技术亚克隆到了源自水母(Aequorea)大小为756bp的绿色荧光蛋白(GFP)基因,与已知序列同源率为100%。利用GFP基因作为报告基因,构建了用于比较鉴定所克隆启动子活性的pBIG(35S-GFP)和pBIWG(Wun1-GFP)两个植物表达载体,采用基因枪法进行对洋葱表皮细胞的遗传转化,检测Wun1启动子在受体细胞中调控基因表达的活性,结果表明克隆到的Wun1启动子活性强于组成型表达的35S启动子,GFP瞬时表达的分析方法也让我们有效的筛选到用于进行马铃薯抗病育种的调控元件。     

玉米ZmPti1在转基因拟南芥中的亚细胞定位

Pti基因不但在植物的抗病信号传导中起着非常重要的作用,而且玉米中一个类Pti1基因——ZmPti1还参与了植物抗盐的信号传递。为了研究ZmPti1 在植物体内亚细胞水平上的分布情况,利用绿色荧光蛋白基因(GFP)为报告基因,分别构建了以35S 为启动子表达ZmPti1-GFP 融合蛋白和GFP游离蛋白的植物表达载体pGreen0029-35S∷ZmPti1-GFP 和pGreen0029-35S∷GFP, 通过花浸蘸法转入拟南芥中进行过量表达。在共聚焦激光扫描显微镜下观察ZmPti1在植物细胞中的定位。研究结果表明: ZmPti1是一个可溶性蛋白,定位在细胞质内。     

棉花耐盐相关基因GhVP的表达及功能分析

为了研究Gh VP基因在棉花中的表达特性和功能,克隆了棉花Gh VP基因,构建p BI121-Gh VP∷GFP荧光表达载体,采用基因枪技术转化洋葱内表皮细胞,结果显示Gh VP基因编码蛋白定位于细胞质膜上。将构建的p BI121-Gh VP∷GFP荧光表达载体转化棉花花粉,花粉荧光明显增强,说明该基因可以在棉花中表达,为Gh VP基因可以在棉花中表达提供了依据,为培育棉花耐盐新材料奠定了基础。     

海马齿Spmet基因表达产物的亚细胞定位

为研究从海马齿(Sesuvium portulacastrumand L.)中克隆的Spmet基因在植株体内亚细胞水平上的分布情况及组织表达的特异性,将Spmet基因的编码区定向克隆至植物表达载体pCAMBIA-1304上,使其与mgfp（绿色荧光蛋白）基因融合,构建Spmet基因植物瞬时表达载体,使用基因枪法将该表达载体导入洋葱表皮细胞,通过荧光激发,在荧光显微镜下观察洋葱表皮细胞中的绿色荧光部位,确定其在细胞中的表达部位。同时利用半定量PCR的方法对其在根、茎、叶中的表达特性进行分析。结果表明,该基因在海马齿植物的根、茎、叶中均有表达,表达量为叶>茎>根,融合蛋白主要分布在洋葱表皮细胞的细胞核上,细胞膜上也有微量表达。说明海马齿2型金属硫蛋白基因在海马齿植物中属于组成型表达,同时是一个核表达的基因,该结果为进一步研究Spmet基因在抗重金属方面发挥的作用打下了基础。     

小麦基因工程育种的回顾和展望

1　小麦分子育种的国内外进展1.1　小麦遗传转化自1983年Zambryski获得世界上第一例转基因植株,1985年horch首创叶盘法以来,分别建立了农杆菌介导法、PEG介导法、电激穿孔法、病毒介导法、显微注射法、花粉管通道法、超声波法、基因枪法等,转基因成功的有50多个物种共110多种植物。目前已形成了以农杆菌介导法和基因枪法占主导地位的两大植物转基因体系。迄今为止,媒介农杆菌法获得的转基因植物占转基因植物总数的85％左右,主要集中在双子叶植物,但在单子叶植物上的进展却非常缓慢。到目前为止,转有农业价值基因的工作主要集中在水稻上,转其它粮食作物主要是标记基因和报告基因。小麦属于难以转化的禾……     

BpERF1.1基因在低温下的表达特性及过表达载体构建

分析白桦BpERF1.1基因不同组织部位以及低温胁迫后的表达模式,定位基因表达部位,并为获得转基因白桦做初步准备.通过实时荧光定量PRC技术测定BpERF1.1基因的相对表达量;利用基因枪法在洋葱表皮细胞瞬时表达35S::BpERF1.1-GFP,激光共聚焦显微镜观察GFP发光情况,获得BpERF1.1基因表达产物的亚细胞定位信息;此外,利用双酶切法将BpERF1.1基因连接到pRokⅡ过表达载体,以及热激法转化到大肠杆菌感受态细胞中.BpERF1.1基因在叶片中相对表达量最高;低温胁迫后的24 h内,白桦BpERF1.1基因持续上调表达;BpERF1.1基因的表达产物定位在细胞核;pRokⅡ-BpERF1.1植物过表达载体菌液PCR的目的 条带位置正确,测序结果BLAST比对后与序列吻合.白桦BpERF1.1基因主要表达部位在叶片,其可以响应低温逆境,且过表达载体pRokⅡ-BpERF1.1构建成功.     

Production of Transgenic Plants： More, Better, and Faster

Over the last two decades, transgenic plants have moved from being solely laboratory vehicles for basic research work to providing new varieties grown on large areas throughout the world. A number of plant     

抗根腐病的转GmPGIP3基因小麦扬麦18的获得与鉴定

GmPGIP3是大豆的一种多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白, 能够特异性地抑制部分病原真菌内切多聚半乳糖醛酸活性, 从而减弱病原菌对植株的侵害。利用基因重组技术构建了GmPGIP3基因的单子叶植物表达载体pA25-GmPGIP3, 通过基因枪介导法将pA25-GmPGIP3转入小麦品种扬麦18中。对转GmPGIP3基因扬麦18的T₀至T₂代植株进行PCR、Southern杂交、半定量RT-PCR和荧光定量Q-RT-PCR分析, 并对根腐病进行抗性鉴定。结果表明, GmPGIP3已转入扬麦18, 并在转基因小麦中遗传、转录和表达;比受体材料相比, 5个GmPGIP3过表达的转基因小麦株系对根腐病的抗性有明显提高。     

马铃薯质体表达载体构建及GFP基因在块茎中的瞬时表达

利用高等植物质体基因组在进化中高度保守的特点, 根据烟草质体基因组全序列设计合成引物, PCR扩增并克隆了马铃薯质体的trnI-trnA基因片段。将测序正确的trnI基因和trnA基因作为定点整合外源基因的同源重组片段, 构建成包含Prrn-gfp-aadA-TpsbA表达盒的马铃薯质体定点转化载体pBMLSIA-GFP, 酶切鉴定表明, 所构建载体符合预期设计。采用该载体对马铃薯块茎进行基因枪法转化, 结果表明, GFP基因可在质体特异性启动子Prrn及终止子TpsbA的调控下在马铃薯块茎中瞬时高量表达, 经基因枪轰击后马铃薯块茎在紫外投射仪下产生很强的绿色荧光, 在距离为6 cm, 压力1 100 psi轰击2枪的条件下产生的绿色荧光最强。马铃薯块茎可溶性蛋白SDS-PAGE电泳分析表明, GFP蛋白表达量约占总可溶性蛋白的15.4%~30.2%, 均达到了较高的表达水平。该载体对后期马铃薯质体转化体系的建立和其他功能基因导入马铃薯质体进行性状改良具有重要应用价值。     

转AcAMP-sn基因抗全蚀病小麦新种质的创制与鉴定

抗菌肽是一类具有广谱抗菌性的小分子多肽,在植物防卫反应中起着重要作用。本研究人工合成了洋葱抗菌肽基因AcAMP-sn,利用基因重组技术构建了该基因的单子叶植物表达载体pAHC25::AcAMP-sn,使AcAMP-sn基因的表达受玉米Ubiqutin启动子控制。采用基因枪介导法,将AcAMP-sn基因导入小麦品种扬麦18,利用PCR、半定量RT-PCR及荧光实时定量RT-PCR检测、分析转基因小麦T0~T4代目的基因及其表达量,并对转基因植株进行全蚀病的抗性鉴定。PCR检测结果表明,导入的AcAMP-sn基因能够在转基因小麦中遗传。与受体扬麦18相比,在5个转基因小麦T4代株系中,AcAMP-sn基因的表达量及全蚀病抗性均显著提高,且全蚀病菌的相对含量明显下降,说明AcAMP-sn基因的过表达可以增强转基因小麦对全蚀病的抗性。     

用核基质结合区(SAR)序列提高小麦最小表达框转基因表达的稳定性

采用最小表达框技术转化植物可以规避由骨架序列引起的安全风险。核基质结合区序列SAR (scaffold attachment region)可作为边界元件与核基质结合阻挡转基因片段邻近染色质区的作用与影响, 提高外源基因稳定性。本研究在最小表达框序列两端添加SAR序列, 提高小麦最小表达框转基因表达的稳定性, 提高转化基因的表达效率。首先, 以GUS为目的基因构建带有SAR序列的最小表达框, 以科农199为受体进行基因枪转化, 同时以不加SAR序列的最小表达框片段为对照。带有SAR序列的最小表达框片段共轰击857个幼胚, T₀代获得40株再生植株, PCR检测到16株阳性植株, 转化效率为1.87%; 对这16个阳性单株进行GUS染色, 15株显色; 从来自4个T₀阳性植株的18个T₁代植株中随机选取18株进行PCR和GUS染色检测, 有15株表现为阳性。不带SAR序列的对照片段轰击1012个幼胚, 获得31株再生植株, 其中5株PCR阳性, 转化效率0.49%, 这5个阳性植株中仅2株为GUS染色阳性; 来自于5个T₀代PCR阳性株系的10个T₁代单株中没有发现PCR和GUS染色阳性株。表明SAR序列可以提高基因枪转基因效率和目的基因表达稳定性。为了创制抗旱转基因小麦, 以来自大豆的抗旱相关转录因子基因GmDREB3为目的基因, Bar基因为筛选标记基因, 转化受体小麦济麦22, 共轰击6045个幼胚, 获得再生植株130株, PCR检测阳性植株30株, 转化效率为0.50%; 随机选取6株PCR阳性植株进行RT-PCR分析, 其中5株可检测到外源基因的转录。进一步对这5株RT-PCR阳性植株插入片段完整性进行分析, 其中4株插入片段基本完整。通过real-time PCR分析, 发现T₀代6个RT-PCR阳性植株的外源GmDREB3的拷贝数为1~3个。以上结果证明, 在最小表达框两端加上SAR序列后可以提高小麦最小表达框转基因表达的稳定性。     

抗全蚀病、根腐病的转PgPGIP1基因小麦的获得与鉴定

全蚀病和根腐病是小麦(Triticum aestivum)重要的土传真菌病害。PgPGIP1是人参(Panax ginseng)的一种多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白,可以抑制部分病原真菌分泌的多聚半乳糖醛酸酶的活性。本研究人工合成了PgPGIP1基因,并构建PgPGIP1基因的单子叶植物表达载体pA25-PgPGIP1,通过基因枪介导法将其转入小麦品种扬麦18中。对转PgPGIP1基因的T₀至T₄代植株进行PCR、RT-PCR和Q-RT-PCR分析,并对其全蚀病和根腐病抗性进行鉴定。结果表明,PgPGIP1基因能够在4个转基因小麦株系中遗传、转录与表达。与未转基因的小麦扬麦18相比,4个转基因小麦株系对全蚀病与根腐病的抗性明显提高,说明PgPGIP1表达增强了转基因小麦对全蚀病与根腐病的抗性。     

农杆菌敏感小麦基因型的筛选及其转化

利用C58c1农杆菌菌株（其携带的pPTN290质粒载体上含有nptⅡ 基因和GUS基因）为供体材料和小麦幼胚为受体材料,对我国35个春小麦基因型进行了农杆菌敏感性研究和转化研究。组织化学染色结果表明,PM97034、P187、巴140105、扬麦158、新春9号和克丰6号等基因型农杆菌感染后GUS基因瞬时表达率达到了15.0% ~ 30.0%,显著高于模式基因型Bobwhite。其余幼胚分别在含10-25mg/L G418培养基上诱导愈伤组织和分化植株,抗性再生植株经ELISA检测、PCR检测、叶片离体退绿检测、X-Gluc染色检测和Southerm blot检测,最终从新春9号和PM97034的农秆菌转化效率高于Bobwhite. Southerm blot检测结果同时表明,外源基因在多数转基因植株中表现为单拷贝整合。T₁代植株ELISA检测结果和PCR检测结果表明,外源基因在个别株系中的分离符合孟德尔遗传规律,而在多数株系中的分离偏离了孟德尔遗传规律。阳性植株与阴性植株分离比经X²。适合性检测,表明外源基因在多数株系中的遗传符合3：1分离规律。本文首次对不同小麦基因型进行了农秆菌敏感和转化效率研究,筛选到新春9号和PM97034两个对农杆菌比较敏感且转化效率比较高的基因型,可望广泛用于小麦转基因研究。     

抗纹枯病、根腐病的转SN1基因小麦的获得与鉴定

SN1是源于马铃薯的一种抗菌肽, 可以抑制多种植物病原菌的生长。小麦纹枯病(主要病原菌为禾谷丝核菌Rhizoctonia cerealis)和根腐病(主要病原菌为平脐蠕孢菌Bipolaris sorokiniana)是小麦的主要土传真菌病害。本研究利用基因工程技术构建了SN1基因的单子叶植物表达载体pA25-SN1, 它受玉米泛素(ubiquitin)启动子的控制;采用基因枪法将pA25-SN1转化小麦推广品种扬麦18幼胚愈伤组织4 000块, 获得203株再生植株, 通过PCR检测出阳性植株55株, 转化率为1.38%。对转SN1基因小麦T₀~T₂代植株, 进行外源基因的PCR、Southern blot、RT-PCR、荧光定量RT-PCR(Q-RT-PCR)分析和小麦纹枯病菌与根腐病菌接种及其抗病性鉴定。结果表明, 转入的SN1基因已经整合到转基因小麦的基因组中, 能够在转基因小麦中遗传、转录与表达。SN1基因的表达提高了转基因植株对小麦纹枯病和根腐病的抗性, 其抗病性可以遗传。     

INO启动子克隆及胚珠特异表达载体的构建

为了观察转基因植株胚珠特异性表达,采用CTAB法提取拟南芥基因组DNA,构建了35S::pCAMBIA1304-L117载体并对番茄进行遗传转化。根据已报道的INO启动子序列设计并合成一对特异引物,通过PCR对启动子进行扩增、连接并对其进行测序,结果表明：与GenBank中已注册的INO启动子序列的同源性为100%,并且构建了以INO代替CAMV35S启动子的pCAMBIA1304-L117植物表达载体,采用冷冻法将其转入根癌农杆菌EHA105。成功构建了35S::pCAMBIA1304-L117载体,并为进一步检测奠定了基础。