植物甜蛋白马宾灵(MabinlinⅡ)多克隆抗体的制备与鉴定

马宾灵(Mabinlin Ⅱ)是中国所特有的植物马槟榔种子中的甜味蛋白,将其作为新型甜味剂有着广阔的市场前景。为了给重组马宾灵的基因工程应用提供可靠的蛋白质检测与鉴定的抗体,通过离子交换法从马槟榔(Capparis masaikai Lévl)种子中分离纯化马宾灵,将其作为抗原免疫新西兰大白兔,收集免疫后血清经抗原亲和纯化制备马宾灵多克隆抗体。结果表明,制备的马宾灵多克隆抗体经ELISA检测效价比达到1:256000,Western-blot检测表明其具有良好的反应性和特异性。本研究制备的马宾灵多克隆抗体可用于马宾灵在不同生物反应器中表达的检测,为马宾灵的基因工程研究提供灵敏可靠的免疫学鉴定。     

重组植物甜蛋白马宾灵的食品级乳酸乳球菌诱导表达系统的构建

为了将马宾灵(MabinlinⅡ)直接应用于功能性食品中,通过对MabinlinⅡ基因进行有目的的剪切重组,将重组MabinlinⅡ基因插入到食品级表达载体中,经电击转化和乳糖筛选获得重组的食品级乳酸乳球菌,构建了重组植物甜蛋白马宾灵(MBL-ABH)的食品级乳酸乳球菌诱导表达系统。结果表明,该食品级诱导表达系统经乳酸链球菌素(Nisin)诱导后所表达的目的蛋白的含量较低,Western-blot检测表明MBL-ABH成功的在食品级乳酸乳球菌中表达。本研究扩展了植物甜蛋白马宾灵在食品方面的应用,有望开发出能够避免添加食糖类物质的功能性食品。     

中国特有产甜蛋白植物马槟榔常规繁育技术研究

研究濒危植物马槟榔的种子繁殖和压条繁殖方法,为其异地保护、繁殖和有效利用建立基础。探索种子预处理方法、存放时间、播种方法以及不同激素、温度、基质等对发芽率的影响,并研究普通压条和高空压条繁育技术。马槟榔种子为中度顽拗性种子,去除果皮后：晒干种子发芽率低;30℃烘干24 h种子发芽率为0;阴凉处晾干表面种子发芽率最高,离开母体种子约72天后种子失去活力。其最佳播种方法为：每年的11-12月,用新鲜种子播种,播种基质为红壤土:椰糠＝1:1;对种子进行开裂处理和激素处理有助于种子快速萌发并提高发芽率,而以10 mg/L GA3的效果最佳,提前至少5天萌发。高于65℃低于100℃的热水处理4 h能提高种子的萌发率。高空压条是马槟榔较好的压条繁殖方法。该研究成功探索出了马槟榔较好的常规繁殖方法,可广泛应用于该植物的异地保护和小规模扩繁。     

马槟榔种质资源遗传多样性的RAPD分析

为了保护和开发中国野生马槟榔种质资源,利用RAPD技术对取自中国5个省的23份野生马槟榔种质进行遗传多样性分析。从100条RAPD随机引物中筛选出9条合适的引物,多态性条带比率(PPB)为91.35%,平均Shannon信息指数(I)为0.4205,平均Nei’s基因多样性(H)为0.2728,每位点平均有效等位基因数(NE)为1.4508。UPGMA聚类分析显示23份种质间的遗传相似系数(GS)范围为0.3846~0.9519,当相似系数为0.66时可分为3个类群。     

槟榔APV1病毒多克隆抗体制备及酶联免疫检测

槟榔是海南重要的经济作物,APV1 (areca palm velarivirus 1)病毒引起的槟榔黄化病严重危害槟榔产业的健康发展。研发快速精准的APV1病毒检测技术对于防控槟榔黄化病具有重要意义。本研究利用RT-PCR扩增APV1病毒的外壳蛋白(CP)基因序列,构建原核表达载体pET30a-APV1-CP并转化至大肠杆菌,经诱导表达和蛋白纯化获得APV1-CP蛋白。通过注射兔子获得多克隆抗体,经检测其效价为102 400。采用ELISA和RT-PCR分别对槟榔APV1病毒检测,发现两种检测方法大部分的检测结果基本一致。APV1病毒ELISA检测技术对槟榔种苗的检测及槟榔黄化病的防控具有重要的实用价值。     

PVX介导的槟榔坏死环斑病毒CP蛋白在烟草中的表达和纯化

槟榔坏死环斑病毒(areca palm necrotic ringspot virus, ANRSV)是新发现的一种槟榔黄化病致病病毒。本研究利用马铃薯X病毒(potato virus X, PVX)表达载体pgR107,在烟草中表达ANRSV的外壳蛋白(coat protein, CP),旨在分离纯化该蛋白并开展对病毒蛋白的功能研究和利用该蛋白制备多克隆抗体。为方便纯化,将8肽Strep蛋白标签序列融合到ANRSV-CP编码基因的3'端,利用In-Fusion无缝克隆策略将其克隆到PVX载体,构建重组表达质粒PVX-ANRSV-CP-Strep。采用电转化法将质粒PVX-ANRSV-CP-Strep转入根瘤农杆菌GV3101中,通过农杆菌介导注射侵染接种本氏烟,14 d后对收集的16 g表达ANRSV-CP-Strep蛋白、PVX侵染的本生烟草样品进行了蛋白提取,采用SDS-PAGE和Western blot检测ANRSV-CP-Strep蛋白的表达情况。测序结果显示植物病毒表达载体PVX-ANRSV-CP-Strep构建成功。经Strep-Tactin~?XT High Capacity亲和层析柱纯化,SDS-PAGE和Western blot检测结果显示ANRSV-CP-Strep重组蛋白可通过PVX载体在烟草中有效表达,其表达量为22μg/g (鲜叶质量)。本研究为后续利用该蛋白制备多克隆抗体并建立ELISA方法进行病毒检测提供了理论依据。     

白菜型冬油菜类甜蛋白的筛选、克隆及其在低温胁迫下的表达

类甜蛋白是一种能在低温胁迫下诱导表达,增强植物抗逆性的关键蛋白质。本研究运用双向电泳结合质谱技术,筛选低温胁迫下陇油7号叶片差异蛋白点,从中分离出与抗寒密切相关的类甜蛋白。根据已发表植物类甜蛋白基因TLP的保守序列设计引物,采用RT-PCR扩增陇油7号的DNA,获得TLP基因开放阅读框,长度为732 bp,编码243个氨基酸的蛋白质。生物信息学分析显示,与甘蓝型油菜(Brassica napus)的蛋白质氨基酸序列同源性高达99.18%,该基因在进化上高度保守,其保守序列属于植物的GH69-TLP-SF超家族,TLP相对分子质量和理论等电点分别为26.02 k D和9.15。TLP含有一个信号肽,为亲水性蛋白,亚细胞定位预测其是在内质网中合成的蛋白。二级结构预测表明陇油7号的TLP是由不规则卷曲和延伸链组成的不稳定蛋白。实时荧光定量和半定量分析显示,在适当阈值的低温胁迫下TLP基因表达量上调,表明该基因在白菜型冬油菜陇油7号适应低温胁迫过程中发挥重要作用。     

甘肃马先蒿化感作用对禾本科牧草种子萌发及幼苗生长的影响

利用三江源区"黑土滩"次生毒杂草群落优势植物甘肃马先蒿全株浸提液,对4种禾本科牧草种子发芽、幼苗生长的化感作用进行了研究。结果表明:甘肃马先蒿浸提液对禾本科牧草种子发芽和幼苗生长具有显著抑制作用(p0.05)。4种牧草对甘肃马先蒿浸提液敏感性强弱顺序为披碱草(Elymus dahuricus)青海冷地早熟禾(Poa crymophilacv.Qinghai)同德老芒麦(Elymus sibircus cv.Tongde)青海中华羊茅(Festuca sinensis cv.Qinghai.);4种牧草幼苗生长对甘肃马先蒿浸提液敏感性弱于种子萌发。     

植物FtsZ基因家族生物信息学分析

FtsZ (Filamentous temperature-sensitive protein Z)蛋白是一种高度保守的细菌和真核生物微管蛋白的同系物,在许多植物和藻类物种中存在,是质体分裂复合体的基本组成部分,在植物生长发育中发挥重要作用。本研究在一种藻类植物(红藻)、一种苔藓植物(小立碗藓)、两种单子叶植物(水稻和高粱)、四种双子叶植物(木薯,拟南芥,蓖麻和毛果杨)中共鉴定出21个Fts Zs成员,分析了其蛋白理化性质、二级结构、三级结构,预测了保守碱基、FtsZs成员的亚细胞定位、蛋白磷酸化位点并且构建了系统发育进化树。结果显示,FtsZs的脂肪系数、不稳定系数和总平均亲水性等理化性质存在很大的差异。FtsZ蛋白家族均不具跨膜结构域,也不含有信号肽;蛋白的二级结构主要是无规则卷曲和延伸链;保守基序分析发现,植物FtsZ家族基因在进化上是相对保守的;FtsZs成员的亚细胞定位分析发现,Fts Zs分布在叶绿体和细胞质中。本研究可为FtsZ基因家族成员的生物学功能研究提供理论基础。     

不同砧木对马瑟兰葡萄生长及果实品质的影响

针对新疆产区研究砧木对接穗影响的研究较少,探讨不同砧木对马瑟兰葡萄生长势、光合特性和果实品质的影响,旨在为新疆玛纳斯河流域生产上选择适宜的酿酒葡萄砧穗组合提供理论依据。以2 a生马瑟兰/5BB、马瑟兰/SO4砧穗组合为处理,马瑟兰自根为对照,测定不同砧木马瑟兰的生长势、光合与叶绿素荧光参数及果实品质,并用主成分分析方法综合评价砧穗组合的优劣。结果表明:马瑟兰/5BB的节间粗度、节间长度、SPAD值、坐果量显著高于马瑟兰自根苗。马瑟兰/5BB净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)及PSⅡ实际光化学效率(Φ_(PSⅡ))最大,胞间CO_2浓度(Ci)、非光化学猝灭系数(NPQ)最小。马瑟兰/SO4穗质量、果皮厚度、种子数量均最大,而葡萄皮总单宁含量最小。马瑟兰/5BB总糖含量、葡萄皮总类黄酮含量、葡萄皮总花色苷含量最大,而种子质量最小。根据主成分分析的综合得分由高到低依次为:马瑟兰/5BB马瑟兰/SO4马瑟兰自根苗。研究发现,砧木5BB的适应性优于SO4,且马瑟兰/5BB砧穗组合的亲和性高、生长势强、光合作用效率高、果实品质优,为新疆玛纳斯河流域适宜的砧穗组合。     

马泡瓜叶绿体基因组测序

马泡瓜(Cucumis melo L. var. agrestis Naud.)葫芦科甜瓜属植物,种子富含油脂,可榨取优质食用油,还可为医药和食品工业提供原料。本研究首次开展了马泡瓜叶绿体基因组测序工作。结果表明：马泡瓜叶绿体基因组与普通甜瓜近似,物种聚类分析表明与甜瓜、蛇瓜、越瓜最为接近。本研究可以为育种提供理论参考。     

槟榔黄叶病毒1外壳蛋白的互作蛋白筛选

为明确槟榔黄化病致病机理,探究槟榔黄叶病毒1 (areca palm leaf yellowing virus 1, APLYV 1)病毒与宿主蛋白之间相互作用的机制,本研究以槟榔叶片为材料,构建槟榔cDNA酵母双杂交文库,以APLYV 1的外壳蛋白(coat protein, CP)为诱饵,构建诱饵载体pGBKT7-CP,采用酵母双杂交技术,从槟榔cDNA文库中筛选与其互作的蛋白。结果表明,成功构建槟榔酵母文库,文库容量达1.1×10⁷以上,重组率为100%,插入片段平均长度>1 000 bp。成功构建诱饵载体pGBKT7-CP,通过自激活实验检验,阳性对照在四缺培养基平板上能正常长菌且显蓝,阴性对照和实验组在二缺培养基平板上能正常长菌,在三缺和四缺培养基平板上未长菌,表示构建成功的重组诱饵载体无自激活活性,可用于筛库实验。共筛选出13个阳性克隆,经NCBI网站与槟榔转录组库进行比对,最终得到10个候选槟榔蛋白,包含sHSP (small Heat Shock Protein)与DnaJ蛋白等。选择DnaJ蛋白,通过理化性质分析和蛋白二级结构预测,发现该槟...     

陆地棉植物络合素合酶基因的鉴定与功能预测

【目的】重金属胁迫对植物的生长发育有不良影响,植物络合素合酶(Phytochelatin synthase,PCS)在植物主动防御金属毒害过程中起关键作用。本文旨在对陆地棉PCS基因的数量、结构、分布和特性进行研究。【方法】根据棉属陆地棉(Gossypium hirsutum,(AD)_1),以及供体种雷蒙德氏棉(G.raimondii,D_5)和亚洲棉(G.arboreum,A_2)全基因组序列信息,结合双子叶模式植物拟南芥PCS蛋白特征域结构,对陆地棉PCS基因家族成员进行全基因组鉴定,并对其进行蛋白特征鉴定、同源类别分析、基因结构预测、酶作用位点比对以及半胱氨酸(Cys,Cysteine)分布分析。[结果]陆地棉中鉴定出4个PCS基因,而在其供体种雷蒙德氏棉和亚洲棉各鉴定出2个PCS基因。3个棉属8个PCS蛋白家族成员均含有2个特有的结构域,与催化中心相关的氨基酸位点完全保守。PCS蛋白家族在进化上分属2个不同亚组,亚组Ⅰ与亚组Ⅱ在亲缘关系上分别更接近双子叶植物和线虫,2个亚组内PCS家族在基因结构、Cys分布上存在差异,其中亚组Ⅰ较亚组Ⅱ整体内含子更长,N端Cys总数和成对Cys数量更多。雷蒙德氏棉中的2个旁系同源基因外显子完整性不及亚洲棉和陆地棉。【结论】相较于亚组Ⅱ,亚组Ⅰ的棉花PCS蛋白可能具有更强的植物络合酶活性,且陆地棉及其供体种亚洲棉对重金属的耐性强于雷蒙德氏棉。本研究为进一步研究棉花PCS的功能,以及棉花耐重金属胁迫品种改良提供理论依据。     

H_2O_2和种皮处理对马槟榔种子萌发和幼苗生长的影响

为探讨H_2O_2浸种和种皮处理对马槟榔种子萌发及幼苗生长的影响。本实验以新鲜采集的马槟榔种子为实验载体,使用不同浓度的H_2O_2浸种24h、破皮和种皮打磨处理,在25℃自然光照条件下,将种子播种在沙床上,对种子萌发的过程进行观察和记录,并讨论不同处理对种子发芽率、发芽势和幼苗生长的影响。结果显示,不同处理对马槟榔种子的发芽率影响依次为4mg/L H_2O_2种皮打磨ck开口;对发芽势的影响为开口4mg/L H_2O_2种皮打磨处理ck;对幼苗株高的影响为开口1mg/L H_2O_2打磨ck;对幼苗根生长的影响为开口1mg/L H_2O_2打磨ck。实验结果表明,使用浓度为1mg/L H_2O_2浸种24h是促进马槟榔种子萌发,促进幼苗生长的最佳处理方法。     

表达禽流感HA基因的重组马立克氏病病毒的构建

本试验首先用RT-PCR方法扩增出H9N2亚型禽流感病的HA基因,大小约1 700 bp,将其克隆到真核表达载体pcDNA中,并将该真核表达载体上的CMV启动子控制的含LacZ和HA基因表达盒克隆入马立克氏病病毒US2基因中,成功的构建了马立克氏病病毒的转移载体。然后,通过脂质体方法转染已感染马立克氏病病毒的鸡胚成纤维细胞(CEF)中,通过蓝斑筛选获得重组病毒。该重组病毒通过PCR方法鉴定证实其基因组中含有完整的HA基因。免疫酶反应和Western-blot证实重组病毒表达了禽流感HA蛋白,表达的HA蛋白具有血凝活性。     

益生菌酸马奶粉的制备及其对实验性高脂血症大鼠的影响

通过低温蒸馏和冷冻干燥2种工艺,制备了益生菌酸马奶粉,比较发现前者的益生菌活性高,进一步研究了低温蒸馏法制备的酸马奶粉对实验性高脂血症大鼠血清中总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)和低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的影响。结果表明,高剂量酸马奶粉能极显著降低高脂血症大鼠血清中TC,TG,LDL-C(p<0.01);低剂量能极显著降低TC(p<0.01),显著降低LDL-C(p<0.05)。     

植物PPR蛋白家族研究进展

PPR(pentatricopeptide repeat)是一种三角状五肽重复结构域,具有该结构域的蛋白质家族是植物最大的蛋白家族之一,其在植物生长发育过程中发挥着广泛而且至关重要的作用。大部分PPR蛋白N端具有线粒体或叶绿体定位序列,是研究植物核质互作的理想模型。本文从结构特征、亚细胞定位、组织结构和表达特点等方面总结了PPR蛋白的主要特征,归纳了其在叶绿体和线粒体RNA加工、细胞质雄性不育恢复、胚胎发育等作用机理方面的研究进展,分析了其家族进化关系,并对研究中存在的问题及可能的研究方向进行了展望。     

植物Prohibitins(PHBs)基因的研究进展

Prohibitins(PHBs,抗增殖蛋白),又称抑制素,作为一种肿瘤抑制蛋白,首先是在人类中被发现并进行研究的。植物中PHBs的发现只有20年的时间,并且相关的研究报道不多,因此对植物PHBs及其功能的了解比较少。截至目前的数据显示,PHBs的氨基酸序列在各种生物中高度保守,基于酵母的PHBs的分类,所有生物的PHBs都被分为Ⅰ型和Ⅱ型两种类型。这两类蛋白在线粒体内膜形成一个环状的大分子结构。尽管最初研究者推测PHBs基因对植物的生长可能有负调控效应。然而,近些年的研究表明其对植物的生长发育具有促进作用,通过参与线粒体的形成和提高植物对逆境的反应等行使多项生物学功能。本文主要从PHBs的分类、结构、亚细胞定位和PHBs的功能等方面,对植物PHBs的研究进展进行了简单的总结。     

不同品种槟榔果实发育和生物碱含量的动态变化

本研究以3种不同地理来源且果形差异大的槟榔品种为试验材料,分别为台湾种(枣形果)、海南种(椭圆形)和泰国种(长椭圆形),研究果实发育和生物碱变化过程。开花授粉后定期观察并记录从坐果到成熟过程中果实鲜重、纵径和横径,采用高效液相色谱法分析槟榔碱、槟榔次碱、去甲基槟榔碱、去甲基槟榔次碱的含量。结果表明,槟榔在开花40～140 d后果实纵径、横径和重量均处于快速增长期,果实发育早期纵径增长较快,后期以横径生长为主,鲜重增加持续至花后200 d,属于营养快速积累期。不同发育时期生物碱含量测定结果,泰国种槟榔碱含量最高,变异范围为5.59～7.47 mg/g,花后140 d达峰值,其次为槟榔次碱;台湾种槟榔果实槟榔次碱和去甲槟榔次碱含量较高,槟榔碱含量低,变异范围为0.29～2.16 mg/g,花后80 d时含量最高。海南种槟榔碱含量变异范围为2.47～3.65 mg/g,花后140 d时含量最高,去甲槟榔次碱、槟榔次碱的含量在果实发育期变化幅度较小,表明果实中的槟榔碱在青果期含量较高。本研究掌握了不同果形品种发育过程中生物碱含量变化规律,为探索槟榔果实品质形成机理和鲜果采收期的确定提供理论参考...     

羊草自交不亲和性相关基因TrxLc的克隆、表达和酶活性分析

羊草是一种重要的禾本科牧草，主要分布于远东地区。硫氧化还原蛋白H (Trx h) 是一大类广泛分布于动物、植物和微生物中的小分子蛋白。在一些禾本科植物中，一种在成熟花粉中表达的Trx h，与植物的自交不亲和性有关。在本研究中, 我们克隆了羊草花粉硫氧还蛋白基因(TrxLc)的DNA和cDNA序列, 与其他禾本科植物Trx h的cDNA序列相