苎麻雄性不育相关atp6和atp9基因RNA干扰载体的构建

植物线粒体基因缺陷是细胞质雄性不育的主要原因。为了获得苎麻atp6和atp9基因RNA干扰(RNAi)表达载体,根据已报道的苎麻atp6和atp9基因序列设计引物,利用RT-PCR克隆了atp6和atp9基因的部分cDNA片段,将目的基因正反向片段连接入RNAi载体pHANNIBAL,再将其表达框连入表达载体pCAMBIA 1300。结果表明,所克隆的cDNA片段经序列比对后确认为目的基因片段,经酶切和测序验证确认完成了atp6和atp9基因RNAi载体pCAM-6SR和pCAM-9SR的构建。atp6和atp9基因RNAi载体是验证苎麻雄性不育的基础,也为苎麻遗传工程改良奠定了技术基础。     

甜菜线粒体atp6基因转录本的RNA编辑位点研究

RNA编辑现象普遍存在于高等植物的线粒体中,是线粒体中产生功能蛋白所不可或缺的加工步骤。以甜菜细胞质雄性不育系DY5-CMS及其保持系DY5-O为材料,通过PCR、RT-PCR以及PCR产物直接测序等方法,对甜菜线粒体atp6基因转录本的RNA编辑位点进行了研究,以期探寻其与细胞质雄性不育之间的关系。结果表明,atp6基因转录本的保守区域共有8个编辑位点,均发生在密码子的第一、二位点上,这些位点的编辑将导致氨基酸种类的变化,如第二个编辑位点上发生的由丝氨酸(疏水参数0.8)到亮氨酸(疏水参数3.8)的转变。通过分析可看出atp6基因RNA编辑有着改变蛋白质疏水性的作用,同时它能增加物种间的保守性。     

黏类小麦细胞质雄性不育线粒体atp6基因转录本编辑位点

以黏类小麦细胞质雄性不育系ms(Kots)-90-110(A)及其近等可育基因系BC₅F₂为材料,采用克隆测序与PCR产物直接测序方法,对黏类小麦线粒体atp6基因在花药发育各阶段的RNA编辑进行了分析。结果表明,小麦atp6基因保守区DNA序列在供试材料不育系及其近等可育基因系中完全一致,且与普通小麦和提莫菲维小麦atp6基因序列同源性为99%。两种方法测序分析atp6基因转录本保守区RNA编辑的结果规律相似。atp6基因共有15个编辑位点,其中13个发生在密码子的第一和第二位点上,这些位点的编辑都使氨基酸种类发生了变化;有2个发生在密码子的第三位点上,不引起氨基酸种类的变化;其中第6和第7位点是共转录的。随着花药发育时期的推移,各位点的编辑频率逐渐增高。不育系与其近等可育基因系相比,在引入核恢复基因后,各位点的编辑频率明显提高。编辑不充分的转录产物可能会影响线粒体功能的正常发挥,表明黏类小麦细胞质雄性不育与线粒体atp6基因转录本保守区的编辑有一定的相关性。     

AtTPS03基因RNA干扰载体的构建及拟南芥转化

本研究以拟南芥DNA为模板,将罗勒烯合成酶AtTPS03基因的一个目的片段克隆到T-载体上.对克隆片段测序后,进行Blast比对,结果目的片段的序列与GenBank上报道的序列同源性达到100%.根据RNA干扰的基本原理,将目的片段正反向连到干扰载体pFGC5941查尔酮内含子的两侧,经限制性酶切和PCR扩增检测,证明已成功构建了干扰载体P-2AT03.利用农杆菌介导的浸花法转化拟南芥.收获的种子在含草丁膦的培养基上筛选抗性苗,通过对抗性苗的PCR检测,已成功获得了12株转基因苗.这些转基因苗为进一步研究罗勒烯和罗勒烯合成酶的功能奠定了良好基础.     

烟草线粒体基因atp6的SNP及其与CMS的相关性

为更好地在烟草育种中利用雄性不育,对烟草胞质雄性不育(CMS)的分子机理进行了研究。atp6基因是影响植物CMS的一个重要候选基因。本研究以7个烟草CMS系及其相应的保持系为材料,利用PCR特异引物扩增其线粒体基因atp6,通过直接测序和比对,发现atp6中A-59C、T-92C、T-185G、T-253C、T-418C、T-768C 6个核苷酸位点存在碱基变异,其中第59位、92位、185位和418位碱基的变化导致了相应位点编码氨基酸残基的改变,另两个位点(第253位和768位)为同义突变。对atp6基因中第59位A→C的突变进行了大量个体(共222个烟草植株个体)的PCR-RFLP检测及分析,结果表明,所有保持系单株的线粒体atp6基因片段都可以被Bst1107 I酶切,酶切后出现两种条带;而96%以上的雄性不育系单株的线粒体atp6基因片段部分能被Bst1107 I酶切,部分由于第59位A→C突变不能被Bst1107 I酶切,酶切后出现3种条带。说明atp6基因第59位的SNP位点与烟草CMS特性存在显著的相关性。     

直接利用PCR产物构建RNA干扰表达载体

利用RNA干扰原理可以对作物进行遗传改良.构建RNA 干扰的发夹结构一般采用在引物两端加酶切位点方法,该方法涉及酶切位点多,步骤繁琐.本试验介绍一种直接利用PCR产物进行RNAi组成型表达载体构建的方法,该载体以潮霉素为筛选标记基因,适合水稻的遗传转化.     

富有柿果ACC合成酶基因RNA干扰植物表达载体的构建

分析克隆的柿果ACC合成酶基因的序列,根据其与表达载体pSMAK311上的酶切位点设计2对带酶切位点的特异性引物,以测序质粒为模板,PCR扩增柿果ACC合成酶基因片段。双酶切PCR回收产物以及表达载体,将酶切产物定向连接构建成反义表达载体;在此基础上构建该酶基因的shRNA表达载体,由此转录的mRNA因两端序列反向互补而成发夹式RNA,因此,可应用于RNA干扰研究。将所构建好的载体转化农杆菌EHA101用于后续的遗传转化研究。     

水稻条纹叶枯病毒RNA干扰载体的构建

利用已公布的水稻条纹叶枯病毒的序列和siRNA Target Finder软件,获得了168条siRNA片段,利用这些片段在水稻基因组中BIAST(Basic local alignment search tool),最终获得6条与水稻基因组完全不匹配的干扰序列.选择其中的2条.通过化学合成干扰序列,利用pCAMBIAl301质粒构建了RNA十扰载体pASVl301-1,pASVl301-2,并成功地转化EHAl05农杆菌,为进一步转化水稻、探索利用RNA干扰技术防治水稻条纹叶枯病奠定了基础.     

基于大豆花叶病毒衣壳蛋白基因的RNA干扰植物表达载体的构建

大豆花叶病毒(Soybean mosaic virus,SMV)是马铃薯Y病毒组(Potyvirus)成员之一,大豆花叶病毒病可造成大豆10%~30%的产量损失,并严重影响大豆的品质。不同株系间致病力差异源于它们在碱基序列上的差异。采用传统的抗病育种技术育成的抗病品种抗谱窄,品种抗性可因病毒株系的变异而丢失。依靠RNA引发的基因沉默改善植物的抗病毒能力是基于RNA i(RNA inference)原理建立的植物抗病毒新策略,本研究对来源于武汉SMV分离物的CP基因和Nib基因进行了克隆,通过对保守区域的扩增,采用Gateway技术构建了大豆抗花叶病毒的RNA干扰载体。为防治大豆花叶病毒新技术的探索奠定基础。     

ahFAD2基因RNA干扰体的删除筛选标记载体构建及其遗传转化

将Napin启动子与含花生FAD2基因反向重复片段的RNA干扰结构连接,亚克隆至含雌激素诱导重组系统的植物表达载体pNCX相应位点中,构建完成由Napin启动子驱动的FAD2RNAi删除筛选标记表达载体pNCX-FAD2RNAi,经酶切鉴定,获得相应的启动子片段、FAD2RNAi片段及NCX-FAD2RNAi片段.利用农杆菌介导法进行遗传转化,已获得抗性丛生芽214丛.     

瓣化型胡萝卜雄性不育基因atp6的CAPS标记建立

根据atp6的基因序列设计特异扩增引物，以瓣化型胡萝卜核质互作雄性不育系H05A及其保持系H05B为试材，扩增获得了1条约500bp的特异扩增片段。用限制性内切酶BglII对该片段进行酶切，不育系产生1条保持系中没有的特异片段，其分子量约为60bp。建立了atp6基因的CAPS标记，该分子标记可用于胡萝卜雄性不育分子标记辅助育种。     

亚麻MS2-F基因的RNAi表达载体构建

亚麻雄性不育相关基因MS2-F在亚麻花粉发育过程中起重要的作用。为了研究其功能,构建了2个RNAi载体。选定该基因的2个不同的片段,分别以正向和反向插入到pHANNIBAL载体中PDK intron的两侧,以形成hpR-NA表达盒。然后将hpRNA表达盒插入到pART27的NotⅠ酶切位点上,成功构建了2个亚麻MS2-F基因的RNAi载体。最后将载体导入到农杆菌LBA4404中。RNAi载体成功构建,为验证MS2-F基因在亚麻花粉发育过程中的生物学功能奠定基础。     

小麦温敏不育系SCT-1育性基因初步定位分析

为明确小麦温敏不育系SCT-1的育性调控基因数量及位点,本研究以组合SCT-1×B2183的F2群体为材料,选用SSR标记和分离群体分组分析法(BSA)筛选与育性相关的分子标记,用完备区间作图法对育性进行初步QTL定位分析。研究结果显示:在2B染色体上存在2个育性调控QTLs:Qwtms-saas-2B-1(位于Xgwm374-Xgwm388间,LOD值4.521)和Qwtms-saas-2B-2(位于Xgwm388-Xbarc101间,LOD值3.115),对表型的贡献率分别为7.649%和13.865%;在5D染色体上检测到1个主效QTL Qwtms-saas-5D-1(位于Xcfd26-Xcfd29间,LOD值11.101),其贡献率达28.093%。研究表明,Qwtms-saas-2B-1与Qwtms-saas-5D-1在成都和新都均能检测到,是育性调控较为可靠的位点。本研究初步定位小麦温敏不育系SCT-1在2B和5D上的育性调控QTLs,可为进一步精确定位奠定基础。     

胡萝卜atp8基因的克隆表达及细胞质雄性不育的相关性研究

摘 要：线粒体基因重组而形成的异常开放阅读框的表达导致了植物的细胞质雄性不育现象,在这种现象的研究中具有重要的意义。本研究分离克隆了胡萝卜细胞质雄性不育相关的线粒体基因片段,并利用半定量RT-PCR和Real-time PCR技术研究了该基因在不育系和相应保持系中的表达情况。结果表明,与不育系相比,胡萝卜保持系atp8基因序列在30 bp-170 bp之间核苷酸突变很多,且在154 bp-162 bp发生了缺失。Blast分析发现保持系atp8基因与胡萝卜nad6基因的同源性高达100%。表达分析表明,atp8基因在不育系花蕾的前五个时期表达量都明显低于相应的保持系,而在盛花期的表达量与保持系趋于一致。推测atp8基因的异常表达与胡萝卜细胞质雄性不育有着密切关系。     

水稻细胞质雄性不育及其育性恢复基因的研究进展

细胞质雄性不育（cytoplasmic male sterility,CMS）及育性恢复（restorer of fertility,Rf）是作物杂种优势利用的有效途径之一,由线粒体不育基因和核恢复基因互作产生。本文综述了水稻CMS和Rf基因的来源及其分子遗传机理,并展望了水稻CMS和Rf系统在水稻育种方面的应用。     

苎麻雄性不育种质的鉴定分类研究

此文对21份雄性不育种质进行了田间观察,花粉活力测定,自交种子发芽实验和天然杂交种子发芽试验的研究。结果表明,21份种质按照田间生长表现可以分为雄花萎缩型,雄花不开裂,雄花开放型和环境敏感型4类。对于雄花开放的15份种质经过花粉活力鉴定（I2-KI法和蔗糖培养法）和自交种子发芽实验,发现有3份种质的花粉是严格不育的,讨论后笔者把21份苎麻种质归为4类,即雄花萎缩型,雄花不开裂型,花粉不育型,待定型,另外对苎麻种质的鉴定进行了讨论,并提出了未来研究的方向。     

瓣化型胡萝卜胞质雄性不育相关片段的分离及序列分析

以128对引物组合对瓣化型胡萝卜胞质雄性不育系和保持系进行cDNA-AFLP分析，筛选与不育性相关的特异片段，对其中两个表达丰度较高的cDNA差异片段进行克隆测序。序列分析表明BY1949与拟南芥质子依赖性的类肽转运蛋白在核苷酸水平有87%的同源性，蛋白质水平有58%的同源性。BY2562与瓣化型胞质雄性不育（CMS）胡萝卜线粒体ATP8、ATP9、NAD6和cob-sp基因在核苷酸水平有99%的同源性，期望值为0.0；在蛋白质水平与CMS向日葵线粒体ORFB基因，COXIII 5'端未知蛋白YMF19以及CMS胡萝卜ATP-8，orfB-F1有97%的同源性；另外与胡萝卜orfB-CMS、orfB-F2、烟草orfB、油菜orf224、拟南芥线粒体orfB、萝卜orf158以及芥菜线粒体膜蛋白、甘蓝型油菜orf474也有90%以上的同源性。