马传染性贫血病毒弱毒株LTR点突变型嵌合感染性克隆的构建

马传染性贫血病毒（Equine infectious anemia virus,EIAV）长末端重复序列（Long terminal repeat,LTR）是基因组中高度变异区之一,EIAV LTR的变异对于指导病毒的复制和病毒致病性具有重要的生物学意义。为了阐明我国马传染性贫血病毒弱毒疫苗毒力致弱的分子机制,由马传贫强毒至弱毒致弱过程中不同代次毒株LTR序列的分析,以驴胎皮肤弱毒株疫苗全长感染性克隆pLGFD3-8为父本,选取LTR R区的TAR起始碱基,poly（A）附加位点,采用反向遗传操作对其位点进行PCR体外定点突变,将弱毒序列构建的逆向点突变型全基因克隆转染到驴胎皮肤细胞（FDD）并在FDD上传代,通过逆转录酶活性（RT）检测、RT-PCR方法及real-time RT PCR检测并验证其感染性。检测结果为构建的逆向点突变型感染性克隆在FDD上被拯救,其衍生病毒感染的FDD上出现明显的细胞病变;细胞培养上清可检测到RT酶活性和RT-PCR阳性;电镜下可见大量典型的EIAV颗粒pLGFD-M点突变型嵌合克隆衍生病毒与其父本克隆衍生病毒pLGFD3-8复制水平相似。此结果为进一步深入研究LTR对马传染性贫血病毒复制水平和毒力的影响奠定了基础。     

带有组氨酸标签的马传染性贫血病毒感染性分子克隆的构建

马传染性贫血(EIA)弱毒疫苗的广泛使用存在野毒和疫苗毒鉴别困难的问题.本研究以已构建的马传染性贫血驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆(pOK8266)为基础,在其S2基因内引入NspV酶切位点,将人工合成的编码6个组氨酸的寡核苷酸插入NspV位点,获得带有组氨酸标签的重组质粒pOK8266-HIS.将pOK8266-HIS转染驴白细胞,将驴白细胞转染产物传至第6代时,在电镜下观察到了典型的马传染性贫血病毒粒子.提取pOK8266-HIS衍生病毒的前病毒基因组DNA,通过PCR扩增和测序表明,衍生病毒基因组中引入了6个组氨酸标签,从而获得了带有分子标志的马传染性贫血弱毒疫苗株,为野毒株和疫苗病毒的鉴别诊断奠定了基础.本研究还证明了S2基因中的插入突变并不影响马传染性贫血病毒的体外复制.     

S2基因失活突变马传染性贫血病毒感染性克隆的构建及感染性研究

为研制马传染性贫血病毒(EIAV)标记疫苗株,本研究在EIAV驴胎皮肤(FDD)细胞弱毒疫苗株感染性克隆pEIAVFDDV3-8的S2基因内部引入两个终止密码子,致使S2基因终止表达,构建了一株S2基因突变的感染性克隆pEIAVFDDV3-8△S2。用该重组质粒转染FDD细胞,盲传至第4代时,转染细胞病变明显,电镜下可见细胞内的典型病毒颗粒。反转录酶活性检测和Real-time PCR对病毒拷贝数的检测均证明,获得了EIAVS2基因终止表达的感染性克隆毒株,命名为EIAVFDDV3-8△S2。     

马传染性贫血病毒囊膜基因gp90V3区糖化回复突变感染性克隆的构建

为阐明我国马传染性贫血病毒（Equine infectious anemia virus,EIAV）弱毒疫苗致弱及免疫保护的分子机制,作者分析了疫苗株及其亲本强毒株共34个囊膜基因序列。结果发现疫苗株在膜基因gp90V3区的潜在N-连接糖基化位点出现稳定的碱基替换,使该位点消失。为研究囊膜糖基化的作用,以疫苗株全长感染性克隆pLG—FD3—8为亲本,利用反向遗传技术对该突变位点进行糖基化序列回复操作,构建全基因感染性克隆pLGFDg5。将pLGFDg5转染驴胎皮肤细胞（FDD）,通过逆转录酶活性和RT-PCR方法评价其感染性。结果表明,将pLGFDg5在FDD细胞中盲传3代后,可在细胞培养上清中检测到逆转录酶活性,用RT—PCR检测到EIAV保守基因片段,在电镜下可见典型的EIAV粒子。在FDD细胞上的病毒复制动力学分析显示,与其亲本克隆pLGFD3—8的衍生病毒pLGFD3-V相比,回复突变克隆衍生的pLGFDg5-V复制速度较慢,获得较低的病毒载量。体外抗体中和试验表明,与其亲本pLGFD3-V相比,引入潜在的糖基化位点g5降低了衍生病毒对中和抗体的敏感性。这一结果为N-连接糖基化在我国马传贫弱毒疫苗致弱机理的作用研究提供了重要依据。     

马传染性贫血病毒囊膜基因gp90 V4区糖基化回复突变感染性克隆的构建

为了阐明我国马传染性贫血病毒(EIAV)弱毒疫苗致弱及免疫保护的分子机制,本研究分析了疫苗株及其亲本强毒株共34个囊膜基因序列.结果发现疫苗株在膜基因gp90 V4区潜在的N-连接糖基化位点出现了稳定的碱基替换,使该位点消失.为研究囊膜糖基化的作用,以疫苗株全长感染性克隆pLGFD3-8为亲本,利用反向遗传技术对该突变位点进行了糖基化序列回复突变操作,构建了全基因感染性克隆pLGFDg9.将其转染驴胎皮肤细胞(FDD).通过用逆转录酶活性、间接免疫荧光和RT-PCR方法检测而确定其感染性.结果表明,在FDD细胞中盲传3代后,在细胞培养物中可检测到逆转录酶活性,RT-PCR和间接免疫荧光检测均呈阳性,电镜下见到典型的EIAV颗粒.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒弱毒疫苗和变异株灭活疫苗的免疫效果评价

分别采用猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)CH-1R致弱毒疫苗株和变异毒株灭活疫苗免疫接种40日龄～45日龄仔猪,免疫接种后4周,用高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)HuN-4变异株强毒攻毒,攻毒后21 d剖检,取主要器官作病理组织学观察和病毒抗原定位.结果显示变异毒株灭活疫苗免疫攻毒后导致的病理变化和病毒抗原分布程度均明显高于CH-1R弱毒疫苗免疫组.免疫病理学研究结果表明CH-1R 弱毒疫苗对HU-4株强毒免疫保护效果好于变异毒株灭活疫苗.     

猪繁殖与呼吸综合征病毒强、弱毒株Nsp9基因的反向遗传学替换改造

猪繁殖与呼吸综合征病毒（porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV）Nsp9基因编码RNA依赖的RNA聚合酶,在病毒复制中发挥重要作用。为了探索Nsp9基因与病毒的毒力、复制能力及细胞嗜性的相关性,本研究利用反向遗传学技术将PRRSV弱毒疫苗毒CH-1R的Nsp9基因进行克隆,酶切后连接到强毒株XH-GD的感染性克隆上,进行病毒的拯救。结果表明,成功构建替换了CH-1R Nsp9基因的重组病毒。对重组病毒的生物学特性研究发现,拯救病毒的生长速度和病毒滴度明显高于亲本毒株rXH-GD,但是低于疫苗毒CH-1R,重组毒株的噬斑大小与CH-1R相似,初步推测疫苗株CH-1R的聚合酶有助于提高病毒的滴度。本试验为进一步研究Nsp9基因对病毒毒力的影响奠定基础。     

H9N2 AIV HA蛋白S145N变异毒株的抗原性和免疫原性

在研究1998-2008年中国H9N2亚型禽流感病毒（AIV）分离株HA基因的进化时,发现在25个毒株中有2个致病性最强的毒株因HA基因第145位氨基酸的突变导致产生1个潜在的糖基化位点,从而使其不与单抗H6、F6等反应。为进一步探究这类变异毒株HA基因变异对H9亚型AIV的抗原性和免疫原性的影响,本试验对12株HA蛋白S145N变异的H9N2AIV进行了交叉中和试验和交叉攻毒试验。结果显示,不同H9N2S145N变异株与疫苗株间在抗原性上变化不大,或无显著差异（0.5≤R≤0.67）。但参照现有的H9灭活疫苗效力检验方法对HP疫苗免疫鸡进行攻毒,用HP株攻毒对照组0/5保护,免疫组保护≥9/10,达到了H9灭活疫苗质量标准要求;但用S145N变异株N3攻毒,仅保护2/10～6/10,且随免疫量剂量的增加,抗体水平的提高,攻毒保护也依次升高。对H9变异株疫苗（N1、N2、N3、N8）免疫鸡用N3攻毒,仅保护2/5～4/5,N3同源抗体也不能有效地阻止其攻毒后的排毒。用N3、N6 2个变异株交叉攻毒,采用与疫苗株攻毒相同的剂量作攻毒试验也得到类似结果。表明高于6log2的抗体能抵抗疫苗株和大多数流行毒株攻毒后的排毒,但不能抵抗S145N变异株攻毒后的排毒。这类毒株免疫原性上的变化与病毒HA基因的变异密切相关。因HA基因145～147aa位增加了1个NGT,导致三维空间构象的变化,并影响其邻近的受体结合位点,从而使这类毒株致病性提高,免原性发生改变。虽然这一类变异株或免疫逃逸毒株仅占当前流行毒株总数的5%～7%,但在强大的免疫压力和自然选择下有可能逐步成为优势毒株,造成更大的危害,这为该病的防控提出了新的挑战。     

鹅源副黏病毒致弱株的“拯救”及分子生物学鉴定

以本课题组前期构建的鹅源副黏病毒NA-1株的全长感染性克隆为模板设计2对引物,用overlap PCR方法将其F蛋白裂解位点处的112、115和117位碱性氨基酸定点突变成为具有典型弱毒株特征的非碱性氨基酸。随后将突变后的F基因序列替换全长感染性克隆的对应序列,构建突变后的克隆质粒FL-cDNA-F′。将改造后的感染性克隆质粒与pCI-NP、pCI-P和pCI-L 3个辅助表达质粒共转染VT7细胞系,成功拯救出了致弱的鹅源副黏病毒。经过分子生物学鉴定,该毒株F基因序列具有典型的弱毒株特征。救获病毒的鸡胚最小致死剂量平均死亡时间(MDT)为96h,表明救获的病毒毒力已被成功致弱,可以作为当前流行的鹅副黏病毒病的一个较为理想的疫苗候选株。     

鸡传染性支气管炎病毒强毒株和弱毒疫苗株的免疫磁珠-多重RT-PCR鉴别方法的建立

利用鸡传染性支气管炎病毒(IBV)多克隆抗体构建的免疫磁珠富集IBV,对Gen Bank中896株IBV S1基因序列及其多变区进行分析,根据IBV强毒株和弱毒疫苗株序列差异设计引物,建立了一种基于免疫磁珠富集IBV后检测S1基因多变区的多重RT-PCR方法。结果表明:该方法能扩增出强毒株约710 bp的通用片段和约350 bp的特异片段,弱毒疫苗株能扩增出约710 bp的通用片段和约210 bp的特异片段,能鉴别出强毒株和弱毒疫苗株。免疫磁珠富集IBV后比不富集病毒用RT-PCR方法检测敏感性提高100倍。该方法为IBV检测提供了新的技术支持。     

马传染性贫血病毒疫苗致弱过程中不同代次毒株LTR序列变异

有研究认为病毒基因组长末端重复序列LTR与病毒的毒力和复制能力直接相关.中国马传染性贫血弱毒疫苗是由一株高致病力毒株经体外白细胞传代而致弱的疫苗.经过体外超过110代传代后,病毒丧失了对马高致死性毒力并保持了良好的免疫原性.本文对传代过程中的不同代次病毒基因LTR进行了克隆和序列测定,发现传代过程中LTR发生了一系列明确的变异,一是转录起始位点在64代之前均以GGAC为特征,64代之后则表现为不规律的GAAC,AAAC,AGAC或GGTC;二是TAR起始碱基在59代之前多数为A,而64代之后均为G;三是在45代之后(55代除外),poly(A)附加位点一致表现为AA,这种一致的核苷酸变化均发生在毒力明显降低的代次,提示这些突变引起的位点或结构变化很可能与病毒毒力减弱有直接关系.     

马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株致弱过程中不同代次病毒LTR的进化分析

为揭示马传染性贫血病毒(EIAV)弱毒疫苗的减毒机理,本研究对EIAV弱毒疫苗株在体外驴白细胞传代过程中不同代次毒株的长末端重复序列(LTR)进行扩增和分析。结果显示:随着病毒在体外传代次数的增加,各病毒株遗传多样性逐渐增加,并与致弱前亲本株EIAVDV117的遗传距离逐渐增大;EIAV在体外传代过程中LTR的变异主要集中在U3区和R区的转录起始位点,但随着传代次数的增加,在负调节区丢失了GATA结合位点,并在增强子区出现了E-box基序。此外,传代初期低代次病毒株与后期的高代次弱毒株在负调节区的AP-1结合位点和转录起始位点以及TAR的起始位点存在明显差异。     

马传染性贫血病毒弱毒疫苗S2基因在体内变异分析

为研究马传染性贫血病毒(EIAV)驴白细胞弱毒疫苗EIAVDLV121的S2基因在马体内的变异规律,本研究选用4匹成年马,其中2匹(#1、#2)接种EIAVDLV121,另外2匹作为对照.免疫后监测马体温、血小板含量以及病毒载量结果显示,免疫马未出现马传染性贫血体征.通过RT-PCR方法检测病毒S2基因在感染马体内不同时期的基因序列,结果显示,免疫马体内EIAVDLV121 S2蛋白的突变主要发生在氨基酸第17位、22位、39位、41位、51位和55位.另外,#1马免疫后70 d以及#2马免疫后第14 d和第28 d检测疫苗毒S2蛋白序列与EIAVDLV121亲缘关系较近,而#1马免疫后第42 d、第112 d和第140 d的疫苗毒S2蛋白序列与EIAVDLV121的致病性亲本强毒株EIAVDN40亲缘关系最近.本研究结果有助于对EIAV及EIAV疫苗株在马体内感染进程的研究.     

马传染性贫血病毒自然感染马LTR序列分析

我国从20世纪70年代开始使用EIAV弱毒疫苗后,在全国范围内基本控制了马传贫的发生,我们从现地少数EIAV琼扩阳性马外周血中扩增并克隆了二株EIAV前病毒5'LTR序列,并与国内外毒株5'LTR序列进行了比较分析,发现中国EIAV LTR特有的特异性细胞转录因子结合基序,同时发现PEA2位点不是强毒特有的基序,在弱毒中亦发现该基序.     

马传贫驴白细胞弱毒疫苗株基质蛋白基因的克隆与表达

从感染驴白细胞的马传贫驴白细胞弱毒疫苗株前病毒DNA中克隆了编码基质蛋白（p15)的基因，并在大肠杆菌中进行了表达，所表达的蛋白是一种可溶性的融合蛋白，其氨基端带有6个组氨酸的标签，因此可以用固定化金属离子亲和层析法在非变性条件下进行纯化，在间接ELISA和免疫印迹试验中，重组的基质蛋白可与马传贫阳性血清样品发生反应，而与健康马血清无任何反应，这表明该重组蛋白具有良好的抗原性和特异性，可用于马传贫弱毒疫苗株在体内外复制及在接种马体人免疫应答的研究中。     

马传染性贫血病病毒弱毒疫苗株感染性分子克隆的构建

采用ＰＣＲ方法分三段扩增出马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株（ＥＬＡＶ　 ＤＬＡ）的前病毒ＤＮＡ,这三个片段覆盖马传染性贫血病毒的全部基因组,ＰＣＲ产物经克隆后顺次连接,获得一个含有ＥＬＡＶ全基因（８．０Ｋｂ）的重组质粒,将其命名为ｐ８．０。将此８．０Ｋｂ ＥＩＡＶ全基因再亚克隆到含有一完整 ＥＩＡＶ ＤＬＡ株长末端重复序列的质粒中,获得一含有 ＥＩＡＶ驴白细胞弱毒前病毒全基因的重组质粒,将其命名为ｐ８．２,经核苷酸序列分析,证明ｐ８．２含有ＥＩＡＶ前病毒的全基因。用ｐ８．２转染驴白细胞,将其作为种毒进行传代,于感染该克隆毒的细胞培养上清中检测出了反转录酶,说明在驴白细胞中由ｐ８．２衍生出了ＥＩＡ病毒。驴白细胞经该克隆毒感染后,第４天出现病变,经透射电镜可观察到典型的马传染性贫血病毒粒子,进一步证明ｐ８．２具有感染性,我们获得了马传染性贫血病毒驴白细胞弱毒疫苗株的感染性分子克隆,为进一步在分子水平上阐明我国ＥＩＡＶ疫苗株的减毒机理和免疫保护机制奠定了基础。     

通过暂时免疫抑制研究跨膜蛋白C末端缺失对EIAV疫苗株EIAV_(FDDV12)体内复制的影响

马传染性贫血病毒(EIAV)减毒疫苗是世界首例慢病毒疫苗,但其作用机理尚不明了。我们的前期研究发现EIAV疫苗株EIAVFDDV12编码跨膜蛋白gp45的基因在马体内发生高频率G2230A点突变形成终止子,使该蛋白C末端出现154个氨基酸的截短。为了探讨该截短蛋白对EIAV疫苗株生物学特性的作用,本研究以EIAV弱毒疫苗株感染性克隆基础上,构建了gp45截短型感染性克隆,脂质体转染细胞,增殖传代,获得病毒株EIAVFDDVTM-36,接种到马体内。在接种后167 d内未观察到临床症状,连续注射10 d地塞米松以暂时抑制免疫系统,并用迟发性超敏反应和淋巴细胞增殖实验评价免疫抑制效果。结果显示,截短型跨膜蛋白疫苗株EIAVFDDVTM-36接种组免疫抑制前后病毒载量和中和抗体效价差异不显著,而完整型跨膜蛋白疫苗株感染性克隆EIAVFDDVTM-45接种组4匹马中3匹免疫抑制后病毒载量显著上升,同时组内中和抗体效价明显提高。以上结果表明,马体特异性免疫压力对EIAVFDDVTM-36复制无影响,而对亲本株EIAVFDDVTM-45复制有抑制,显示跨膜蛋白截短型EIAV作为疫苗更为安全。但免疫抑制造成的gp45跨膜蛋白未截短型疫苗株感染性克隆体内病毒载量升高,可以促使机体产生更高的中和抗体效价,提示该疫苗的安全性和有效性在一定程度内呈负相关(相互制约)。因此,安全性和有效性的平衡是慢病毒减毒疫苗研发需注意的重要因素。