鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株在鸭胚成纤维细胞中形态发生学的研究

采用超薄切片和透射电子显微镜技术对鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株（DEV-CHv）在鸭胚成纤维细胞（DEF）中的形态发生学进行了研究。结果表明，DEV-CHv吸附到DEF细胞上以后通过囊膜和细胞膜间发生融合的方式侵入宿主细胞；病毒在细胞核内完成病毒核酸的生成、核酸与衣壳的装配；病毒核衣壳通过核膜-内质网膜系统从细胞核转运到内质网池中并在内质网池中得到皮层结构；获得了皮层的DEV-CHv核衣壳通过出芽方式释放到细胞空泡内得到囊膜结构后成为成熟病毒；细胞空泡内的成熟DEV-CHv可通过细胞的胞吐作用被释放到细胞外，或在空泡破裂时被释放到细胞外。     

鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株感染鸭胚成纤维细胞的超微结构观察

通过超薄切片和透射电子显微镜技术对鸭病毒性肠炎病毒（DEV）CH强毒株在鸭胚成纤维细胞（DEF）中的形态结构进行了研究。结果发现，DEVCH强毒株病毒核酸呈圆形颗粒状，直径35～45nm，在胞核内常集中分布；病毒核衣壳呈圆形．直径90～100nm．在胞核和胞浆内都有分布；DEV核衣壳可根据所含核酸形态的差异分为空心核衣壳、内壁附有颗粒型核衣壳、同心圆形核衣壳和实心核衣壳；成熟的病毒粒子具有囊膜和皮层结构．呈圆形．直径150～300nm，存在于胞浆空泡内；DEV可在DEF中分别形成胞浆内和胞核内包涵体结构；伴随子代病毒在细胞内的出现，胞浆内迁出现豆英状、马蹄形、半圆形、圆形、同心圆形等与病毒发生有关的电子致密结构。     

鸭病毒性肠炎病毒致鸭胚成纤维细胞发生凋亡作用的研究

研究通过HE染色镜检发现,鸭病毒性肠炎病毒CH强毒株(DEV-CHv)可致鸭胚成纤维细胞(DEF)出现染色质颗粒化、细胞核变形等显著凋亡特征;TUNEL试验显示,接毒组细胞核内有多量棕黄色DAB显色颗粒,表明细胞出现了凋亡现象;DNA Ladder检测表明,接毒组细胞具有分子量分别为180～200bp及其整数倍的凋亡梯带电泳图谱特征;电镜观察发现,接毒组细胞具有染色质浓缩、边移,胞浆严重空泡化,细胞核严重变形,形成凋亡小体等典型凋亡特征.上述研究结果表明鸭病毒性肠炎病毒具有显著的致鸭胚成纤维细胞发生凋亡的作用.     

雏鹅新型病毒性肠炎病毒对鸭胚成纤维细胞的适应性及增殖特性

为了获得适宜雏鹅新型病毒性肠炎病毒（NGVEV）体外培养的细胞系，开展了NGVEV强毒株在鸭胚成纤维细胞（DEF）适应性和增殖特性的研究。结果表明，NGVEV强毒株经尿囊腔接种10日龄鸭胚传4代，取尿囊液接种DEF，第1代无明显细胞病变；第2代培养至72～96hDEF出现颗粒状缺失、脱落，但无典型蚀斑出现；第3代培养至96～120h，DEF形成大小不等、圆形或椭圆形的典型蚀斑；第5代以后的NGVEV可稳定适应于DEF，典型细胞病变出现于48～72h。取适应DEF的NGVEV感染DEF细胞后制作超薄切片经电镜观察，可见典型的腺病毒粒子，大小为70～90nm。NGVEV在DEF上的TCID5。值随着传代次数增加而增高，由第1代的10^1.23增加到第8代的10^8.02，最高毒价出现于96～144h，96～120h是收获病毒的最佳时间。     

鸭肝炎病毒在鸭胚成纤维细胞上的适应性研究

将鸭肝炎病毒(DHV)E53鸡胚致弱株适应鸭胚成纤维细胞(DEF),连续传代至第16代时出现细胞病变(CPE),第21代时CPE呈现规律性,接毒后72 h CPE达80％,其病变特征是细胞间隙增宽、细胞崩解死亡、脱落.经病毒细胞培养物滴度测定、RT-PCR检测和间接免疫荧光法鉴定,证明DHVE53株能够在DEF上增殖.     

鸡胚成纤维细胞培养鸭瘟病毒的试验

将鸭瘟病毒强毒（DPV34）经12日龄鸭胚连续传2代，收获的尿囊液DPV34F2作为细胞培养的病毒接种于鸡胚成纤维细胞，连续传代5次。结果，从第2代开始，接种DPV的鸡胚成纤维细胞出现细胞病变，随首代次的增加，细胞病变愈加明显。经电镜观察，第5代细胞培养物中有典型的DPV病毒粒子；将第5代培养物接种鸭胚，出现典型鸭瘟病变；用PCR方法检测培养物，也出现DPV的特征DNA带。     

鸭肿头出血症病毒在鸭胚原代成纤维细胞中增殖特性的研究

将鸭肿头出血症病毒（DSHDV）强毒株经尿囊腔接种10日龄鸭胚，传3代，取第3代尿囊液接种鸭胚成纤维细胞（DEF），传代培养至有细胞病变出现，并对接毒细胞进行TCID50动态检测和透射电镜观察。结果显示，第1代接毒细胞培养至120h出现变圆、脱落，并形成少量蚀斑，第2代培养至96～120h，DEF形成大量圆形或椭圆形的典型蚀斑，第3代培养至72～96h，DEF出现典型蚀斑；此后可稳定适应于DEF，典型细胞病变出现于72～96h。DSHDV在DEF上的TCID50值随传代次数的增加而增高，由第1代的10^2.72增加到第10代的10^6.82，最高毒价出现于96h，该点是收获病毒的最佳时间。经透射电镜观察，可见DSHDV粒子呈球形或椭圆形，大小为60～75nm，无囊膜，具有双层衣壳。结果证实，DSHDV强毒株已经适应了DEF，传代后可获得较高的病毒效价。     

鸭肝炎病毒A66弱毒株在鸡胚成纤维细胞上的培养

将鸡胚致弱的鸭肝炎病毒 ( DH V) A6 6 株接种于鸡胚成纤维细胞 ( CEF)进行细胞培养 ,通过对细胞培养物进行病毒滴度测定、鸡胚中和试验和电镜检查 ,证明了 DHV A6 6 毒株能够在 CEF上增殖。试验还表明 ,犊牛血清对 DH V增殖具有明显的抑制作用。此外 ,还根据细胞培养物病毒滴度测定结果绘制出了病毒在 CEF上的生长曲线。     

鸭肝炎病毒A66弱毒株在鸡胚成纤维细胞上的培养：张小飞

将鸡胚致弱的鸭肝炎病毒（ＤＨＶ）Ａ６６侏接种于鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）进行细胞培养,通过对细胞培养物进行病毒滴度测定、鸡胚中和试验和电镜检查,证明了ＤＨＶＡ６６毒株能够在ＣＥＦ上增殖。试验还表明,犊牛血清对ＤＨＶ增殖具有明显的抑制作用。此外,还根据细胞培养物病毒滴度毒滴度测定结果绘制出了病毒在ＣＥＦ上的生长曲线。     

鸭胚成纤维细胞培养技术的改良

细胞培养技术是现代生物科学中发展十分迅速的一种实验技术,从20世纪初被创立以来,在细胞学、遗传学、病毒学、免疫学和基因功能组学等多领域中扮演重要角色.笔者通过实践对鸭胚成纤维细胞培养技术的改良与探索,发现采用半胚不过滤法可以快速简单有效地制备大量活鸭胚成纤维细胞.     

鸭病毒性肠炎病毒基因组异构体的研究

为研究鸭病毒性肠炎病毒(DEV)基因组异构体的存在形式,本研究在已建立的以pCC1FOS为载体的DEV疫苗株基因文库基础上对DEV全序列进行了测定,并进一步对DEV基因组的异构体进行了研究。对261个重组fosmid中的DEV基因组片段的末端序列进行测序及序列分析,初步证明了DEV基因组有3种异构体,即P型、IS型和ILS型,未发现IL型的存在。并且,以上3种异构体在基因组中所占比例分别为77.1%、8.6%和14.3%。通过对11个重组fosmid的全序列测定,进一步确认了以上3种异构体的存在。该结果为DEV的分类提供了重要实验依据。     

鸭病毒性肠炎病毒的提纯及其结构蛋白SDS-PAGE分析

将鸭病毒性肠炎病毒（DEV）分离株SC-1经鸭胚成纤维细胞培养增殖后，采用差速离心结合蔗糖不连续密度梯度离心法进行提纯，获得多量、纯净的完整病毒粒子。病毒粒子主要位于40％～50％蔗糖层交界处，电镜下可观察到DEV具有典型的疱疹病毒特征，完整病毒粒子由囊膜、衣壳和核芯3个部分组成，直径为170～190nm。将纯化的DEV粒子经SDS—PAGE分析，发现其结构蛋白由11种多肽组成，即VP1（190000）、VP2（136000）、VP3（106000）、VP4（88000）、VP5（75000）、VP6（68000）、VP7（56000）、VP8（48000）、VP9（42000）、VP10（38000）和VP11（32000）．其中VP1、VP2、VP3、VP6、VP8和VP9等6条蛋白区带的相对百分含量较高，约占病毒结构蛋白总量的89．04％，为DEV的主要结构多肽。     

传染性支气管炎病毒在鸡胚成纤维细胞中适应及复制的生物学特性研究

将传染性支气管郯病毒ＩＢＶ－ＮＨ、Ｔ、Ｈ５２、Ｍ４１适应鸡胚成纤维细胞（ＣＥＦ）,连续传代获得毒价稳定细胞适应毒并对其生物学特性进行研究。观察了ＩＢＶ致ＣＥＦ细胞病变效应的特征,测定ＴＣＩＤ５０滴度为１０６．０～１０６．０。细胞培养病毒提纯后负染置电镜下进行形态学观察,见到典型的冠状病毒粒子。病毒经胰酶处理显示出血凝特性,该血凝性能被特异性血清所抑制。表明ＣＥＦ细胞病变（ＣＰＥ）确为ＩＢＶ所致。通过对４株ＩＢＶ在ＣＥＦ细胞中最佳培养时间及繁殖量关系的摸索,证实了３６～７２ｈ释放到培养液中有活性的病毒粒子达高峰,ＴＣＩＤ５０最高可达１０７．０／ｍｌ。     

微量多孔板上培养鸡胚成纤维细胞及病毒的检测

利用９６孔软塑微量多孔板培养鸡胚成纤维细胞单层，效果良好，并在其上测菜病毒国外株毒价及中和试验，结果与玻璃细胞培养瓶所测一致，同时摸索出一套具体实施方法，对用过的多孔板，经适当的酸浸，冲洗及紫外线灭菌等处理，仍可正常重复使用，因此，该方法可以取代培养瓶。     

复方中药“禽康散”对鸭瘟病毒感染鸭胚及成纤维细胞的保护效应

将不同浓度复方中药“禽康散”和鸭瘟病毒(Duck plague virus,DPV)分别以不同方式接种到鸭胚尿囊膜后观察其对DPV感染的鸭胚保护率;用MTT法测定“禽康散”对鸭胚成纤维细胞(DEF)的安全质量浓度和增殖的影响,及安全质量浓度范围内的“禽康散”对DPV感染鸭胚成纤维细胞(DEF)能力的影响.结果显示,“禽康散”在10日龄鸭胚内对DPV具有显著的杀灭和阻断感染的作用.“禽康散”对DEF的最大安全质量浓度为2-4 g/mL,在2-4～2-8 g/mL质量浓度范围内对DEF有显著的增殖和抑制DPV感染DEF的能力,且与加药方式和药物质量浓度有一定关系.结果表明,一定质量浓度的“禽康散”对DEF具有增殖作用,并对DPV在鸭胚内和细胞水平上均有较好的杀灭和拮抗作用.     

新城疫病毒Ⅰ系毒株通过Caspase途径诱导鸡胚成纤维细胞凋亡

应用不同Caspases抑制剂研究了新城疲病毒（NDV）Ⅰ系毒株诱导鸡胚成纤维细胞（CEF）凋亡的途径。结果，用20μmol／L的Z—VAD．fmk、Z—IETD．fmk和Z—LEHD．fmk分别处理CEF后，均能抑制NDVⅠ系毒株诱导的CEF凋亡；而用20μmol／L的Z—DEVD．fmk和Z—AEVD．fmk分别处理CEF,则不能抑制NDVⅠ系毒株诱导的CEF凋亡。由此表明，NDVⅠ系毒株能通过Caspase依赖性途径诱导CEF凋亡，其中Caspase-8和Caspase-9在凋亡中发挥重要作用，而Caspase-3和Caspase-10在凋亡中不发挥作用。     

中草药在鸡胚成纤维细胞(CEF)上对新城疫病毒的作用研究

分离并培养鸡胚成纤维细胞(CEF),并感染新城疫病毒(NDV),通过观察细胞病变,检测在CEF上,复方中草药对NDV的影响。结果表明,中草药对新城疫病毒的中和、预防、治疗作用的最小抗病毒浓度分别是0.061mg/ml、0.244mg/ml、0.976mg/ml。     

鸭肠炎病毒gL蛋白在鸡胚成纤维细胞中动态表达的检测

为研究鸭肠炎病毒(DEV)gL蛋白在感染鸡胚成纤维细胞(CEF)过程中的表达情况,本研究以DEVClone-03基因组为模板,应用PCR方法分别扩增得到截短的(gLt,181 bp～711 bp)和全长的gL(1 bp～711 bp)两个基因片段。将gLt基因片段克隆至pET-30a原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3),经IPTG诱导表达并对表达产物进行纯化复性,免疫BALB/c小鼠,制备鼠抗gL蛋白多克隆抗体。同时将全长gL基因克隆至真核表达载体pcDNA3.1(+),构建真核表达重组质粒pcDNA-gL,转染293T细胞。采用获得的抗gL蛋白抗体检测DEV感染CEF后及真核表达质粒pcDNA-gL转染293T细胞后gL蛋白在不同时间点的表达情况。结果表明,在pcDNA-gL转染293T细胞后12 h应用western blot方法能够检测到gL蛋白的表达,其表达量随着转染时间增加而增加;在病毒感染CEF后24 h应用间接免疫荧光方法能够检测到gL蛋白少量的表达,western blot方法在病毒感染CEF48 h后检测到gL蛋白的表达,其表达量随着病毒感染时间增加而增加。上述结果提示,编码gL蛋白基因可能是病毒复制的晚期表达基因。     

鸭胚成纤维细胞酵母双杂交cDNA文库的构建与鉴定

为了解与坦布苏病毒(TMUV)E蛋白相互作用的宿主细胞蛋白,本试验制备鸭胚成纤维细胞(DEF)。采用Trizol法提取细胞总RNA,通过LD-PCR技术合成双链cDNA,经CHROMA SPIN TE-400column纯化后,与pGADT7载体连接,利用同源重组的方法克隆到Y187酵母感受态细胞,构建了鸭胚成纤维细胞的cDNA文库。结果显示:构建的文库滴度为3×107 CFU/mL,文库插入的双链cDNA片段为0.5~2.5kb,平均约为1.5kb,符合酵母双杂交筛选的要求。