S100A16蛋白多克隆抗体表达条件的优化

探索优化并构建S100A16原核表达载体、制备S100A16蛋白多克隆抗体的条件。试验方法为,将RT－PCR扩增得到的小鼠肝脏组织的S100A16基因克隆片段连接到带有His标签的原核表达载体pET－28a多克隆位点,并转化大肠杆菌BL21（DE3）,用不同温度、不同浓度IPTG（异丙基－β－D－硫代半乳糖苷）诱导融合蛋白表达,通过亲和层析柱纯化获得纯化的蛋白质。经免疫动物得到His－S100A16抗血清,通过免疫亲和层析获得了具有高度特异性抗体,通过Western Blot和Elisa检测抗体的特异性和效价,结果表明,在温度25℃、IPTG浓度为0．2 mmol／L的条件下,可溶性蛋白的表达效果较好。     

SARS病毒S蛋白S1和S2片段的合成及在大肠杆菌中的表达

[目的]通过拼接完成对SARS S蛋白的上下游序列S1和S2的合成,并在大肠杆菌中表达,获得具活性的S1和S2蛋白。[方法]利用不对称PCR方法以及采用设计酶切位点将2个片段连接的方法合成SARS香港株S蛋白上下游2个片段S1和S2;构建S1和S2这2个基因片段的原核表达载体,pET28a-S1和pET28a-S2,并转化BL21表达菌株,然后用IPTG诱导目的基因的表达并提取纯化目的蛋白。[结果]连接得到S1和S2这2个基因片段,并成功地在大肠杆菌中得到表达。[结论]该研究为后续SARS疫苗研究提供检测抗原奠定了基础。     

奶牛S100A12基因克隆及其在乳腺和生殖系统中的表达

为了解奶牛S100A12基因序列的特征及其在乳腺和生殖系统中的表达情况,采用RT-PCR技术从奶牛外周血液中扩增S100A12基因,重组到pMD19-T Simple载体中,进行了测序和序列分析,并应用RT-PCR技术检测了奶牛乳腺和生殖系统（卵巢、输卵管、子宫颈、子宫体、阴道等组织）中S100A12 mRNA的表达分布。结果显示,克隆的S100A12基因包含一个279 bp的完整开放阅读框（ORF）,与GenBank中的奶牛S100A12基因（NM₁74651）编码区序列100%相同,该ORF编码的92个氨基酸含有一个EF手型结构（位于49-84氨基酸残基）;另外,还预测到3个蛋白激酶C磷酸化位点,分别位于19-21、44-46和70-73氨基酸残基。S100A12基因在奶牛乳腺和生殖系统上皮组织中均有表达。推测S100A12基因在奶牛乳腺和生殖系统中具有一定作用。     

Taq DNA聚合酶的热纯化制备（摘要）

[目的]提高Taq DNA聚合酶的制备效率。[方法]利用Ni柱亲和色谱纯化载有6xHis标记的Taq DNA聚合酶,并重组载体,利用Taq DNA聚合酶的耐热特性,对粗提液75℃处理1h,之后通过PCR试验验证制备酶液的活力。[结果]所获重组的pET-32A-Taq能够在BL21（DE3）宿主菌中高效表达并可通过热变性去除杂蛋白,获得了活力远高于购买的Taq DNA聚合酶的酶制剂。[结论]使用热纯化法制备的Taq DNA聚合酶工艺简单,成本较低,能满足常规大量PCR实验要求。     

枯草芽孢杆菌bioI基因的克隆和高效表达及BioI蛋白的纯化

【目的】克隆和表达枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)bioI基因并纯化表达产物。【方法】提取B.sub-tilis1A747基因组DNA,从中扩增bioI基因并将其克隆到大肠杆菌(Escherichia coli)的表达载体pET-28a(+)上,构建bioI的表达载体pET28a-bioI。将重组质粒pET28a-bioI电转化到大肠杆菌表达宿主BL21(DE3)中进行IPTG诱导表达,对表达产物BioI用Ni2+-NAT亲和层析树脂进行纯化,并对纯化蛋白进行波长扫描。【结果】成功构建了表达载体pET28a-bioI,酶切鉴定结果正确并在大肠杆菌中表达成功,经IPTG诱导8 h后,重组蛋白BioI的表达量占总可溶性蛋白的20%;波长扫描发现,重组蛋白BioI在400 nm处有特征吸收峰。【结论】bioI基因克隆表达成功,其表达产物BioI具有P450蛋白的特征,为蛋白性质的进一步研究和抗体的制备奠定了基础。     

结构域Tt APuX21蛋白在大肠杆菌中的表达及纯化

利用多聚酶链反应技术,扩增出编码结构域Tt APuX21的基因Tt apux21,然后将Tt apux21克隆到表达载体pET21a( )中.得重组质粒.重组质粒命名为pEX21,并转化到表达宿主菌大肠杆菌Tuner 中.30℃、O-1mmol·L-1 IPTG诱导5h后.SDS-PAGE检验表明Tt APuX21获得高效表达.将表达产物加入到TalonTM树脂中,进行金属离子亲和层析,得纯化产物.     

增强型绿荧光蛋白突变体mut4EGFP在大肠杆菌中的表达与纯化

增强型绿荧光蛋白突变体mut4EGFP(EGFP／V163A／S175G)是一种发光能力更强、更稳定的新型绿色荧光蛋白。为了获得大量高纯度的蛋白,将mUT4EGFP基因插入原核表达载体pTWINl中,使之与几丁质结合域(CBD)-内含肽(intein)融合,获得原核表达质粒pTWIN-M4。将pTWIN-M4转化大肠杆菌BL21(DE3)plyss,IPTG诱导后进行SDS-PAGE电泳分析,结果显示,CBD-intein-mut4EGFP融合蛋白在BL21(DE3)plysS中获得高效表达并以可溶性蛋白的形式存在。进一步采用几丁质柱纯化系统对表达产物进行纯化,得到了高纯度的mut4EGFP．     

CP4-EPSPS蛋白在大肠杆菌中的表达与制备

构建了一个含有CP4-EPSPS外源基因的细菌表达载体并在大肠杆菌Transtta菌株中的高效表达,通过SDS-PAGE检测发现,目标蛋白完全以可溶性方式存在于细胞破碎上清液中,且约占到细菌可溶性蛋白的40%左右。收集该上清液并进而通过连续2次镍柱亲和层析,CP4-EPSPS重组蛋白纯度可达99.9%以上,对其进行N端序列分析,与预期的结果完全一致。以其作为标准品,通过ELISA,成功检测出三株CP4-EPSPS转基因烟草中目标蛋白含量分别为0.292 μg/g、0.477 μg/g和0.703 μg/g。该蛋白表达和纯化体系可为CP4-EPSPS转基因植物蛋白量值溯源传递的标准物质研制提供稳定物质基础。     

谷胱甘肽硫转移酶与hEGF在大肠杆菌中的融合表达及活性研究

为了得到具有生物学活性的人表皮生长因子(hEGF),将含有人表皮生长因子基因的原核表达载体pGEX-4t-1(+)-hEGF转化入BL21-CodonPlusTM-RP表达宿主菌进行大量表达,SDS-PAGE分析表明,融合蛋白主要以包涵体的形式存在。收集包涵体,用氧化复性的方法,加入还原型的谷胱甘肽进行复性,之后通过GlutathioneSepharoseTM4B纯化柱,分离纯化得到复性的融合蛋白。以兔抗人EGF单克隆抗体为一抗,进行Western blotting鉴定,证明分离纯化得到的融合蛋白含有目的蛋白hEGF。最后对复性的融合蛋白进行了活性分析,表明该融合蛋白具有良好的hEGF生物学活性。     

梅花鹿激活素A重组蛋白真核表达、纯化及其生物活性的测定

【目的】体外真核表达梅花鹿(Cervus nippon)激活素A重组蛋白并测定其生物活性,为进一步明确激活素A在梅花鹿卵母细胞体外成熟过程中的生理学功能提供基础。【方法】利用RT-PCR技术克隆梅花鹿激活素βA (ActivinβA, ACTBA)亚基基因的cDNA全长序列,同时利用生物信息学对梅花鹿激活素βA的基因特征进行分析。在NCBI数据库下载其他物种激活素βA同源序列,利用Clustalx和MEGA 4软件进行同源比对并构建进化树。构建pcDNA4/ACTBA重组质粒并转染至CHO细胞内,进行目的蛋白的体外表达。采用免疫荧光及Western blot技术对目的蛋白表达情况进行检测,并通过Ni-NTA亲和层析柱对蛋白产物进行纯化。采用Western blot检测了梅花鹿激活素A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中的SMAD2和SMAD3的磷酸化水平。最后采用荧光定量PCR及Western blot检测了梅花鹿激活素A重组蛋白处理后的猪颗粒细胞中类固醇激素合成相关酶的表达量。【结果】克隆得到的梅花鹿ACTBA亚基基因含有1 278 bp的碱基,编码426个氨基酸。同源性比较发现梅花鹿ACT...     

Expression of Duck Interferon Alpha in BL21（DE3）plysS

To obtain the protein of duck interferon alpha and study its biological activities, the prokaryotic ex-pression vector of DuIFN-α was constructed and expressed in BL21 (DE3) plysS. Using PCR technique, the proteingene of DuIFN-α was cloned from pMD-18-duIFN-α recombinant. The gene was then inserted to pGEM-T vectorand identified by restriction endonuclease analysis and sequencing. DuIFN-α was ligated with the prokaryotic expres-sion vector of pET30 a, then transformed into BL21 (DE3) plysS. The best inducing time and IPTG concentration for the expression of this recombinant protein was tested through the expression of the positive recombinant with differ-ent time span and different IPTG concentration. Lots of the protein of DuIFN-α were expressed in BL21 (DE3)plysS with 1 mmol·L-1 IPTG for 4 hours and its molecular weight for 34 000.     

基于重组工程法高转化效率的大肠杆菌BL21(DE3)表达菌株构建

[目的]提高最常用的异源蛋白表达宿主菌E.coli BL21(DE3)的转化效率。[方法]利用基于质粒的重组工程系统和双链断裂修复功能。[结果]敲除了编码降解外源DNA的I型限制性内切酶的hsdR基因,获得了高转化效率以及其他功能与BL21(DE3)仍保持一致的LS1928菌株。[结论]获得的LS1928菌株可能会作为获得催化用酶的关键材料,进而在蛋白质工程等研究领域有着重要的作用。     

Taq DNA聚合酶的热纯化制备

[目的]提高Taq DNA聚合酶的制备效率。[方法]利用Ni柱亲和色谱纯化载有6xHis标记的Taq DNA聚合酶,并重组载体,利用TaqDNA聚合酶的耐热特性,对粗提液75℃处理1h,之后通过PCR试验验证制备酶液的活力。[结果]所获重组的pET-32A-Taq能够在BL21（DE3）宿主茵中高效表达并可通过热变性去除杂蛋白,获得了活力远高于购买的珊DNA聚合酶的酶制剂。[结论]使用热纯化法制备的Taq DNA聚合酶工艺简单,成本较低,能满足常规大量PCR实验要求。     

用于RNA干扰研究的大肠杆菌表达系统的条件优化

选取在E.coli中对于dsRNA表达比较重要的3个因素,即诱导时间、诱导温度和诱导剂IPTG浓度。利用已经构建好的大肠杆菌E.coli HT115(DE3),并结合正交试验设计研究dsRNA在HT115(DE3)内的最优表达条件。结果表明,工程菌在诱导时间8 h、诱导温度30℃、诱导剂浓度10.0 mmol/L的培养条件下所得到的dsRNA表达量最大。