鱼类皮肤免疫应答及蛋白质组学

正鱼类皮肤作为黏膜免疫系统的重要组成部分,也是阻止病原微生物进入体内的第一道防线[1]。鱼类皮肤黏膜免疫系统不仅对宿主防御病原侵入是必要的,而且对水产养殖疫苗应用也十分重要[2-3]。近年来,与系统免疫相比而言,鱼类皮肤黏膜免疫应答研究备受关注[4-6]。笔者针对鱼类皮肤免疫应答的分子机制及蛋白质组学研究进行简要综述,以期为鱼类病害的预防和治疗提供科学参考。     

蛋白质组学研究在水生生物中的应用

1994年,澳大利亚Macquaire大学的WiUkins和Willimm在意大利Siena召开的双向电泳会议上首次提出了“蛋白质组”这一名词,并将其定义为“基因组所表达的全部蛋白质”。这个概念的提出标志着一个新的学科——蛋白质组学(proteomics)的诞生。     

采用蛋白质组学方法研究嗜水气单胞菌的生长代谢

采用蛋白质组学的方法之一－－二维电泳技术，对嗜水气单胞菌生长周期中各不同阶段的蛋白质组成进行了分析。结果显示，在不同生长阶段，其蛋白质组成均发生明显变化，发现了与细菌生长代谢各阶段生理活动有关的差异蛋白质，有助于浓入了解嗜水气单胞水气单胞菌生长周期中不同阶段的基因组表达情况，同时，还对二维电泳和普通SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳进行比较。结果表明，二维电泳技术是研究蛋白质组学的有效工具。     

韩国赤潮监测、预报体系及防治技术研究与应用概况

章根据作赴韩对韩国沿岸水域的赤潮状况。赤潮生物种类的鉴别、分离和培养，有毒甲藻的毒性，分子生物学在快速检测赤潮生物中的应用以及赤潮的监测、预报及防治对策等方面的考察，从韩国赤潮及渔业损失基本概况、韩国赤潮监测、预报中心、韩国赤潮预警及防治技术研究与应用，韩国赤潮相关学科的研究概况等方面简要概述了韩国赤潮监测，预报体系及防治技术研究与应用情况．并对我国赤潮监测、预报及防治技术研究提出了几点设想和建议。     

农村仔猪生产技术体系的制定

目前,仔猪培育仍然是制约农村养猪生产的首要技术因素,突出表现为:对仔猪和母猪的饲料、营养、饲喂、管理、疾病防治、药理、药物、圈舍(小环境)调控、健康状态、病理状态等认识不足,观念落后,措施不当,仔猪疾病多,死亡率高,个体不均匀.母猪繁殖障碍综合症(表现流产、不孕、难孕、死胎、弱胎等)、产后感染(母猪发热、精神不好、采食降低、不能站立等)较多.无论家庭散养户、规模化养猪户(场)、优良品种猪场(如三元杂交),都存在以上问题,造成不同程度的经济损失.     

动物疫病净化技术体系构建

畜牧业是推动我国农村经济持续发展的重要产业,也是当代农业体系的重要组成部分,且畜牧业中若出现不良情况,可能导致人们健康受到严重影响,甚至导致社会安全受到威胁。随着饲养规模、饲养密度的不断增加,动物疫病的发生率更高,治疗难度更大,为了对动物疫病进行有效控制,并保障畜牧业的良好发展,对动物疫病净化技术体系的构建措施进行分析,以供参考。     

大弹涂鱼皮肤黏液的抑菌活性和蛋白质组学

皮肤黏液是鱼类免疫防御的第一道防线。大弹涂鱼皮肤黏液对其免疫防御、渗透压维持以及适应水陆生活等方面具有重要意义。为深入了解大弹涂鱼皮肤黏液的蛋白质分子组成,对其皮肤黏液开展了抑菌活性分析和蛋白质组学分析。通过电刺激法收集大弹涂鱼皮肤黏液,采用打孔法比较了皮肤黏液和血清的抑菌活性差异;进一步利用鳗弧菌对大弹涂鱼进行诱导,采用生长曲线抑制法分析和比较了诱导前后皮肤黏液的抑菌活性差异。利用Shotgun质谱技术,结合大弹涂鱼皮肤转录组数据库,对大弹涂鱼皮肤黏液开展了蛋白质组学分析;进一步利用String软件对所鉴定的蛋白质开展了蛋白质相互作用预测。大弹涂鱼皮肤黏液具有广谱抑菌活性,鳗弧菌诱导后的大弹涂鱼皮肤黏液与诱导前相比,对部分革兰氏阴性菌的抑菌活性明显上升,但对其他菌株的抑菌活性差异不明显。从大弹涂鱼皮肤黏液中共鉴定各类蛋白质分子97种,基本分子组成与其他硬骨鱼类皮肤黏液蛋白相似,但也有少数蛋白如泛素蛋白、胸腺素蛋白等未在其他鱼类皮肤黏液中报道。此外,其他鱼类中所鉴定到的部分蛋白如热休克蛋白、抗菌肽等在大弹涂鱼皮肤黏液中未能鉴定到。大弹涂鱼皮肤黏液中已鉴定的蛋白多数具有与免疫功能相关的结构域,且存在一个以肌动蛋白为核心的相互作用网络。大弹涂鱼皮肤黏液具有明显的广谱抑菌活性,其蛋白质组成与其他鱼类皮肤黏液具有一定的相似性。本研究为深入了解大弹涂鱼皮肤黏液的分子多样性及功能机制奠定了基础。     

我国生态渔业技术体系的探讨

随着经济的发展,中国渔业面临着环境与发展的双重挑战。为实现渔业可持续发展,必须在继承传统渔业技术精华和引进现代渔业新技术的基础上,运用生态经济学原理和系统工程方法,在不同层次上建立具有中国特色的生态渔业技术体系,通过协调环境保护与经济发展、自然资源开发及其永续利用的关系,实现生态与经济的良性循环,达到渔业可持续发展的目标。     

富硒酵母对斑点叉尾鮰肝脏的毒性作用及蛋白质组学的影响

实验探讨了富硒酵母对斑点叉尾鮰肝脏的毒性作用及蛋白质组学的影响,结果表明,饲养56 d后正常组和有机硒组采用原子荧光法检测硒含量均值为0.15和0.81 mg/kg。H.E染色显示有机硒组肝细胞有明显的疏松化,部分发生脂肪变。通过二维凝胶电泳结合ImageMaster软件分析,鉴定出8个表达差异蛋白质点,其中3个在有机硒组表达上调,5个在有机硒组特异表达,经液相色谱串联质谱分析鉴定,这些蛋白质分别是伴侣蛋白TCP1-亚基8、甘油醛-3-磷酸脱氢酶、4SNcTudor蛋白、腺苷激酶、酮糖移转酶、丙氨酰-tRNA合成酶。富硒酵母饲料对斑点叉尾鮰肝具有明显的毒性效应,有机硒调控4SNc-Tudor蛋白,通过信号传导通道加强机体免疫。     

中国明对虾肌肉组织蛋白质双向电泳技术体系的建立

为了探索并建立中国明对虾的肌肉蛋白双向电泳体系,实验将中国明对虾的肌肉组织溶解处理后,通过固相pH梯度胶条等电聚焦、SDS-PAGE垂直电泳对蛋白质进行分离,对不同的裂解液配方、IPG胶条的pH范围及其长度、等电聚焦程序、上样量等进行了优化,并分别利用银染和考染方法进行染色,应用PDQuest软件对图谱进行了初步分析.结果显示,中国明对虾肌肉蛋白的等电点主要位于4～7之间,裂解液中添加硫脲、CHAPS、DTT等,可以增加对虾肌肉蛋白的提取率;采用17 cm,pH 4～7的中型IPG胶条,主动水化上样120μg,适当延长除盐时间和等电聚焦时间,搭建盐桥,采用浓度为12.5％的二向分离胶和硝酸银染色,能有效提高双向电泳(2-DE)图谱中蛋白点的分离度和分辨率;建立的中国明对虾肌肉蛋白双向电泳体系具有良好的重复性和稳定性.     

Outer membrane protein A (OmpA) is a potential virulence factor of Vibrio alginolyticus strains isolated from diseased fish

Vibrio alginolyticus is one of the most serious causative agents of diseases in cultured marine fish and shellfish. However, the characteristics of virulence factors in pathogenic V. alginolyticus are poorly known. To gain insight into fish diseases caused by V. alginolyticus, we carried out two-dimensional gel electrophoresis (2-DE) combined with MALDI-TOF mass spectrometry to identify uniquely expressed proteins in the disease-causing V. alginolyticus. V. alginolyticus strains were isolated from marine environments and diseased fish obtained from southern Thailand. We identified seven unique proteins in the disease-causing V. alginolyticus strain. Among those, the outer membrane protein A (OmpA) had the strongest expression. Therefore, the function of this protein was further analysed. To investigate the role of OmpA protein, an in-frame deletion mutant of ompA was constructed using the homologous recombination method. Although the ompA mutant V. alginolyticus strain (ΔompA) grew normally, the mutant exhibited a significant defect in the swarming ability and the biofilm formation. Furthermore, Galleria mellonella larvae injected with the mutant bacteria had a significantly greater survival percentage than those injected with the wild-type strain, demonstrating that OmpA protein is required for the pathogenicity of V. alginolyticus. Together, this study suggests a potential target for vaccine development against pathogenic V. alginolyticus strain.     

溶藻弧菌全菌可溶性蛋白二维图谱的建立及部分蛋白分子的鉴定

本研究采用蛋白质组学技术,建立了溶藻弧菌(Vibrio alginolyticus)ZJ03培养至稳定期的蛋白质组双向电泳图谱,并对部分蛋白分子进行了肽质量指纹图谱分析鉴定。首先将溶藻弧菌接种于TSB培养基28℃培养24 h,利用裂解液裂解细菌,提取全菌可溶性蛋白,荧光染料标记,24 cm pH4 ～ 7的胶条进行等电聚焦,再用12.5%的胶进行SDS-PAGE。2-D胶经过分析,得到902±8个蛋白斑点,重复胶的匹配点数为866±28,匹配率为96%。从双向电泳图谱中选取68个高丰度蛋白质点进行肽质量指纹图谱鉴定,其中60个在NMPDR数据库中得到鉴定,另外8个在NCBI数据库中得到鉴定。鉴定的蛋白中发现Serine protein kinase、purine nucleoside phosphorylase 和Alkyl hydroperoxide reductase subunit C-like protein存在修饰现象,它们在胶上均有2种表现形式。对68个蛋白进行了细胞功能的分类,发现能量代谢蛋白最多,占43%;其次是转运和结合蛋白,占9%;第三是外膜蛋白,占8%。经CMR操纵子预测软件分析预测到2个操纵子,它们均参与了能量代谢过程。研究结果为溶藻弧菌在不同生长条件下的比较蛋白质组学以及该菌强毒株和无毒株的比较研究提供了基础资料。     

柱状黄杆菌强毒株和弱毒株胞外蛋白中差异蛋白的初步鉴定

柱状黄杆菌(Flavobacterium columnare)是一种世界范围的水产动物致病菌,是中国重要养殖鱼类草鱼(Ctenopharyngodon idellus)、鳜(Siniperca chuatsi)等烂鳃病的病原。本研究以1972年从患"烂鳃病"草鱼上分离的两株冻干柱状黄杆菌G4和G18菌株为研究对象,并将G4株再次分离纯化得纯化菌株,命名为G4R3。对草鱼鱼苗浸泡攻毒结果显示,G4R3的LD50至少比G18的高3个数量级,因此G4R3为"强毒株",G18为"弱毒株"。利用蛋白质组学方法分析柱状黄杆菌强毒株G4R3和弱毒株G18的胞外蛋白,经过双向电泳并结合图像分析,共发现了34个点是差异表达的蛋白。胶内酶解、肽质量指纹图谱和串联质谱分析后,鉴定出其中的7个蛋白点,代表滑动蛋白K、腺酐甲硫氨酸合成酶和一种可能的膜蛋白等3种蛋白,它们可能是柱状黄杆菌的毒力因子。     

拟穴青蟹卵巢蛋白质双向电泳的样品制备方法

为探索适用于拟穴青蟹卵巢蛋白质双向电泳的样品制备方法,比较了TCA/丙酮沉淀法和3种裂解液抽提法对总蛋白的提取效果,4种方法分别得到133、369、306和417个蛋白点。采用裂解液Ⅲ(7 mol/L尿素、2 mol/L硫脲、4% CHAPS、40 mmol/L Tris-base、65 mmol/L DTT、2% IPG Buffer、Protease in hibitor cocktail、1 mmol/L EDTA)提取蛋白所得图谱效果最好,背景清晰,蛋白点最多。     

坛紫菜叶状体蛋白质双向电泳样品制备方法的比较

蛋白质样品的制备是双向电泳分析的关键。为探索适用于坛紫菜叶状体蛋白质双向电泳样品的制备方法,实验对3种常用植物蛋白质分离方法进行了优化和改进,并分别同3种蛋白质裂解液联用,比较了9种方法的总蛋白质得率及双向电泳图谱效果。结果发现,采用三氯乙酸/丙酮沉淀法与裂解液C(7 mol/L 尿素,2 mol/L 硫脲,2%CHAPS,2%TritonX-100,2% IPG Buffer pH 3~10,65 mmol/L DTT)联用的方法,坛紫菜叶状体的蛋白质得率最高,且双向电泳图谱显示此法获得的蛋白质点数最多,蛋白点形状规则,水平和垂直拖尾情况较轻,图像清晰。实验结果还发现,在进行双向电泳分析时,采用pH 4~7的胶条可以使坛紫菜叶状体蛋白质得到更为有效的分离。     

Antibody screening identifies 78 putative host proteins involved in Cyprinid herpesvirus 3 infection or propagation in common carp,Cyprinus carpio L

Cyprinid herpesvirus 3 (CyHV‐3) is the aetiological agent of a serious and notifiable disease afflicting common and koi carp, Cyprinus carpio L., termed koi herpesvirus disease (KHVD). Significant progress has been achieved in the last 15 years, since the initial reports surfaced from Germany, USA and Israel of the CyHV‐3 virus, in terms of pathology and detection. However, relatively few studies have been carried out in understanding viral replication and propagation. Antibody‐based affinity has been used for detection of CyHV‐3 in enzyme‐linked immunosorbent assay and PCR‐based techniques, and immunohistological assays have been used to describe a CyHV‐3 membrane protein, termed ORF81. In this study, monoclonal antibodies linked to N‐hydroxysuccinimide (NHS)‐activated spin columns were used to purify CyHV‐3 and host proteins from tissue samples originating in either CyHV‐3 symptomatic or asymptomatic fish. The samples were next analysed either by polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) and subsequently by electrospray ionization coupled to mass spectrometry (ESI‐MS) or by ESI‐MS analysis directly after purification. A total of 78 host proteins and five CyHV‐3 proteins were identified in the two analyses. These data can be used to develop novel control methods for CyHV‐3, based on pathways or proteins identified in this study.     

中国明对虾血浆蛋白质组双向电泳技术的建立与主要高丰度蛋白点的质谱鉴定

中国明对虾的血浆脱盐处理后,通过固相pH梯度胶条等电聚焦、SDS-PAGE垂直电泳对蛋白质进行分离,对不同pH范围IPG胶条、脱盐方式、上样量等进行了优化,并分别利用硝酸银和胶体考染方法进行染色,应用PDQuest软件对图谱进行了初步分析,采用基质辅助激光解析电离-飞行时间质谱法对主要的高丰度蛋白点进行了质谱鉴定。结果显示,中国明对虾血浆在pH 4~7范围、18 cm的2-DE胶上得到了很好的分离,上样量为150 μg左右,采用银染可以获得较好的分析胶图谱;而上样1 000 μg左右,采用胶体考染方法能获得较好的制备胶图谱;通过MALDI-TOF/TOF MS鉴定的11个最主要的高丰度蛋白点都是血蓝蛋白。建立并优化了中国明对虾血浆蛋白质组学的双向电泳技术体系,为进一步开展对虾等甲壳动物的血浆蛋白质组学研究奠定了基础。     

Effect of CO2 on Chemical and Microbial Changes of Pacific White Shrimp During Modified Atmosphere Packaging

ABSTRACT

This study monitored the physical, chemical, and sensory quality of raw Pacific white shrimp (Litopenaeus vannamei) and the evolution of microbial flora under modified atmosphere packaging (MAP) with varying concentrations of CO₂ (95% CO₂/5% O₂; 80% CO₂/15% N₂/5% O₂; 65% CO₂/30% N₂/5% O₂) at 4°C during 10-day storage. Plate counts on selective agars indicated that MAP had a strong inhibitory effect on psychrotrophic bacteria, mesophilic bacteria, Enterobacteriaceae, and H₂S-producing bacteria. Analyses with molecular techniques (denaturing gradient gel electrophoresis, DGGE) by extracting bacterial DNA from shrimp samples showed that Vibrio spp. and Aeromonas spp. were predominant in fresh MAP samples. Shewanella putrefaciens, which dominated in samples stored in air, were found sporadically in MAP samples. Interestingly, lactic acid bacteria were not predominant in MAP samples, whose pH values were high (6.66 to 8.14) during storage. The content of total volatile basic nitrogen in MAP samples was about 10 mg N/g lower than the control at the end of storage. Higher lightness values and sensory scores were also observed in samples under MAP. However, MAP with CO₂ concentrations higher than 80% did not enhance the inhibitory effect on bacterial growth but induced more severe reddening and sensory quality loss.     

雅鲁藏布江中游6种裂腹鱼乳酸脱氢酶同工酶的比较研究

采用不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳技术对雅鲁藏布江中游6种裂腹鱼(尖裸鲤Oxygymnocypris stewartii、拉萨裸裂尻鱼Schizopygopsis younghusbandi、巨须裂腹鱼Schizothorax macropogon、拉萨裂腹鱼S.waltoni、双须叶须鱼Ptychobarbus dipogon和异齿裂腹鱼S.o'connori)的心肌、肌肉、肝脏、肾脏和晶状体5种组织的LDH(乳酸脱氢酶)同工酶进行比较分析。结果表明LDH同工酶的表达具有明显的组织和种间差异性。尖裸鲤、拉萨裸裂尻鱼和双须叶须鱼由LDH-A、LDH-B和LDH-B1基因编码,5种组织中分别检测到16、13和9条酶带;拉萨裂腹鱼和巨须裂腹鱼由LDH-A、LDH-B和LDH-C基因编码,5种组织中分别检测到9和6条酶带;异齿裂腹鱼由LDH-A和LDH-B基因编码,5种组织中检测到6条酶带。根据酶谱特征对其生物演化进行了探讨,发现尖裸鲤和拉萨裸裂尻鱼特化程度最高,其次是双须叶须鱼,巨须裂腹鱼、拉萨裂腹鱼和异齿裂腹鱼特化程度最低,与形态学特征所划分的三个类群吻合。