轮枝镰孢SSR标记开发及在玉米分离群体遗传多样性分析中的应用

【目的】开发轮枝镰孢（Fusarium verticillioides）的SSR标记,为轮枝镰孢遗传多样性研究提供技术支持。【方法】利用Fastpcr在轮枝镰孢基因组中查找符合条件的SSR位点,采用Primer5.0软件设计引物,利用NTSYS及Popgene分析来自玉米的轮枝镰孢单孢分离物群体的PCR扩增结果。【结果】共设计有效扩增SSR引物158对,经筛选,109对（69.0%）可扩增出2条及以上的条带,其中55对引物（34.8%）多态性较好,可扩增出3条及以上的条带。从11条已组装的轮枝镰孢染色体上各选出2对多态性引物,计22对引物,对66株轮枝镰孢玉米分离物进行扩增,共获得125个等位变异,变异范围为2-11个,平均为5.68个。轮枝镰孢玉米分离物之间Nei’s基因多样性指数为0.1139-0.8687,平均为0.6199,表现出较高的遗传多样性。【结论】基于轮枝镰孢基因组序列开发的SSR标记具有很好的多态性,可用于轮枝镰孢的遗传多样性分析。用22对SSR引物扩增,以遗传相似系数0.3进行划分,可将66株轮枝镰孢玉米分离物分为3群;中国轮枝镰孢玉米分离物的遗传多样性与地理分布无相关性。     

菊花EST-SSR分析及标记开发

为了开发菊花的分子标记,对7087条菊花EST进行拼接,得到275个contigs,发现50个SSR位点;在拼接的contigs中SSR平均密度为每2854.3bp含有1个SSR。三核苷酸重复基元的SSR类型最多,占总数的50.00%;在二碱基重复中,最主要的优势重复基元是AC和AG;三碱基中CAT和CCA为优势重复基元;四碱基、五碱基重复类型中,(TTTN)n和(ATTTN)n重复基元为对应优势基元;这些优势重复基元中富含碱基A和T,菊花EST序列中高度变异的微卫星（长度>20bp）约占2.00%。根据得到的菊花EST-SSR,共设计出428对引物,并选取了28对SSR引物对黄山贡菊基因组DNA进行PCR扩增,其中有27对引物扩增成功。     

57株镰孢菌ISSR分子标记及其遗传多样性分析

为明确美丽组尖孢镰孢菌和李瑟组镰孢菌种间和种内的差异与亲缘关系,以采自不同寄主的57株镰孢菌(Fusarium)为研究对象,采用ISSR-PCR标记技术对其进行遗传多样性分析,结果表明:利用11条引物对供试的3种菌株进行ISSR-PCR扩增,共扩增出121条条带,其中多态性位点为117个,多态性比例为96.7%,平均每条引物产生条带为11条。说明镰孢菌基因组DNA的SSR区域具有明显的多态性,镰孢菌的遗传多样性采用ISSR技术是可行的分析。聚类分析结果表明:57个菌株间的遗传相似系数为0.568～0.992,当相似系数为0.568时,供试菌株可明显分为两大类群,第一类群IG-I为1～35,全部为美丽组尖孢镰孢菌,第二类群IG-II为36～57,全部为李瑟组镰孢菌;第二类群又可以分为两大亚类群,第一亚类为轮枝镰孢菌,第二亚类为层生镰孢菌。ISSR类群划分与镰孢菌菌种分类之间具有一定的相关性,而与其地理来源无相关性。本研究镰孢菌种间与种内均表现出明显的遗传差异。     

尖孢镰孢菌室内生物药剂筛选

在室内选用了6种生物药剂对尖孢镰孢菌进行了毒力测定。结果表明:在供试的药剂中,抑菌效果较好的药剂有低聚糖素、春雷霉素、克菌康,其中低聚糖素对尖孢镰孢菌的抑菌效果最好,EC50为18.20mg·L-1,春雷霉素次之,EC50为20.49mg·L-1。     

EST-SSR标记的开发及在果树上的应用研究进展

作为一种新型分子标记,EST-SSR来自表达基因,因而除具备传统基因组来源的SSR标记所有优势外,可能与基因功能表达具有直接或间接关系,从而强化了SSR标记在遗传研究中的应用。简要介绍了EST-SSR标记的开发方法,重点综述了其在果树的遗传多样性分析、遗传连锁图谱的构建、比较作图和分子系统发育等研究领域的应用现状,为今后该项技术在果树研究上的应用提供参考。     

EST-SSR分子标记在茶树品种鉴别中的应用

从GenBank数据库中龙井43的EST序列中筛查EST-SSR位点,设计并获得了65对茶树(Camellia sinensis)EST-SSR引物.以鄂茶1号、龙井43、龙井群体、云抗10号、雪芽100、矮丰的基因组DNA为模板,对所设计的65对EST-SSR引物进行筛选.结果表明,65对引物均能扩增出清晰条带,有效扩增率为100％;其中有4对引物的扩增产物在6个样本间具有多态性,能用于6个茶树品种的品种鉴别.     

浙江省柑橘胶孢炭疽菌遗传多样性的ISSR分析

为了解柑橘炭疽病菌的种内遗传多样性,从32条ISSR引物中筛选出多态性好、条带清晰的5条引物,对28株炭疽病菌株进行ISSR-PCR扩增.结果显示:5条引物共扩增出43个条带,多态性条带41个,多态性比例为95.34%,说明柑橘炭疽病菌种内遗传多样性丰富.利用NTSYS软件分析并构建UPGMA聚类图,当相似系数为0.73时,28株菌可以分为5个类群,不同菌株间遗传变异较大,遗传变异与地域来源无显著的相关性.     

辣椒根腐病菌-尖镰孢菌生物学特性研究

对尖镰孢菌病菌(Fusarium oxysporum Schlecht.)致病性和生物学特性进行了研究,结果表明,分离的尖镰孢菌具有致病性,回接症状与田间一致;PDA为病菌培养的最适培养基,病菌生长的最适宜温度范围为25～30℃,pH值为3～12.病菌均能生长,最适pH范围为6～8.以麦芽糖为碳源病菌生长最快,D-半乳糖最慢;以赖氨酸为氛源病菌生长最快,甲硫氨酸为最慢.总体上,孢子萌发和病菌生长对温度、酸碱度、营养物质要求基本一致,光照对孢子萌发的影响不明显.     

瓜类枯萎病菌尖镰孢专化型研究初报

１９８９年在郑州、开封两市郊区采集黄瓜，西瓜、瓠瓜和冬瓜枯萎病株，经分离鉴定，其病菌都是尖镰孢。尖镰孢酯酶同工酶酶谱测定结果表明，４个专化型的酶谱明显不同     

小麦EST SSR的分析及其引物的开发

 为开发出具有丰富多态性的、新型的小麦EST SSR标记,利用已公布1071367条小麦表达序列标签（expressed sequence tags,EST）序列,对≥24bp的微卫星或简单重复序列进行了系统分析。结果表明,在所分析的小麦EST序列中,搜索到长度大于或等于24bp,基序匹配值大于80%的SSR序列32350个。在这些SSR中,单碱基SSR最多,数量达18075个,占SSR总数的559%;其次为3核苷酸SSR,共6106个,占SSR总数的187%,重复数大于30次以上的达444个,占所有3核苷酸SSR的72%。4核苷酸SSR数量最少,仅有696个,仅占SSR总数的22%。研究中收搜索到的6核苷酸SSR共1562个,其基序组成可分为145类,优势基序为AGCCGC（达214个）。以上结果说明小麦EST序列中含有丰富的SSR,这非常有利于开发多态性较高的EST SSR标记。     

西瓜枯萎病生理小种1抗性QTL精细定位与InDel标记开发

【目的】通过QTL初定位检测栽培西瓜枯萎病生理小种1抗性的主效QTL,验证枯萎病抗性基因Fon-1的存在,结合亲本重测序信息开发紧密连锁易于检测的InDe1(insertion/deletion)分子标记,为西瓜枯萎病分子标记辅助育种提供技术支撑,并实现该QTL的精细定位,加速Fon-1的克隆和功能验证进程。【方法】以高抗枯萎病的栽培西瓜‘ZXG01478'和高感病的栽培西瓜‘14CB11'为亲本构建的F_2群体为试验材料,利用WinQTL cartographer 2.5软件基于复合区间作图法对枯萎病生理小种1抗性进行QTL定位。依据两个亲本材料进行高通量的重测序,并利用重测序信息,获取位于QTL置信区间的InDe1信息,利用自编的Per1程序提取参考基因组中插入缺失相应位置前后500 bp的序列,并利用Primer 5.0软件设计对应的InDe1引物对,开发InDe1标记。利用开发的InDe1标记进行精细定位(根据基因型鉴定结果找到群体中的交换单株,逐步缩小QTL区间)、图谱(利用JoinMap 4.0计算标记的连锁关系)和QTL的重新分析。并利用具有广泛代表性的130份不同抗性的西瓜种质资源的基因型和表型鉴定结果进行验证分析。【结果】F_2群体的病株率频率分布呈现明显的双峰分布且抗病和感病两种类型的株系分离比基本符合3:1的分离比(χ~2=0.52,P=0.47),表明西瓜枯萎病生理小种1抗性主要受一个主效QTL控制。F_2群体的QTL初定位在LG1鉴定到一个枯萎病抗性相关的主效QTL(fon1),其LOD峰值为26.05,解释80.18%的表型变异,置信区间对应的物理位置为1号染色体的193 333-2 775 577 bp。通过两个亲本重测序在QTL置信区间发现19个插入缺失片段大于20 bp的InDe1s,经引物设计与亲本筛选,获得理想引物12对,根据位于端点位置的插入缺失选取了6对InDe1引物利用F_2群体进行验证。初步的精细定位利用群体中的5个交换单株将QTL的置信区间锁定到InDe12_fon1的上游区域,连锁和QTL的重新分析结果显示新开发的一个分子标记InDe11_fon1出现在该QTL的峰值,LOD值为31.65,解释91.46%的表型变异。新开发的分子标记InDe11_fon1与已应用于枯萎病抗性研究的CAPS标记7716_fon在130份不同抗性的西瓜种质资源中的基因型鉴定结果完全一致,且基因型鉴定结果与田间抗病表型性状的符合率达70.8%。利用QTL峰值附近的SNP和InDe1标记与群体中的9个交换单株最终将fon1精细定位至246 kb的物理区间。【结论】主效QTL(fon1)验证了1号染色体上Fon-1的存在,并实现了精细定位。新开发的标记InDe11_fon1与Fon-1紧密连锁,且检测简单,成本低廉,能够更好的用于栽培西瓜枯萎病的分子标记辅助育种。     

西瓜与枯萎病菌非亲和互作的表达序列标签分析

目的从整体水平上阐明西瓜与枯萎病菌非亲和互作基因表达的特征。方法用SSH方法构建枯萎病菌接种处理后不同时间点的cDNA文库,对其中获得3895条高质量的表达序列标签(EST)序列进行分析。结果在测定4431条cDNA序列中,序列拼接后获得1756条unigene,经过注释和分析,发现可能参与西瓜与枯萎病菌非亲和互作的转录因子、激酶和防卫基因,及茉莉酸和木质素生物合成途径等。结论在西瓜与枯萎病菌互作的SSH-cDNA文库中,与抗病防御相关基因约占36.3%,初步了解了西瓜与枯萎病菌非亲和互作过程中基因表达信息,这些基因的发现为在分子水平上研究西瓜与枯萎病菌的互作机制以及相关重要基因的克隆与功能分析奠定基础。     

Genetic Diversity Analysis of Faba Bean （Vicia faba L.） Based on EST-SSR Markers

Faba bean (Viciafaba L.), one of the most important legumes in the world, evolved different types of cultivars due to its partial cross-pollination. The development of simple sequence repeat (SSR) markers from expressed sequence tags (EST) provided a useful tool for investigation of its genetic diversity. The purpose of the present study was to investigate the genetic diversity of faba bean from China and Europe using EST-SSR markers. 5 031 faba bean ESTs from the NCBI database were downloaded and assembled into 1148 unigenes. A total of 107 microsatellites in 96 unigenes were identified, indicating that merely 8.36% of sequences contained SSRs. The most abundant SSR within faba bean was tri-nucleotide repeat motif, and among all the tri-nucleotide repeats, the motif AAG/CTT was the most abundant type. Based on these results, 11 EST-SSR markers were used to assess the genetic diversity of 29 faba bean cultivars from China and Europe with two to three alleles per locus. The polymorphism information content value ranged from 0.0644 to 0.4278 with an average of 0.2919. Principal coordinate analysis (PCA) and phylogenetic clustering based on these 11 EST-SSR markers distinguished these cultivars into different groups. The results indicated that faba bean in China had a narrow genetic basis, and the additional sources of genetic cultivars/accessions should be introduced to enhance the genetic variability. The results of this study proved that the EST-SSR marker is very effective in evaluation of faba bean germplasm.     

黄籽甘蓝型油菜核心种质的 SSR 标记分析

核心种质筛选是植物遗传资源研究和利用的便捷途径,利于种质资源杂种优势利用。遗传多样性分析有利于最优亲本组合的鉴定,以期能够产生遗传变异最大的后代群体和促进不同资源的有利基因渗透到栽培品种。该研究通过表型数据分析表明,初选核心种质能够有效地代表参试群体的遗传多样性,利用20对 SSR 标记对20份黄籽甘蓝型油菜的核心种质进行了遗传多样性分析,共检测出128个等位基因,每对引物在不同材料之间的等位基因数在4～11之间,平均位点为6?40个,多态信息量 PIC 值在0?81～0?92之间,通过 UPGMA 法,核心种质的遗传相似系数介于0?17～0?61之间,说明黄籽甘蓝型油菜核心种质具有较丰富的遗传多样性。该研究为甘蓝型黄籽油菜基因资源的挖掘和黄籽杂交育种的利用提供了理论基础。     

甘蓝EST资源的SSR信息分析

为了开发甘蓝EST-SSR功能性标记,从NCBI公共数据库检索到63201条甘蓝ESTs,通过前处理和聚类去冗余后得到全长为14828.60 kb的无冗余ESTs 23306条.在这些序列中搜索出3085个SSRs,分布于2616条ESTs中,出现频率是13.24%,与甘蓝开花过程中相关的EST-SSRs出现的频率为6.97%.这些EST-SSRs的平均长度为23.11 bp,平均分布频率是1/4.81 kb.在1～6核苷酸重复的基元中,二核苷酸重复和三核苷酸重复是主要类型,二者出现的频率基本相近,占总SSR的79.09%.AG/CT和AAG/CTT是二、三核苷酸中的优势重复类型,分别占二、三核苷酸重复的79%和34%,对这些含SSR的ESTs进行BLASTx同源性比较分析,发现2616条EST-SSRs中1981条在数据库中可以找到同源物,占EST-SSRs总数的75.73%,功能已知的蛋白质中拟南芥来源的EST-SSRs所占比例最大,为66.02%,同时针对与甘蓝开花相关的EST-SSRs进行功能分析.找到同源物的1981条EST通过GOA进行功能分类,有987条可划分为生物过程、分子功能和细胞成分3大功能类群,其中与生物代谢相关的EST-SSRs数量最多,为263条,994条未被功能注释.     

利用SSR标记对不同类型抗虫棉品种的遗传多样性分析

以97014,BR—S-10和sGK321等14份不同类型的抗虫棉花品种（系沩试验材料,利用SSR分子标记技术,对这些棉花品种（系）的遗传多样性进行了研究．结果表明,从126对SSR引物筛选出的22对引物均能在14份抗虫棉品种（系）中产生明显的扩增差异带,共检测出97个等位基因位点,其中多态性位点69个,多态性比率达71．1％．引物等位位点数在2～7个,平均每对引物为4．4个．利用Jaccard遗传相似系数计算了14份抗虫棉品种（系）的SSR数据的距离矩阵,按UPGMA方法进行聚类,发现14个品种（系）间的遗传距离在0．035～1．056．聚类分析表明,14份棉花品种（系）可分为2大类4亚类,其中,第1大类是以转基因的抗虫棉为主,第Ⅱ大类包括3个品种（系）,分别是中棉所的ISA4ne,BR—S-10和湖南农业大学的97014,这3个品种都为无蜜腺的形态抗虫棉品种,故较早的聚为一类．本研究表明,用SSR分子标记技术分析棉花不同品种间的遗传多样性是町靠的,揭示了抗虫棉花品种种质资源的多样性,大多数品种的遗传基础比较狭窄．     

SSR分子标记在糯高粱种质资源遗传多样性分析中的应用

为了阐明糯高粱种质资源之间的亲缘关系,用25对SSR引物评价了29份糯高粱种质资源。结果显示,25对引物共检测出59个等位基因,每对引物检测到2.28个等位基因,平均有效等位基因为1.81个,引物位点的多态信息量变幅为0.17~0.62,平均为0.34。29份糯高粱种质资源的遗传相似系数范围为0.20~0.95,平均为0.60,UPGMA方法将29份糯高粱品种在遗传相似系数0.48处聚为2大类,其中不同地理来源的品种被聚在同一亚类,农艺性状近似的品种被聚在同一亚类。表明糯高粱品种的亲缘关系与地理来源关系不大,其种质资源具有较为丰富的遗传多样性。