棉铃虫中肠特异性结合蛋白ABCC1对Cry1Ac毒力的影响

【目的】 研究棉铃虫（Helicoverpa armigera）中肠蛋白ABCC1（HaABCC1）与Cry1Ac的结合特性及对Cry1Ac毒力的影响,明确HaABCC1在Cry1Ac杀虫机制中的作用。【方法】 分析HaABCC1基因序列,设计引物,通过原核表达得到HaABCC1两个跨膜区片段的蛋白,与Cry1Ac进行Ligand blot试验,验证其与Cry1Ac的体外结合特性;利用RNAi技术干扰棉铃虫幼虫的HaABCC1,在3龄幼虫腹部注射siABCC1,比较HaABCC1的表达量及Cry1Ac处理后棉铃虫死亡率的变化;通过细胞转染将ABCC1导入Sf9细胞系中,确定pAc-ABCC1重组质粒转入Sf9细胞后,用细胞生物测定的方法比较Cry1Ac处理后细胞死亡率的变化;比较敏感品系（96S）和Cry1Ac抗性品系（BtR）棉铃虫的HaABCC1基因全长序列,并通过荧光定量RT-PCR检测HaABCC1在抗、感棉铃虫中的表达量。【结果】 HaABCC1跨膜区TMD1和TMD2在Escherichia coli BL21（DE3）感受态细胞中成功表达,两个HaABCC1跨膜区片段蛋白均能与活化的Cry1Ac在体外结合;棉铃虫注射siABCC1后,HaABCC1的表达量显著下降,与未注射的棉铃虫、注射DEPC水和siEGFP的棉铃虫相比,用活化的Cry1Ac蛋白处理HaABCC1被干扰的棉铃虫,其幼虫死亡率显著降低,表明棉铃虫幼虫的HaABCC1被干扰后,能显著降低Cry1Ac对棉铃虫的毒力;用活化的Cry1Ac蛋白处理成功转入HaABCC1的Sf9细胞,与对照Sf9细胞相比,细胞的死亡率明显上升,表明将HaABCC1导入Sf9后能显著提高Cry1Ac处理后的细胞死亡率;抗性品系（BtR）与敏感品系（96S）棉铃虫的HaABCC1氨基酸序列没有差别,但抗性品系BtR棉铃虫HaABCC1的表达量显著降低。【结论】 HaABCC1是Cry1Ac的特异性结合蛋白,可能是Cry1Ac的功能受体蛋白,并可能参与对Cry1Ac的抗性机制。     

抗性选育对小菜蛾体内解毒酶和消化酶活性的影响

测定小菜蛾Cry1Ac抗性品系(Cry1Ac–R)、Cry1Ac敏感品系(Cry1Ac–S)3种解毒酶的活性。结果表明,小菜蛾抗性品系的谷胱甘肽转移酶活性高于敏感品系;敏感品系的羧酸酯酶和乙酰胆碱酯酶的活性高于抗性品系,但2品系的解毒酶活性无显著差异。测定小菜蛾Cry1Ac抗性品系、敏感品系及Bt抗性品系(Bt–T2)消化酶活性,结果小菜蛾敏感品系海藻糖酶、蔗糖酶活性均最高,Bt抗性品系最低,但各品系的2种消化酶活性之间差异不显著;小菜蛾敏感品系蛋白酶活性最高,抗性品系最低,各品系的蛋白酶活性差异极显著。     

棉铃虫5龄幼虫对棉酚和印楝素的味觉适应性行为研究

【目的】研究棉铃虫幼虫对棉酚和印楝素的味觉适应性行为,为棉铃虫的防治提供参考依据。【方法】采用叶碟法和味觉感受器切除法进行不同取食条件下棉铃虫5龄幼虫的取食选择行为试验。供试化合物为处理后终浓度为2mmol／L的棉酚和印楝素。【结果】正常人工饲料饲养的棉铃虫幼虫对棉酚和印楝素均十分敏感,取食对照叶碟量显著高于处理叶碟（P〈0．05）;切除中栓锥感受器后棉铃虫幼虫取食含棉酚或含印楝素的叶蝶量与正常叶碟有显著差异（P〈0．05）,而切除侧栓锥感受器后棉铃虫幼虫取食含棉酚或含印楝素的叶蝶量与正常叶碟差异不显著（P〉0．05）;以含有低浓度取食抑制素的人工饲料饲养的棉铃虫幼虫对棉酚和印楝素不敏感,取食对照叶碟量与处理叶碟无显著差异（P〉0．05）。【结论】棉酚和印楝素是棉铃虫幼虫的取食抑制素,侧栓锥感受器中含有对棉酚和印楝素敏感的味觉神经元,不同取食经历的棉铃虫幼虫对棉酚和印楝素具有行为适应性。     

亚洲玉米螟miR-1a-5p表达与Cry1Ab蛋白敏感性的关系

【目的】探索亚洲玉米螟miR-1a-5p表达与Cry1Ab蛋白敏感性的关系,为揭示miRNA在昆虫Bt抗性产生过程中的作用提供依据。【方法】通过荧光定量PCR,研究亚洲玉米螟Cry1Ab抗性品系(ACB-AbR)和Bt敏感品系(ACB-BtS)表皮及中肠组织中miR-1a-5p的表达差异。以Sf9细胞为研究对象,通过转染miR-1a-5p促进剂(Mimics)或抑制剂(Inhibitor)改变细胞中miR-1a-5p的表达量,测定不同处理细胞对Cry1Ab蛋白的敏感性,探讨miR-1a-5p表达量改变后Sf9细胞对Cry1Ab蛋白的敏感性变化。通过荧光素酶报告试验,研究miR-1a-5p对潜在靶标基因Unigene12370_All的调控作用。【结果】ACB-AbR表皮组织中miR-1a-5p的表达量显著高于ACB-BtS表皮组织,ACB-AbR中肠组织中miR-1a-5p的表达量显著低于ACB-BtS中肠组织;ACB-AbR和ACB-BtS幼虫表皮组织中miR-1a-5p的表达量均显著高于其中肠组织。Sf9细胞miR-1a-5p表达量升高导致Sf9细胞对Cry1Ab蛋白的敏感性增强,反之亦然。荧光素酶报告试验结果提示,miR-1a-5p与靶标基因Unigene12370_All可以结合。【结论】亚洲玉米螟miR-1a-5p表达量的变化与其对Cry1Ab蛋白敏感性的改变有关。     

基于三级营养传递Cry1Ac蛋白对普通草蛉酶活力及生长发育的影响

【目的】研究Cry1Ac蛋白通过棉花、棉蚜的传递对普通草蛉酶活性及生长发育的影响,为转Bt基因棉花的安全性评价提供参考和依据。【方法】采用ELISA方法,检测Bt棉、取食Bt棉的棉蚜和捕食棉蚜普通草蛉体内Bt杀虫蛋白含量;通过酶活力测定普通草蛉幼虫取食Bt棉花上棉蚜后其体内的类胰蛋白酶、类胰凝乳蛋白酶和氨肽酶的酶活性;室内生物测定普通草蛉取食Bt棉花上的棉蚜后对其生长发育的影响。【结果】Cry1Ac杀虫蛋白在棉叶中的表达量为788.76 ng/g,远高于棉蚜体内的2.35 ng/g,取食Bt棉花上棉蚜的普通草蛉3龄幼虫体内并未检测到Bt杀虫蛋白;通过三级营养传递的Cry1Ac蛋白对普通草蛉酶活力影响甚微。【结论】棉蚜取食Bt棉花后体内仅能累计微量Cry1Ac蛋白;普通草蛉取食Bt棉花上的棉蚜后,对其体内三种酶活性和生长发育均没有负面影响。     

不同Bt蛋白对捕食性天敌大草蛉的生态安全性评价

【目的】明确转基因棉花中表达Cry1Ac、Cry1F和Cry2Ab蛋白对我国Bt棉田中主要捕食性天敌大草蛉（Chrysopa pallens）的潜在影响。【方法】通过在大草蛉人工饲料中添加高剂量Bt蛋白的方法,评价Cry1Ac、Cry1F和Cry2Ab蛋白对大草蛉重要生命表参数（4龄幼虫体重、幼虫发育历期、化蛹率、蛹重、蛹发育历期、羽化率、成虫体重和产卵量）的影响,以不添加杀虫物质的大草蛉纯人工饲料作为阴性对照,以添加PA（砷酸二氢钾,KH₂AsO₄）的大草蛉人工饲料作为阳性对照;同时,利用双抗体夹心酶联免疫吸附法（DAS-ELISA）测定取食Bt蛋白处理饲料后,大草蛉幼虫、蛹以及成虫体内的Bt蛋白浓度;利用ELISA法和敏感昆虫生物测定法,检测新鲜饲料和在试验环境条件下暴露2 d的处理饲料中Bt蛋白的稳定性和生物活性;此外,利用酶活性测定的方法,比较取食空白对照饲料、Bt蛋白处理饲料或PA处理饲料后大草蛉体内主要消化酶（总蛋白酶、类胰蛋白酶、类凝乳蛋白酶和氨肽酶）、解毒酶（α-乙酸萘酯酯酶、羧酸酯酶、谷胱甘肽-S-转移酶、乙酰胆碱酯酶、酸性磷酸酶和碱性磷酸酶）和保护酶（超氧化物歧化酶、过氧化物酶和过氧化氢酶）的活性。【结果】生命表评价结果表明,在大草蛉人工饲料中添加高浓度单独Bt蛋白或Bt蛋白混合物,对大草蛉4龄幼虫体重、幼虫发育历期、化蛹率、蛹重、蛹发育历期、羽化率、成虫体重和产卵量无显著性不利影响,但饲料中添加PA却能够使大草蛉幼虫和蛹发育历期极显著延长,4龄幼虫体重、化蛹率、蛹重、羽化率、成虫体重和产卵量极显著降低;大草蛉体内Bt蛋白浓度测定结果显示,大草蛉取食Bt蛋白处理饲料后,其幼虫、蛹及成虫体内均含有一定量的Bt蛋白;ELISA和敏感昆虫生物测定结果表明,新鲜准备和在试验环境条件下暴露2 d的Bt蛋白处理饲料,均含有高剂量且具有生物活性的Bt蛋白,因此,大草蛉在整个生物测定过程中接触到的均为高浓度的、具有生物活性的Bt蛋白;此外,取食Bt蛋白处理饲料,对大草蛉幼虫和成虫体内主要消化酶、解毒酶和保护酶活性无显著性影响,但取食PA处理饲料能使大草蛉幼虫和成虫体内氨肽酶活性极显著降低,其他所测消化酶、解毒酶和保护酶活性显著升高。【结论】大草蛉对3种供试Bt蛋白（Cry1Ac、Cry1F和Cry2Ab）不敏感,取食这3种Bt蛋白对大草蛉生长发育及其体内主要消化酶、解毒酶和保护酶活性没有显著不良影响,本研究所建立的生物评价体系还可用于评价其他新型转基因抗虫植物中表达杀虫蛋白对大草蛉的生态安全性。     

棉铃虫中肠Cry1A受体蛋白氨肽酶N1在Tn细胞系的表达

 【目的】将棉铃虫中肠Bt受体蛋白在真核表达系统中成功表达。【方法】用PCR方法分别扩增出对Cry1Ac毒素敏感和抗性棉铃虫的中肠氨肽酶N1（APN1）基因的去信号肽片段,将其克隆至pUC 19载体,测定核酸序列后,克隆入Bac-to-Bac表达系统中杆状病毒转移载体pFastBacHTB中多角体基因启动子的下游,筛选出重组质粒pFastBacHTB/APN1并转化大肠杆菌DH10Bac,在体内进行重组,经抗性和蓝白斑筛选,获得杆状病毒重组载体Bacmid/APN1。转染粉纹夜蛾（Trichoplusia ni）细胞（Tn-5B1-4）,获得含APN1基因的重组杆状病毒,重组病毒感染Tn细胞后,得到表达的蛋白。【结果】SDS-PAGE分析和点杂交显示,目的基因得到了成功表达。【结论】APN1基因在Tn细胞中成功表达,为今后继续研究其功能和与抗性的关系奠定了基础。     

枯草芽孢杆菌对斜纹夜蛾生长发育及消化酶活性的影响

【目的】本文明确了添食枯草芽孢杆菌对斜纹夜蛾生长发育及中肠消化酶活力的影响。【方法】将枯草芽孢杆菌菌悬液分别配制成单位饲料含菌量分别为6×10~8,6×10~6和6×10~(4 )cfu/g的含菌饲料,以不含菌的人工饲料作为对照(CK)。然后,将待测幼虫在初生阶段从正常饮食中转移到不同含菌量饮食中,连续喂食直至化蛹,并对斜纹夜蛾幼虫消化酶活力等指标进行测定统计。【结果】斜纹夜蛾幼虫在取食不同含菌量人工饲料下均能正常完成世代发育,但对其世代总历期有一定延滞效应;取食单位饲料含菌量为6×10~6cfu/g人工饲料幼虫相对取食率虽显著低于其余各组,但其食物转化率和食物利用率却显著高于其余各组;取食单位饲料含菌量为6×10~8cfu/g人工饲料幼虫相对生长率和近似消化率显著低于对照(CK)组,但其余各组之间差异不显著;此外,四龄幼虫蔗糖酶活力与其取食单位饲料含菌量成正比;取食单位饲料含菌量为6×10~6cfu/g人工饲料幼虫化蛹率以及蛹羽化率最高,虫/蛹重最重,单雌产卵量也最大。【结论】单位饲料含菌量为6×10~6cfu/g人工饲料对斜纹夜蛾幼虫具有较好的取食适合度。     

抗虫辣椒BLTY品系对斜纹夜蛾肠道细菌多样性的影响

【目的】BLTY品系辣椒叶片对1～3龄斜纹夜蛾幼虫有较强的胃毒性,本研究旨在进一步探明这种胃毒性与肠道细菌群落结构及多样性的相关性。【方法】利用Illumination HiSeq技术对斜纹夜蛾3龄幼虫取食BLTY品系辣椒叶片、FXBX辣椒叶片(无毒性)及人工饲料后肠道细菌16S rRNA的特异性区域进行测序,应用Usearch和R语言软件分析其肠道细菌群落结构、物种丰度及多样性的差异。【结果】厚壁菌门(Firmicutes)和变形菌门(Proteobacteria)为不同处理下斜纹夜蛾3龄幼虫肠道细菌的共有优势菌门。相较于取食无毒性的FXBX辣椒叶片和人工饲料,取食BLTY品系辣椒叶片的肠道菌群Alpha多样性指数显著上升,菌群组成和结构差异显著。在门水平上,变形菌门、放线菌门(Actinobacteria)和拟杆菌门(Bacteroidetes)相对丰度升高;在属水平上,有益菌肠球菌属(Enterococcus)相对丰度降低,而致病菌沙门氏菌属(Salmonella)、布鲁氏菌属(Brucella)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)相对丰度显著升高。KEGG代谢差异...     

新疆棉区棉铃虫对Bt毒蛋白(Cry1Ac蛋白)敏感基线的测定

[目的]测定新疆棉区棉铃虫对Bt毒蛋白(Cry1Ac蛋白)的敏感基线.[方法]实验采用梯度浓度测定法对新疆8个主要常规棉区的棉铃虫进行敏感性测定.[结果]测得新疆棉区棉铃虫对Bt毒蛋白(Cry1Ac)的敏感基线:平均致死中浓度(LC50)为0.033 μg/mL,范围为0.022～0.048 μg/mL.LC90的值为0.899 μg/mL,范围为0.526～1.333 μg/mL.抗性识别浓度LC99的值为1.020 μg/mL.采集的所有种群都对Bt毒蛋白(Cry1Ac)具有高度的敏感性.95;置信区间方差分析表明,新疆主要常规棉区棉铃虫对Bt毒蛋白(Cry1Ac)的敏感度差异不显著.[结论]实验所得到的数据可作为今后新疆棉区棉铃虫抗性监测的基准.     

Characterization and functional analysis of β-1,3-galactosyltransferase involved in Cry1Ac resistance from Helicoverpa armigera(Hübner)

Carbohydrate chains are the principal antigens by which Bacillus thuringiensis(Bt) identify receptor proteins. The interaction between the antigen and Bt causes a pore in the membrane of midgut epithelial cells of insects. Receptor proteins, such as aminopeptidase N and alkaline phosphatase, are glycoproteins. Cadherin is another cell surface receptor protein which has potential glycosylation sites. Glycosyltransferase is very important for the synthesis and modification of receptor proteins. It can indirectly influence the function of Bt. The 1 950 bp full-length c DNA encoding β-1,3-galactosyltransferase was cloned from the the midgut of Helicoverpa armigera by degenerative PCR combined with RACE techniques(GAL-Harm, Gen Bank accession no.: GQ904195.1) with two potential N-glycosylation sites(157NNTI160 and 272NKTL275). Protein sequence alignments revealed that H. armigera β-1,3-galactosyltransferase shared high identity with β-1,3-galactosyltransferase in other insect species. The expression level of the β-1,3-galactosyltransferase gene in Cry1Ac-resistant H. armigera larvae was 9.2-fold higher than that in susceptible strain. The function of β-1,3-galactosyltransferase was investigated using RNAi technique. The result showed Cry1 Ac enhanced the toxicity against the si RNA-treated larvae compared with non-si RNA-treated ones, which indicated β-1,3-galactosyltransferase played an important role for the insecticidal toxicity of Cry1 Ac in H. armigera.     

Toxicity and binding analyses of Bacillus thuringiensis toxin Vip3A in Cry1Ac-resistant and-susceptible strains of Helicoverpa armigera(Hübner)

The Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein, Vip3 A, represents a new family of Bt toxin and is currently applied to commercial transgenic cotton. To determine whether the Cry1Ac-resistant Helicoverpa armigera is cross-resistant to Vip3 Aa protein, insecticidal activities, proteolytic activations and binding properties of Vip3 Aa toxin were investigated using Cry1Ac-susceptible(96S) and Cry1Ac-resistant H. armigera strain(Cry1Ac-R). The toxicity of Vip3 Aa in Cry1Ac-R slightly reduced compared with 96 S, the resistance ratio was only 1.7-fold. The digestion rate of full-length Vip3 Aa by gut juice extracts from 96 S was little faster than that from Cry1Ac-R. Surface plasmon resonance(SPR) showed there was no significant difference between the binding affinity of Vip3 Aa and BBMVs between 96 S and Cry1Ac-R strains, and there was no significant competitive binding between Vip3 Aa and Cry1 Ac in susceptible or resistant strains. So there had little cross-resistance between Vip3 Aa and Cry1 Ac,Vip3A+Cry proteins maybe the suitable pyramid strategy to control H. armigera in China in the future.     

棉铃虫磷脂酰乙醇胺结合蛋白的克隆及表达分析

【目的】克隆获得棉铃虫（Helicoverpa armigera）磷脂酰乙醇胺结合蛋白(phosphatidylethanolamine binding protein,PEBP)的cDNA序列,分析HaPEBP在棉铃虫体内的表达规律,检测2-十三烷酮处理条件下棉铃虫体内HaPEBP的变化情况,为进一步明确棉铃虫PEBP的功能和选择该基因作为调控棉铃虫种群数量的分子靶标提供依据。【方法】利用RACE技术从棉铃虫6龄幼虫的中肠组织中扩增得到HaPEBP的cDNA序列,并对其氨基酸序列和蛋白结构进行分析。将HaPEBP的ORF序列连接至pET32a载体并转化大肠杆菌BL21(DE3),IPTG诱导后检测目的蛋白的表达形式,并通过镍柱的亲和层析纯化融合蛋白。最后通过实时荧光定量PCR检测棉铃虫幼虫不同时期和6龄幼虫不同组织中HaPEBP的表达规律,以及2-十三烷酮处理棉铃虫6龄幼虫后中肠内HaPEBP的变化规律。【结果】获得的HaPEBP cDNA序列长760 bp,其中ORF为588 bp,编码195个氨基酸,蛋白质分子量和等电点分别为21.76 kD和5.93。氨基酸序列分析表明HaPEBP无信号肽、跨膜结构域和二硫键,是一个由4个α螺旋和9个β折叠片组成的胞质单体蛋白。将BL21(DE3)-pET32a-HaPEBP重组菌用1 mmol·L^-1的IPTG在37℃条件下诱导4 h,约40 kD的融合蛋白His-HaPEBP能以可溶的形式存在于重组菌中。按照同样的方法诱导1 L的重组菌,将超声处理后的上清液与Ni-NTA柱结合,进行咪唑缓冲液梯度洗涤,200 mmol·L^-1的咪唑洗涤两次后得到约40 kD的单一蛋白,与融合蛋白的大小一致。将此流出液超滤浓缩,获得183.3 ng·μl^-1的融合蛋白,能被抗His-Tag的单克隆抗体识别发生免疫反应。HaPEBP在棉铃虫幼虫的1-6龄期和预蛹期均表达,且6龄幼虫的表达量最高。该基因在6龄幼虫的脂肪体、中肠、头部和体壁中也均有表达,且脂肪体内的表达量最高。不同浓度的2-十三烷酮处理后,棉铃虫6龄幼虫中肠内HaPEBP的表达量均有所降低;低浓度(2.5和5 mg·g^-1)在6 h就能降低HaPEBP的表达量,其mRNA含量随着时间的延长逐渐增加;而高浓度(10和15 mg·g^-1)在12 h才会降低HaPEBP的表达量,其mRNA含量随着时间的延长先下降后上升。【结论】克隆分析了HaPEBP,利用大肠杆菌系统表达出可溶的融合蛋白His-HaPEBP,并通过镍柱-咪唑纯化法得到了高纯度的融合蛋白,时空表达分析显示HaPEBP在棉铃虫6龄幼虫和脂肪体中表达量最高,2-十三烷酮处理6龄幼虫后中肠内HaPEBP的表达量显著降低。     

核型多角体病毒p74基因在苏云金芽胞杆菌中的表达

 【目的】利用核型多角体病毒（NPV）的p74基因与苏云金芽胞杆菌（Bt）的cry1Ac基因构建融合基因cry1Ac-p74,构建具有广谱杀虫作用的工程菌。【方法】从Bt4.0718菌株中克隆cry1Ac基因及其终止子cry1Act,从苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒（AcMNPV）中克隆p74基因,以pMD-T作为大肠杆菌亚克隆载体,分别构建含有目的基因片段的T载体pT1Ac、pTp74、pT1Act以及中间载体pT1Act、pTp74Act,获得携带有目的融合基因cry1Ac-p74的表达载体pH1Acp74;该表达载体电转化至Bt无晶体突变株XBU001,得到目的重组菌株XBU-H1Acp74。【结果】XBU-H1Acp74可表达130 kD的Cry1Ac蛋白和50 kD的P74蛋白,生测显示P74蛋白可以协同Cry1Ac的杀虫效果。【结论】本研究成功构建了cry1Ac基因与p74基因融合的Bt工程菌,为进一步研究和构建新型生物杀虫剂的工程菌株,研制出高效、广谱、安全的杀虫剂提供了新的技术途径。     

小菜蛾碱性磷酸酯酶受体表达与分子模拟

【目的】利用原核表达小菜蛾(Plutella xyllostella)中肠膜结合碱性磷酸酯酶(membrane-bound alkaline phosphatase,mALP)并经Ligand blot验证其具有与Cry1Ac毒素结合的能力;通过同源建模和分子对接研究Cry1Ac-mALP的结合模式,预测毒素和受体结合区域及关键氨基酸位点(热点残基),为了解毒素-受体互作机制及分子改造增强Cry毒素活性的研究打下基础。【方法】针对小菜蛾mALP全长设计引物,并以小菜蛾c DNA为模板扩增mALP基因,双酶切后用T4连接酶连接至pET-26b原核表达载体,将构建的pET-26b-mALP载体转化Trans1-T1克隆感受态,挑取克隆并提取质粒后进行PCR、双酶切和测序验证,将验证无误的重组质粒转化E.coliBL21(DE3)表达感受态细胞,进行诱导表达。将诱导表达后的mALP转至PVDF膜上,通过Western blot和Ligand blot分别验证mALP是否成功表达以及是否具有与Cry1Ac毒素结合的能力。对mALP进行同源建模、分子动力学模拟以及模型评价,获得的mALP最佳三维结构与Cry1Ac毒素利用Patch DOCK和Fire Dock程序进行分子对接试验,对确定的最佳毒素-受体复合物进行结合区域和结合氨基酸位点分析,并通过计算机辅助的丙氨酸突变扫描试验确定毒素和受体参与的关键氨基酸残基。【结果】扩增出小菜蛾mALP基因并克隆至pET-26b原核表达载体,转化E.coli BL21(DE3)表达感受态后挑取阳性克隆提取质粒后进行PCR、双酶切和测序均显示构建正确。通过原核表达和Western blot验证成功表达了mALP蛋白,并经Ligand blot试验证实了原核表达的mALP具有和Cry1Ac毒素结合的能力。利用同源建模成功获得了mALP的三维结构,通过Patch DOCK和Fire Dock分子对接程序,获得毒素和受体的对接复合物,通过溶剂可及表面积变化计算和Ligplot分析,确定毒素结构域Ⅱ和结构域Ⅲ均参与了受体结合,并且毒素和受体均以疏水结合和氢键结合模式参与结合,最后通过热点残基预测发现Cry1Ac毒素和mALP中分别有3个氨基酸残基(376ASN、443SER和486SER)和4个氨基酸残基(452ARG、499THR、502TYR和513TYR)是参与互作的关键氨基酸位点。【结论】经原核表达的小菜蛾mALP同样具有与Cry1Ac毒素结合的能力,并利用分子模拟技术预测了小菜蛾mALP三维结构及与Cry1Ac毒素结合模式。     

斜纹夜蛾P450基因CYP4M14和CYP4S9的克隆与mRNA表达水平研究

【目的】研究斜纹夜蛾对溴氰菊酯抗性的分子机制。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆CYP4M14和CYP4S9 cDNA全长序列,采用实时定量PCR技术分析这两个基因在斜纹夜蛾抗、感品系6龄幼虫中肠和脂肪体中mRNA 的表达水平。【结果】克隆得到斜纹夜蛾细胞色素P450基因CYP4M14和CYP4S9的cDNA全长序列,序列分析表明,CYP4M14编码区长1 512 bp,编码 504个氨基酸;CYP4S9编码区长1 473 bp,编码 491个氨基酸;实时定量PCR分析结果表明,在中肠中,CYP4M14和CYP4S9在抗性品系中的mRNA表达量分别是敏感品系中的4.85和18.63倍;在脂肪体中分别是在敏感品系中的75.14和6.07倍。【结论】斜纹夜蛾对溴氰菊酯的高水平抗性可能与CYP4M14和CYP4S9的过量表达有关。